鄭俏然 張 恒 李文峰 陶 雯 周 鳳 高曉旭

(1.長江師范學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，重慶 408100；2.雅安職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)檢驗系，四川 雅安 625014)

美味牛肝菌又稱白牛肝菌、大腳菌，為擔(dān)子菌亞門層菌綱菌目牛肝菌科大型菌根食用真菌[1]。菌蓋呈扁半球型或稍平展，在重慶彭水一帶生長較多，因肉厚細(xì)軟味道鮮美，深受當(dāng)?shù)匕傩障矏?。研究發(fā)現(xiàn)，美味牛肝菌液體培養(yǎng)菌絲體和野生子實體均含有蛋白質(zhì)、多糖、氨基酸、脂肪、纖維素、礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分[2-3]，具有增強(qiáng)免疫[4]、抗氧化[5]、抗腫瘤[6]、降血脂[7]等作用，經(jīng)濟(jì)價值極高。

肝臟是人體最大的腺體器官，在藥物和有毒化學(xué)物質(zhì)代謝中發(fā)揮著重要的作用。肝臟極易受有毒化學(xué)物質(zhì)損傷，造成肝臟代謝功能紊亂。目前肝損傷已成為了尤為突出的全球性健康問題[8-10]。多糖是牛肝菌所含的活性物質(zhì)之一，具有明顯的抗S-180腫瘤[11]、抗氧化[12]、保護(hù)腎臟[13]與肝臟[14]等功效。筆者團(tuán)隊[15]前期研究發(fā)現(xiàn)，美味牛肝菌多糖具有較強(qiáng)的體外抗氧化能力，但目前有關(guān)美味牛肝菌多糖對CCl4導(dǎo)致的急性肝損傷的保護(hù)作用還未見報道。

四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)是急性肝損傷造模的經(jīng)典化學(xué)物質(zhì)，會直接損害肝細(xì)胞從而引起一些特異變化。試驗擬采用CCl4建立急性肝損傷小鼠模型，從體內(nèi)抗氧化和病理切片方面討論美味牛肝菌多糖對急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用，旨在為開發(fā)保肝解毒的保健食品原料提供理論和試驗依據(jù)，同時為武陵山區(qū)美味牛肝菌的精深加工提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

美味牛肝菌：重慶彭水武陵山區(qū)；

雄性昆明小鼠：清潔級，許可證號SCXK(川)2013-24，體重(20±2)g，成都達(dá)碩實驗動物有限公司；

谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙二醛(MDA)、還原型谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒：南京建成生物工程研究所；

四氯化碳：分析純，成都市科龍化工試劑廠；

AB-8大孔樹脂：上海銳谷生物科技有限公司；

DEAE-52纖維素：華中海威基因科技有限公司；

基礎(chǔ)飼料：成都達(dá)碩實驗動物有限公司；

其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

冷凍離心機(jī)：Heraeus MultifugeX3R型，美國Thermo Fisher Scientific公司；

高速萬能粉碎機(jī)：FW80型，天津市泰斯特儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：XD-52AA型，上海賢德實驗儀器有限公司；

全波長掃描式多功能讀數(shù)儀：Varioskan Flash型，芬蘭Thermo Scientific公司；

超聲波清洗機(jī)：SB-5200 DTDI型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

全自動新型熱風(fēng)干燥箱：ZFD-5040型，上海智成分析儀器制造有限公司；

光學(xué)顯微鏡：Nikon Eclipse E100型，日本尼康公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 美味牛肝菌多糖的制備與測定

(1)美味牛肝菌多糖(Boletusedulispolysa-ccharides，BEP)的制備：將干燥的美味牛肝菌用超微植物粉碎機(jī)粉碎，60目過篩，準(zhǔn)確稱量1.00 g美味牛肝菌粉末，加入90 ℃熱水30 mL，充分?jǐn)嚢?，置?00 W超聲波清洗機(jī)中超聲處理20 min，然后90 ℃水浴浸提1 h。浸提后過濾除渣，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原體積的1/3，加入4倍體積95%乙醇醇沉，靜置過夜，4 000 r/min離心15 min，取下層沉淀，依次用兩次無水乙醇、一次乙醚、一次丙酮洗滌，4 000 r/min離心15 min，取下層沉淀自然風(fēng)干，即為美味牛肝菌粗多糖。牛肝菌粗多糖經(jīng)Sevage法脫除蛋白，再采用AB-8大孔樹脂脫色，而后通過DEAE-52纖維素離子交換柱，采用NaCl溶液梯度洗脫分離，得牛肝菌純化多糖。

(2)多糖含量測定：采用苯酚—硫酸法[16]，以葡萄糖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(曲線方程y=0.017 9x+0.104 1，R2=0.990 0)。經(jīng)測定，美味牛肝菌多糖提取率為6.5%，多糖含量約為90.2%。

1.3.2 動物飼養(yǎng)及模型建立

(1)飼養(yǎng)條件：小鼠喂養(yǎng)1周，待適應(yīng)環(huán)境后，隨機(jī)分為5組，各組小鼠在室溫22 ℃，自然光照條件下常規(guī)飼養(yǎng)。試驗期間，BEP低、中、高劑量組按每日灌胃0.5 mL分別給予200，400，800 mg/(kg BW·d)牛肝菌多糖，空白組和模型組給予等體積0.9%的生理鹽水，連續(xù)30 d。各組小鼠自由攝食、飲水。每周稱重一次，以調(diào)整灌胃濃度。

(2)CCl4肝損傷模型的建立：末次灌胃1 h后，以10 mL/kg 劑量，空白組小鼠腹腔注射花生油，其他各組腹腔注射體積分?jǐn)?shù)0.2%CCl4花生油溶液，禁食不禁水。造模16 h 后稱重，眼球取血后以3 000 r/min離心15 min分離血清備用。脫臼處死小鼠后，立即解剖并取出肝臟，用生理鹽水沖洗殘血后，濾紙濾干、稱重并計算肝臟指數(shù)(肝臟質(zhì)量與小鼠體重的質(zhì)量百分比)[17]。

1.3.3 血清指標(biāo)的測定 血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性按照試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.3.4 肝臟指標(biāo)的測定 取適量小鼠肝臟，按1∶9(g/mL)比例加入生理鹽水，充分研磨制成質(zhì)量濃度10%的肝臟勻漿，3 000 r/min離心20 min，取上清液，按照試劑盒說明書測定超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、谷胱甘肽過氧化物酶、丙二醛含量。

1.3.5 肝臟病理組織學(xué)觀察 將各組小鼠的新鮮肝臟切成小方塊，浸入10%福爾馬林固定，經(jīng)石蠟包埋、切片，常規(guī)HE染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 對CCl4急性肝損傷小鼠體重、肝重及肝臟指數(shù)的影響

美味牛肝菌多糖對CCl4急性肝損傷小鼠體重、肝重及肝臟指數(shù)的影響見表1。

表1 BEP對CCl4急性肝損傷小鼠體重與肝指數(shù)的影響

Table 1 Effect of BEP on body weight and liver weight indexes in mice with liver injury(n=10)

組別終體重/g肝臟重量/g肝臟指數(shù)/%空白組 38.81±1.631.18±0.10 3.02±0.21 模型組 38.19±2.921.38±0.16##3.55±0.28###低劑量組38.25±1.151.28±0.053.34±0.15?中劑量組37.13±3.851.28±0.203.29±0.24??高劑量組37.80±2.221.21±0.07??3.29±0.14??

? 相對于空白組，##.P<0.01，###.P<0.001；相對于模型組，*.P<0.05，**.P<0.01。

由表1可以看出，BEP對小鼠體重?zé)o顯著性影響。模型組小鼠肝重及肝指數(shù)均顯著高于空白對照組(P<0.01)，說明CCl4會導(dǎo)致小鼠肝臟受損，肝臟腫大，建模成功；與模型組相比，高劑量BEP顯著降低急性肝損傷小鼠的肝重(P<0.01)，各劑量組BEP均顯著降低了小鼠的肝臟指數(shù)(低劑量組P<0.05，中、高劑量組P<0.01)，由此說明，一定劑量的BEP能有效抑制CCl4所致的小鼠肝臟腫大。

2.2 對CCl4急性肝損傷小鼠血清AST、ALT的影響

谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)是評價肝臟受損的兩個重要血清生化指標(biāo)。正常情況下，ALT和AST在血清中的含量較低，而當(dāng)肝臟受損時，會有大量ALT和AST釋放入血液，引起血清中這兩種酶的活性明顯提高[18]。如圖1、2所示，模型組小鼠血清中ALT、AST活性顯著高于空白組(P<0.001)，說明造模成功。與模型組相比，低、中劑量組小鼠血清ALT、AST顯著降低(P<0.01)，高劑量組小鼠血清ALT、AST極顯著低于模型組(P<0.001)，表明BEP具有一定的保肝作用。

相對于空白組，###.P<0.001；相對于模型組，**.P<0.01，***.P<0.001

圖1 BEP對 CCl4急性肝損傷小鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的影響

Figure 1 Effect of BEP on the serum aspartate transaminase(AST)levels in mice with liver injury(n=10)

相對于空白組，###.P<0.001；相對于模型組，*.P<0.05，**.P<0.01

圖2 BEP對 CCl4急性肝損傷小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的影響

Figure 2 Effect of BEP on the serum alanine transaminase(ALT)levels in mice with liver injury(n=10)

2.3 對CCl4急性肝損傷小鼠肝臟組織SOD、GSH、GSH-Px活性及MDA含量的影響

如圖3所示，與空白組比較，模型組CCl4造成肝組織的SOD、GSH-Px及GSH活性顯著降低(P<0.01)，而MDA在肝臟堆積(P<0.001)，并進(jìn)一步破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，說明CCl4引起的小鼠肝損傷與氧化應(yīng)激有關(guān)[19]；SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，能有效清除代謝過程中產(chǎn)生的氧自由基，減緩細(xì)胞衰老進(jìn)程，其活性高低可間接反映機(jī)體的抗氧化能力[20]；而MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一，其含量的多少直接反映了細(xì)胞損傷程度[21]。與模型組比較，灌胃BEP各劑量組小鼠肝組織中SOD活性均顯著增強(qiáng)(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.01)，見圖3(a)和(d)；GSH-Px是機(jī)體中廣泛存在的一種含硒酶，同樣具有清除自由基的作用，其活性越高，自由基清除速率越快，如圖3(b)所示，BEP中劑量組和高劑量組肝臟GSH-Px活性顯著高于模型組，而低劑量組與模型組差異不顯著(P>0.05)；灌胃高劑量的BEP能顯著提高小鼠肝臟GSH活性(P<0.01)，見圖3(c)。以上結(jié)果說明，BEP能通過提高肝臟SOD、GSH-Px及GSH活性，有效清除自由基，抑制自由基引起的脂質(zhì)過氧化，延緩小鼠肝臟氧化進(jìn)程，提高肝臟抗氧化能力，從而降低MDA含量，避免肝臟損傷，同時，這種肝臟保護(hù)作用存在一定的劑量效應(yīng)。

2.4 對CCl4急性肝損傷小鼠肝臟組織形態(tài)的影響

HE染色結(jié)果表明，空白組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整、輪廓清晰，細(xì)胞排列整齊，未見細(xì)胞變性壞死及炎癥細(xì)胞浸潤，見圖4(a)；而模型組可以觀察到肝細(xì)胞大片壞死，排列紊亂，細(xì)胞核大小不一，說明造模成功，見圖4(b)；低劑量組和中劑量組出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，但與模型組相比，肝細(xì)胞病變減少，說明一定程度上減輕了肝細(xì)胞損傷程度見圖4(c)和(d)；高劑量組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為完整，炎性細(xì)胞數(shù)量較少，炎性細(xì)胞浸潤程度明顯減輕，見圖4(e)，由此說明，美味牛肝菌多糖可有效保護(hù)肝細(xì)胞抵御CCl4的損害。

相對于空白組，#.P<0.05，##.P<0.01，###.P<0.001；相對于模型組，*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001

圖4 小鼠肝組織切片

3 結(jié)論

研究了美味牛肝菌多糖對四氯化碳急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用。結(jié)果表明：一定劑量的美味牛肝菌多糖能減輕CCl4引起的小鼠肝損傷，降低血清谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性及肝臟丙二醛含量，提高肝臟抗氧化能力，對CCl4所致小鼠肝損傷有保護(hù)作用，其具體的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。