張東鎖，臧 珊，胡勝武，郭 媛

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

油菜是世界上重要的經(jīng)濟作物之一，也是中國最重要的油料作物，含有豐富的油脂及蛋白質(zhì)，是現(xiàn)代重要的食用油和工業(yè)油來源[1]。甘藍型油菜(Brassicanapus, AACC, 2n=38)是由二倍體親本白菜(Brassicarapa, AA, 2n=20)和甘藍(Brassicaoleracea, CC, 2n=18)天然雜交后染色體組加倍得到的異源四倍體物種[2]。甘藍型油菜起源于歐洲，于20世紀30至40年代分別由歐洲和日本引入中國，目前已經(jīng)成為中國油菜的主要栽培類型[3]。甘藍型油菜雜種優(yōu)勢顯著，雜種優(yōu)勢的幅度可以達到30%～60%[4]，雜交育種是油菜新品種選育的主要途徑，育種材料的遺傳變異和種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究對于選擇親本材料，合理選配雜交組合非常關(guān)鍵。目前，多種細胞標記、生物化學(xué)(同工酶)標記和DNA分子標記(SSR、SRAP、AFLP等)等技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于作物遺傳多樣性的研究[5]，然而，在育種的實施過程中，選育的品種往往要具備很多的符合生產(chǎn)實踐的重要性狀，表型性狀的鑒定和描述仍然是檢驗遺傳變異最基本的方法和途徑[6]。全面分析種質(zhì)資源的遺傳多樣性模式，不僅需要從基因?qū)用嫣接懫涠鄻有裕瑫r也需要表型多樣性的數(shù)據(jù)[7]。前人已經(jīng)對小麥[8]、大麥[9]、番茄[10]、茶樹[11]等作物的表型多樣性進行了研究，并在揭示表型變異規(guī)律和分類方面取得了有價值的結(jié)果。對于油菜育種者而言，育種過程中的農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀至關(guān)重要[1]。陳衛(wèi)江等[12]利用株高、單株總莢數(shù)、千粒質(zhì)量等10個農(nóng)藝性狀對24份甘藍型油菜細胞質(zhì)雄性不育保持系和恢復(fù)系親本進行了遺傳距離測定分析，并對雜交親本的遺傳距離與雜種優(yōu)勢的相關(guān)關(guān)系進行了探討。結(jié)果表明，親本遺傳距離與雜種優(yōu)勢間存在一定程度的正相關(guān)。Hu等[13]利用9個農(nóng)藝性狀對國內(nèi)外的63份甘藍型油菜進行聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以明顯的將中國和歐洲的甘藍型油菜劃分為兩大類，為拓展國內(nèi)資源提供了理論依據(jù)。K?rber等[14]利用518份甘藍型油菜自交系研究了幼苗發(fā)育的多樣性及其與農(nóng)藝性狀間的關(guān)系，在8種檢測的種質(zhì)類型中發(fā)現(xiàn)了表型多樣性的差異。Chen等[15]對世界各地搜集到的488份甘藍型油菜核心種質(zhì)的表型性狀進行了評估，分析12個產(chǎn)量與農(nóng)藝性狀、10個品質(zhì)性狀的遺傳變異，該信息為育種親本的選擇提供了有用的支撐。此外，該研究挖掘到多份優(yōu)異基因資源和特異遺傳材料，可直接用于生產(chǎn)和遺傳研究。

本試驗對30份甘藍型油菜三系骨干親本材料的11個農(nóng)藝和品質(zhì)性狀進行了鑒定，并對其遺傳多樣性進行分析，劃分育種骨干親本的雜種優(yōu)勢群，旨在為油菜雜交育種的親本選配和生產(chǎn)利用等提供有效的信息和重要的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試的甘藍型油菜骨干親本材料共有30份，包括15份恢復(fù)系和15份保持系材料(基于Pol/Shaan2A CMS分類的恢保關(guān)系)，均為低芥酸和低硫苷材料(表1)。這些材料包括‘秦優(yōu)7號’‘秦油10號’‘陜油8號’‘陜油803’等審定油菜雜交種的父本，或中雙系列、浙雙系列等常規(guī)油菜品種的高代選系。以上材料均由西北農(nóng)林科技大學(xué)油菜研究中心生物技術(shù)育種課題組提供。

表1 供試油菜品種編號、來源、類型和品質(zhì)Table 1 Code, origin, type and quality of rapeseed accessions

注：“00”代表低芥酸，低硫苷。類型代表基于Pol/Shaan2A CMS分類的恢保關(guān)系。

Note:“00” represents low content of erucic acid and low content of glucosinolates. Type represents restorers and maintainers of Pol/Shaan2A CMS.

試驗于2016至2017年在陜西楊凌西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院標本區(qū)(北緯34°16′，東經(jīng)108°)試驗地進行，采用隨機區(qū)組試驗設(shè)計，3次重復(fù)，每個株系種植5行，行長2.0 m，行間0.50 m，植株間距0.15 m，每行15～20株，四周設(shè)置保護行，土壤肥力中等，其他田間管理按常規(guī)進行。

1.2 農(nóng)藝和品質(zhì)性狀調(diào)查

成熟期在每小區(qū)中部隨機選擇5株進行調(diào)查，調(diào)查記載的性狀包括：株高(PH)、分枝部位(SPFPB)、一次有效分枝數(shù)(NB)、主花序有效長度(LTM)、主花序有效角果數(shù)(NSTR)、單株角果數(shù)(NSP)、每角粒數(shù)(NS)、角果長度(SL)、千粒質(zhì)量(TSW)和單株產(chǎn)量(SYP)10個相關(guān)性狀。收獲種子后，參照文獻[16]的方法，利用近紅外儀(Foss NIR Systems Inc, Denmark)對小區(qū)混合種子進行含油量(OC)測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS11.0軟件[17]的單因素方差分析(One Way ANOVA)程序?qū)謴?fù)系和保持系的11個農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀進行比較。單株產(chǎn)量為理論值，由全株有效角果數(shù)、每角粒數(shù)、千粒質(zhì)量的乘積得來。對每個小區(qū)下的株高、分枝部位、一次有效分枝數(shù)、主花序有效長度、主花序有效角果數(shù)，單株角果數(shù)、每角粒數(shù)、角果長度、千粒質(zhì)量、單株產(chǎn)量和含油量等11個性狀的原始數(shù)據(jù)用Excel整理后，采用隨機區(qū)組試驗設(shè)計進行11個農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀的方差分析(Analysis of Agronomic and Quality Variance，AAQVA)，11個性狀的平均值用于聚類分析。根據(jù)馬氏距離計算材料間的成對距離。利用DPS數(shù)據(jù)處理軟件對各項平均值進行多元統(tǒng)計分析；聚類分析采用Ward’s法(離差平方和法)[18]進行系統(tǒng)聚類。所有材料的主成分都是從相關(guān)系數(shù)中提取出來的。利用DPS軟件對11個性狀進行有效矩陣分析。用SPSS11.0軟件的散點圖繪制前2個主成分的坐標圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 方差結(jié)果分析

30份參試甘藍型油菜被分成2組，一組為恢復(fù)系材料，一組為保持系材料。對11個農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀的方差分析(AAQVA)結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表2)：在恢復(fù)系材料中，11個農(nóng)藝性狀的變異系數(shù)從大到小依次為單株產(chǎn)量、分枝部位、單株角果數(shù)、角果長度、主花序有效角果數(shù)、每角粒數(shù)、一次有效分枝數(shù)、主花序有效長度、千粒質(zhì)量、含油量、株高，說明供試材料在恢復(fù)系材料差異在單株產(chǎn)量、分枝部位、單株角果數(shù)等性狀上變異豐富，在千粒質(zhì)量、含油量、株高方面差異小。除株高和含油量變異系數(shù)分別為8.09%和8.33%外，其余性狀變異系數(shù)都在10%以上，最大為單株產(chǎn)量，其變異系數(shù)為33.57%。在保持系材料中，11個農(nóng)藝性狀的變異系數(shù)大小與恢復(fù)系的基本一致，最大為單株產(chǎn)量(39.65%)，最小為株高(6.87%)。然而，所有測試性狀在恢復(fù)系與保持系上沒有顯著性差異(表2和表3)。

表2 恢復(fù)系與保持系11個農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀的基本統(tǒng)計數(shù)據(jù)Table 2 The basic statistic data of 11 agronomic and quality traits between restorer and maintainer lines

注：PH.株高;SPFPB.分枝部位；NB.一次有效分枝數(shù);LTM.主花序有效長度;NSTR.主花序有效角果數(shù);SL.角果長度;NSP.單株角果數(shù);NS.每角粒數(shù);TSW.千粒質(zhì)量;SYP.單株產(chǎn)量;OC.含油量。

Notes:PH.plant height;SPFPB.setting position of the first primary branch;NB.number of primary branches per plant;LTM.length of terminal raceme;NSTR:number of siliques of terminal;SL.siliques length;NSP.number of siliques per plant;NS.number of seed per silique;TSW.thousand seed mass;SYP.seed yield per plant;OC.oil content.

表3 恢復(fù)系與保持系11個農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀的變異系數(shù)Table 3 The variation coefficient of 11 agronomic and quality traits between restorer and maintainer lines %

2.2 聚類分析

根據(jù)11個農(nóng)藝性狀的原始數(shù)據(jù)，利用Ward’s最小方差方法對30份油菜供試材料進行聚類分析，并構(gòu)建聚類圖(圖1)。當遺傳距離的臨界值為39.73時，將30份參試材料分為三大類(Cluster Ⅰ～Ⅲ)：Cluster Ⅰ包括16個材料，其中12個為恢復(fù)系，如Q10C、QY211R、Z821R、S11R、QSC等；4個為保持系，2010B7、New B1、Zhong 5和Zhong 9。Cluster Ⅱ包括10個材料，其中7個為保持系，如2012B1、H15、Zhong 7等；3個為恢復(fù)系，HYZ01R、2000-5R和D1526。Cluster Ⅲ包括4個材料，ZY72、Zhong 2、ZY18和CZ49，均為保持系。結(jié)果說明，參試恢復(fù)系和保持系材料間存在一定的遺傳差異。

2.3 主成分分析

利用DPS數(shù)據(jù)處理軟件對11個農(nóng)藝性狀進行有效矩陣分析，并繪制散點圖(圖2)。PCA結(jié)果表明，PC1占總變異的27.38%，PC2占總變異的22.11%。PC1和PC2的公式如下：

PC1=-0.2915X1+0.0697X2-0.0518X3+0.2405X4+0.2628X5+0.4878X6+0.3515X7+0.0599X8+0.2755X9+0.2510X10+0.5258X11

PC2=0.3015X1+0.4600X2+0.3322X3+0.3259X4-0.2079X5+0.1214X6+0.3622X7-0.3332X8-0.3294X9-0.2587X10+0.0730X11

主成分分析(PCA)結(jié)果與聚類分析結(jié)果相似。從PCA分析結(jié)果(圖2)中可以看出，30份材料主要被劃分為3大類。除Zhong 5(No.17)、2010B1(No.21)、H15(No.22)與2010B7(No.24)4個材料外，其余11個恢復(fù)系材料都被劃為一起，與在聚類分析結(jié)果(Cluster Ⅰ)基本一致；大部分保持系材料也被劃在一起；Q10C(No.1)、Zhong 9 Ⅲ(No.19)和CZ49(No.29)3個材料在聚類分析中歸為第3類。

圖1 基于農(nóng)藝性狀構(gòu)建的30份油菜材料的聚類Fig.1 Dendrogram of 30 rapeseed materials generated by agronomic traits

圖2 從30份油菜材料的11個農(nóng)藝性狀中提取的前2個主成分坐標圖Fig.2 Bioplot of first two major principal components extracted from 11 agronomic traits of 30 rapeseed accessions

2.4 甘藍型油菜保持系和恢復(fù)系親本間農(nóng)藝性狀差異分析

外部形態(tài)特征的變異在一定程度上反映了遺傳變異的大小。由表4可以看出，保持系和恢復(fù)系材料內(nèi)變異系數(shù)為86.40%，保持系和恢復(fù)系材料間僅為13.60%。由表5可以看出，保持系內(nèi)差異最大為15.35%，恢復(fù)系內(nèi)差異次之為7.46%，保持系與恢復(fù)系間差異最小為1.80%?？傮w來說，保持系和恢復(fù)系材料內(nèi)部差異大于它們之間的差異。

表4 恢復(fù)系與保持系油菜農(nóng)藝性狀變異分析Table 4 Analysis of agronomic traits variance of rapeseed accessions of restorer and maintainer

表5 不同甘藍型油菜親本品種間的差異分析Table 5 Pairwise differences of population average

注：對角線數(shù)據(jù)為區(qū)內(nèi)成對材料差異的平均值；對角線下數(shù)據(jù)為修正后的區(qū)間差異平均值。

Note:Diagonal elements:average number of pairwise differences within population(PiX);below diagonal:corrected average pairwise difference(PiXY-(PiX+PiY)/2).

3 討 論

油菜骨干親本的遺傳多樣性分析是雜交育種和雜種優(yōu)勢利用的重要基礎(chǔ)工作。甘藍型油菜種植歷史較短，中國現(xiàn)有的甘藍型油菜的原始資源大多來源于歐洲和日本，導(dǎo)致遺傳背景相對比較狹窄，品種間遺傳多樣性普遍不高，可利用資源匱乏[19]。

形態(tài)學(xué)標記是指通過觀察或者簡單的儀器測量獲得的性狀，為作物種質(zhì)資源的分類和多樣性分析提供了基本依據(jù)[6]。農(nóng)藝性狀具有表現(xiàn)直觀、便于識別、易于掌握以及與生產(chǎn)直接相關(guān)等特點，因而在種植資源的分類、育種親本材料的選擇、組配、以及育成品種的識別上具有重要的應(yīng)用價值。謝永俊等[20]對收集到的15個國家的225份甘藍型油菜的農(nóng)藝性狀以及含油量等進行評估與分析，篩選出22份優(yōu)異國外種質(zhì)資源，并在此基礎(chǔ)上選育出了11個優(yōu)質(zhì)油菜新品種。Tian等[21]利用農(nóng)藝性狀對96份油菜材料進行了地理位置的聚類，結(jié)果表明：96份甘藍型油菜可以聚類到3個地理位置上。高必軍等[22]對甘藍型油菜的主要農(nóng)藝性狀與單株產(chǎn)量的關(guān)系進行了分析，方差分析結(jié)果表明：試驗所測定的油菜單株產(chǎn)量等10個性狀在38個參試品種間存在顯著差異。本研究選擇本課題組多年選育成功的30份油菜三系骨干親本株系，包括15份保持系和15份恢復(fù)系甘藍型油菜，利用聚類分析、主成分分析及方差分析對它們11個農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀進行研究，結(jié)果顯示：參試親本材料間存在一定的遺傳差異，大部分保持系和恢復(fù)系材料被分開，同時，保持系和恢復(fù)系材料內(nèi)部差異大于它們之間的差異。

形態(tài)標記雖易觀察、操作方便，但表型數(shù)量較少，易受環(huán)境和作物生育階段的影響；而DNA分子標記不受環(huán)境影響和基因表達的時空影響，遺傳標記數(shù)量多，遍布整個基因組，穩(wěn)定性好，多態(tài)性明顯。因此，將形態(tài)學(xué)性狀為主的表型分析與分子標記或其它方式相結(jié)合，已經(jīng)成為目前研究種植資源的有效手段[23]。何余堂等[23]通過形態(tài)學(xué)鑒定和RAPD分子標記相結(jié)合的方法，對不同地理來源的82份白菜型油菜(B.campestrisL.)資源進行了分析，揭示了白菜型油菜在中國的起源與進化。蒲曉斌等[24]對73份西南地區(qū)芥菜型油菜資源遺傳多樣性進行了分析，基于15個植物學(xué)性狀測量數(shù)據(jù)的聚類分析將其分為4大類，共14個亞類；RAPD標記多態(tài)性分析結(jié)果的聚類分析顯示為3大類，共15個亞類，結(jié)果表明西南地區(qū)芥菜型油菜資源具有豐富的遺傳多樣性，聚類結(jié)果主要遵循地域和生態(tài)環(huán)境規(guī)律。Ana等[25]通過利用表型數(shù)據(jù)及RAPD標記對30份冬油菜品種進行了遺傳多樣性的評估。對本研究供試材料，臧珊[26]利用SSR和SRAP分子標記對其遺傳多樣性進行了研究。對農(nóng)藝性狀和SSR/SRAP分子標記遺傳多樣性結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，二者存在一定的一致性，兩種方法都可以將供試材料聚類為3類，大部分保持系和恢復(fù)系材料被分開，群體內(nèi)部遺傳變異大于群體間的遺傳變異。同時，二者也存在一定的差異，表型聚類中，第Ⅰ類16個材料在分子標記中仍有13個被聚在同一類，第Ⅱ類10個材料在分子標記中仍有6個被聚在同一類。可見，在2種聚類方法中被聚在同一類的材料居多。其次，2種方法都發(fā)現(xiàn)保持系和恢復(fù)系材料內(nèi)部差異大于它們之間的差異，目前，不同于玉米，油菜中雜種優(yōu)勢群劃分和雜優(yōu)模式研究開展的較少[27-29]，這可能是導(dǎo)致油菜保持系和恢復(fù)系之間遺傳差異較少的原因，因此，需要加強該方面的研究，定向擴大遺傳差異。綜上，表型性狀和分子標記對油菜三系骨干親本的遺傳多樣性的鑒定存在一定的差異，但表現(xiàn)更多的是一致性，以上研究結(jié)果建立了對供試骨干親本的整體認識和評價，對育種設(shè)計、材料創(chuàng)制和選擇、雜交組合選配具有重要的指導(dǎo)價值。