侯玉蘭，朱黎黎，汪志學(xué)，常 琳△

(1.重慶市璧山區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科,重慶 402760；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 402760)

乳腺癌是當(dāng)今危害女性健康的第一大腫瘤，其發(fā)病率居女性惡性腫瘤之首[1]。目前我國(guó)乳腺癌發(fā)病率為21.6/10萬(wàn)，較10年前增長(zhǎng)了近一倍[2]。近年來隨著醫(yī)療水平的提高，乳腺癌的總體五年生存率有所提高，但某些分子類型乳腺癌的預(yù)后仍不盡如人意，尤其是基底細(xì)胞型乳腺癌[3]。乳腺癌的預(yù)后取決于其分子類型與TNM分期，尋找可靠、穩(wěn)定且無創(chuàng)的早期篩查指標(biāo)無疑可為乳腺癌患者的治療贏得時(shí)間，對(duì)預(yù)后的提供具有重要意義。近年來研究發(fā)現(xiàn)，多種長(zhǎng)鏈非編碼RNAs(lncRNAs)在乳腺癌患者中存在異常表達(dá)，可通過表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后翻譯等多種途徑參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移等過程[4]，這些lncRNAs包括lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT等。本研究通過對(duì)245例乳腺癌患者與250例健康女性的血漿lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT表達(dá)水平進(jìn)行比較分析，旨在探究三者對(duì)乳腺癌的診斷價(jià)值及其與乳腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系，以期為乳腺癌的臨床診療提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年3月至2017年12月在重慶市璧山區(qū)人民醫(yī)院初次確診的乳腺癌患者245例(病例組)。病例組納入標(biāo)準(zhǔn)為：(1)經(jīng)CT結(jié)合病理學(xué)確診為乳腺癌；(2)入院前未經(jīng)治療。其中Luminal A 型83例、Luminal B型 81例、人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)過表達(dá)型33例、基底細(xì)胞型48例，Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌137例、Ⅲ～Ⅳ乳腺癌108例?；颊咂骄挲g(45.56±3.23)歲。乳腺癌分子分型的依據(jù)來自術(shù)中切除的腫瘤組織的免疫組化結(jié)果。乳腺癌的分期參照美國(guó)腫瘤聯(lián)合會(huì)(AJCC)第8版乳腺癌分期系統(tǒng)[5]。對(duì)照組為同期在本院行體檢的健康女性250例，平均年齡(44.87±3.76)歲。由研究人員記錄兩組研究對(duì)象的年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、吸煙史、飲酒史等基本信息。所有研究對(duì)象均排除乳腺良性結(jié)節(jié)、血液系統(tǒng)疾病、急慢性感染、心血管疾病、其他的良惡性腫瘤及自身免疫性疾病等。本研究的開展經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有納入對(duì)象均簽署了項(xiàng)目知情同意書。

1.2血漿 lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT表達(dá)水平檢測(cè) 研究對(duì)象均禁食10 h以上，次日清晨由專業(yè)醫(yī)護(hù)人員使用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝采血管抽取靜脈血10 mL，血液標(biāo)本在1 h內(nèi)于4 ℃條件下以12 000 g離心力離心15 min以去除血細(xì)胞。收集上層液體，按照血漿RNA提取試劑盒(中國(guó)Bioteke公司)說明書步驟進(jìn)行血漿總RNA提取。取上述提取的RNA，使用去除基因組逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(中國(guó)Takara公司)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)法檢測(cè)血漿lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT及內(nèi)參基因GAPDH表達(dá)水平。反應(yīng)體系為：Mix 10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，DEPC水6.4 μL。熒光定量PCR循環(huán)條件：95 ℃變性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)，每組設(shè)置2個(gè)復(fù)孔。檢測(cè)過程中所用引物序列如下：HOTTIP上游引物：5′-AGT GTG TCA TAG AGC TTC CTG TTT CAT CTC CCA GT-3′下游引物：5′-TGG AAC CAG GCC CCA GGG AAT CTT TCA GCT GCA TT-3′；ATB 上游引物：5′-TAC AAC CAC TGC ACT ACC TG-3′，下游引物：5′-TGG AAT GCT TGA AGG CTG CT-3′； MIAT上游引物：5′-CGA ACG AGA GGA CCG AAG-3′，下游引物：5′-GCC AAG TTC TAG ATA AGC -3′；GAPDH 上游引物：5′-GGG AGC CAA AAG GGT CAT-3′，下游引物：5′-GAG TCC TTC CAC GAT ACC AA-3′；采用2-ΔΔCt法計(jì)算lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT的相對(duì)表達(dá)量，△Ct值=目的基因Ct值-GAPDH Ct值。

2 結(jié) 果

2.1兩組研究對(duì)象的基本臨床信息 研究對(duì)象的基本臨床信息見表1。病例組與對(duì)照組在年齡、BMI、吸煙史、飲酒史等方面的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

表1 病例組和對(duì)照組臨床基本信息的比較

2.2兩組研究對(duì)象的血漿 lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT表達(dá)水平 病例組的血漿lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT表達(dá)水平均高于對(duì)照組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 病例組和對(duì)照組血漿lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT相對(duì)表達(dá)水平的比較

2.3血漿 lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT表達(dá)水平與乳腺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系 血漿lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT表達(dá)水平與乳腺癌患者的年齡、BMI、吸煙與否、飲酒與否等因素?zé)o關(guān)(P>0.05)，而與乳腺癌的TNM分期、分子分型顯著相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 血漿 lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT表達(dá)水平與乳腺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系(-log)

2.4ROC曲線分析 ROC曲線分析顯示，血漿lncRNA HOTTIP、ATB、MIAT在區(qū)分乳腺癌與健康人群的AUC分別為：0.784(95%CI：0.701～0.866，P<0.001)、0.887(95%CI：0.822～0.951，P<0.001)、0.913(95%CI：0.855～0.971，P<0.001)，靈敏度和特異度分別為：63.8%/89.3%、79.7%/91.7%、87.1%/92.8%。當(dāng)聯(lián)合血漿lncRNA HOTTIP、ATB、MIAT時(shí)，區(qū)分食管癌與健康人群的AUC為0.977(95%CI：0.902～0.998，P<0.001)，靈敏度為85.5%，特異度為97.6%，見圖1。

2.5風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估 多元Logistic回歸分析結(jié)果，見表4。單因素分析顯示，血漿高lncRNA HOTTIP、ATB、MIAT水平是乳腺癌發(fā)病的危險(xiǎn)因素(P<0.05)；多因素分析顯示，在校正年齡、BMI、吸煙史、飲酒史等因素的影響后，血漿高lncRNA HOTTIP、ATB、MIAT水平仍是乳腺癌發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。

圖1 ROC曲線分析

單因素分析OR(95%CI)P多因素分析OR(95%CI)PHOTTIP1.32(1.09～2.31)0.0371.12(1.03～1.34)0.048ATB4.61(2.18～7.33)<0.0014.77(1.47～6.08)<0.001MIAT5.38(1.39～8.91)<0.0013.51(1.53～5.72)0.001

3 討 論

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤，約占女性全部惡性腫瘤的22.9%，嚴(yán)重威脅女性身心健康[6]。中國(guó)女性的乳腺癌發(fā)病率雖低于全球發(fā)病率，但隨著近年來人們生活方式及生育觀念的改變，乳腺癌的發(fā)病率有逐年增高趨勢(shì)[7]。目前乳腺癌的治療效果并不樂觀，采用的主要治療方式包括單純手術(shù)治療、抗腫瘤藥物治療及放射治療[8]。晚期患者接受手術(shù)治療后，雖可提高患者的五年生存率，但卻嚴(yán)重影響了女性的后期生活，甚至對(duì)女性心理健康也造成了一定的影響[9]。由于乳腺癌治療方式的選擇及預(yù)后主要取決于腫瘤的TNM分期與分子分型[7,10]，而目前尚無可靠的早期篩查生物學(xué)指標(biāo)，因而尋找有效、穩(wěn)定且無創(chuàng)的早期篩查指標(biāo)對(duì)改善患者生存質(zhì)量，提高患者預(yù)后具有重要意義。

近年來，關(guān)于lncRNAs在乳腺癌領(lǐng)域的相關(guān)功能學(xué)研究逐漸成為新的熱點(diǎn)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了近10種lncRNAs與乳腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲等過程有關(guān)。例如，YANG等[11]對(duì)460例乳腺癌患者的一項(xiàng)薈萃分析結(jié)果表明，lncRNA HOTTIP表達(dá)水平與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、TNM分期等密切相關(guān)，且高水平的lncRNA HOTTIP提示更差的臨床預(yù)后。隨后研究發(fā)現(xiàn)其可能的機(jī)制lncRNA HOTTIP可誘導(dǎo)腫瘤組織高表達(dá)HOXA11，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[12]。LncRNA ATB也被證實(shí)參與乳腺癌的發(fā)病過程。SHI等[13]利用永生化乳腺癌細(xì)胞系進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，LncRNA ATB可通過TGF-β途徑誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的耐藥，并增強(qiáng)其侵襲能力。NIKPAYAM等[14]對(duì)50對(duì)乳腺癌及癌旁組織中LncRNA ATB的表達(dá)進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，癌組織中LncRNA ATB表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，提示LncRNA ATB對(duì)鑒別診斷乳腺癌具有潛在價(jià)值。除lncRNA HOTTIP與ATB外，近年來關(guān)于LncRNA MIAT與乳腺癌的研究也有一定進(jìn)展。例如，LUAN等[15]的體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，LncRNA MIAT可作為內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)RNA取代miR-155-5p并上調(diào)DUSP7表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌的發(fā)病。ALIPOOR等[16]發(fā)現(xiàn)，LncRNA MIAT在乳腺癌等多種腫瘤組織中均呈高表達(dá)狀態(tài)，而靶向抑制LncRNA MIAT則可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡，并降低其遷移能力。上述研究結(jié)果提示，lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT可通過多種途徑參與乳腺癌的發(fā)病過程，而三者的異常表達(dá)可能為乳腺癌的早期診斷提供線索，但目前國(guó)內(nèi)外尚無關(guān)于上述3種LncRNAs與乳腺癌診斷的相關(guān)報(bào)道。

在本次研究中，首次探究了血漿lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT對(duì)乳腺癌的診斷價(jià)值，并分析了三者與乳腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系。研究結(jié)果表明，聯(lián)合三項(xiàng)指標(biāo)診斷乳腺癌的特異度高達(dá)97.6%，顯著高于單項(xiàng)指標(biāo)靈敏度，表明聯(lián)合檢測(cè)血漿lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT診斷乳腺癌具有可行性，可考慮在臨床推廣使用。此外，本研究再次證實(shí)，lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT表達(dá)水平與乳腺癌的分子類型、TNM分期顯著相關(guān)，該結(jié)論與前期國(guó)外研究結(jié)果相一致，表明lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT表達(dá)水平對(duì)乳腺癌的預(yù)后具有一定預(yù)測(cè)作用。由于本次研究收集的樣本數(shù)量有限，未來仍需更多大樣本多中心研究對(duì)本研究的結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)血漿lncRNA HOTTIP、ATB和MIAT對(duì)乳腺癌的診斷、發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及預(yù)后評(píng)估中具有潛在價(jià)值，有望為乳腺癌的臨床診療提供新思路。