宋春林，陳淑芬，周 成，何云英，伍秋艷

(佛山市婦幼保健院，廣東佛山 528000)

染色體非整倍體疾病是胎兒畸形中較為常見的疾病，在美國發(fā)生率為1/160[1]，在中國的發(fā)生比例更是高達(dá)1/60[2]。常見的如21/18/13和性染色體三倍體或單倍體，特別是21三體綜合征(唐氏綜合征)發(fā)生比例大概為1/750，在高齡孕婦中發(fā)生概率更高。罹患胎兒會給家庭和社會帶來較重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。臨床尚無有效治療措施，只能依靠產(chǎn)前早期檢查來避免。其中，介入性產(chǎn)前診斷準(zhǔn)確度高，但有1%左右的流產(chǎn)或感染風(fēng)險(xiǎn)。傳統(tǒng)的血清學(xué)篩查假陽性和漏診率較高[3]?；谠袐D血漿中胎兒游離DNA高通量測序的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測技術(shù)已廣泛應(yīng)用于三大染色體(21/18/13)的三體檢測[4]。但根據(jù)介入產(chǎn)前診斷的核型結(jié)果，有文獻(xiàn)報(bào)道其假陽性較高，尤其是性染色體的陽性預(yù)測值偏低[5]。本研究回顧分析佛山地區(qū)20 811例無創(chuàng)產(chǎn)前檢測與介入性產(chǎn)前診斷的隨訪結(jié)果，探討該技術(shù)的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧分析2015年4月至2018年6月期間在佛山市婦幼保健院產(chǎn)科門診就診經(jīng)過遺傳咨詢和知情同意，自愿選擇無創(chuàng)產(chǎn)前檢測的孕婦。本研究經(jīng)過倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2血漿分離 采用Cell free DNA BCT管(Streck抗凝管)收集孕婦外周抗凝全血10 mL，4 ℃1 600×g離心10 min分離血漿。要求無明顯溶血、凝血。

1.3胎兒游離DNA提取 采用磁珠法分離胎兒游離DNA，使用Qubit核酸定量分析儀檢測DNA濃度。濃度應(yīng)在0.05～0.70 ng/mL內(nèi)。否則通知孕婦重新采血。

1.4建庫與測序 采用EZ-PALO快速建庫法，并在ABI Step one plus擴(kuò)增儀上進(jìn)行QC檢測建庫濃度和質(zhì)量，若QC不合格應(yīng)重做。根據(jù)建庫濃度Pooling，混合在CN500測序平臺進(jìn)行單端36+8(index)bp測序。

1.5數(shù)據(jù)分析 參照人類基因組hg19和各條染色體的比例均值與標(biāo)準(zhǔn)差，經(jīng)GC矯正，計(jì)算各條染色體的Z值。21/18/13三大染色體Z值超過3為異常。性染色體通過XY的Z值散點(diǎn)圖判斷結(jié)果。其他染色體以Z值超過5為異常。計(jì)算胎兒DNA含量，要求在4%以上。

1.6介入性產(chǎn)前診斷 無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測異常的，給予遺傳咨詢，建議羊水穿刺后行G帶染色核型分析或熒光原位雜交(FISH)或基因芯片確診。其他常染色體異常的采用高通量測序染色體畸變檢測100 kb的微重復(fù)微缺失。

1.7胎盤嵌合體分析 胎盤娩出后立即分別在臍帶中段、臍帶根部、胎盤中心 、母親面胎盤中心、母親面胎盤邊緣五個(gè)地方各取兩個(gè)黃豆大的組織共10個(gè)樣本行高通量測序拷貝數(shù)變異(CNV)檢測。

1.8隨訪 對于無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測提示低風(fēng)險(xiǎn)的，定期電話隨訪至分娩后12周。對于高風(fēng)險(xiǎn)的，追蹤是否進(jìn)行介入性產(chǎn)前診斷及結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1臨床資料分析 總共有20 811位孕婦在知情選擇下行無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測，年齡17～50周歲，平均31.40周歲，孕周12～27周,平均16.53周，高齡孕婦占39.2%(8 158/20 811)。輔助生殖技術(shù)孕婦占9.3%(1 935/20 811)。

2.2無創(chuàng)產(chǎn)前檢測結(jié)果 在這20 811例無創(chuàng)產(chǎn)前檢測結(jié)果中，提示異常的總共有314例(1.51%)。其中21/18/13三大染色體結(jié)果提示異常的有130例，性染色體結(jié)果提示異常的有111例(0.53%)，其他染色體結(jié)果提示異常的有73例(0.35%)。結(jié)果見表1。

2.3隨訪情況 在這314例無創(chuàng)產(chǎn)前檢測結(jié)果提示異常中，研究者做到了100%隨訪并提供遺傳咨詢，但有12例拒絕隨訪，有10例在隨訪時(shí)回答已胎死宮內(nèi)或直接在外院引產(chǎn)但未做尸檢。另有61例拒絕進(jìn)一步的介入產(chǎn)前診斷并繼續(xù)妊娠，大多數(shù)為性染色體異常和其他常染色體異常。

表1 20 811例無創(chuàng)產(chǎn)前檢測結(jié)果(n)

2.4進(jìn)一步驗(yàn)證 231例在知情同意下行羊水穿刺或臍血穿刺后進(jìn)行染色體核型分析或高通量測序染色體畸變檢測拷貝數(shù)變異，部分加做了FISH檢測，極少數(shù)在外院以染色體微陣列芯片(CMA)分析或快速熒光擴(kuò)增(Qf-PCR)驗(yàn)證。其中136例的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測結(jié)果與介入性產(chǎn)前診斷結(jié)果一致并選擇了引產(chǎn)，有1例行介入性產(chǎn)前診斷核型分析確診為21三體綜合征但孕婦選擇繼續(xù)妊娠并順產(chǎn)分娩，見圖1。而無創(chuàng)產(chǎn)前檢測與介入性產(chǎn)前診斷結(jié)果不一致的有94例，主要為性染色體和除三大染色體以外的常染色體異常。

圖1 無創(chuàng)21三體高風(fēng)險(xiǎn)行羊水穿刺培養(yǎng)染色體核型為47XY+21

2.5檢出率和陽性預(yù)測值分析 231人在知情同意下行介入性產(chǎn)前診斷，21/18/13三體陽性預(yù)測值分別為81.43%、76.92%、41.67%，性染色體陽性預(yù)測值為60.26%、其他常染色體陽性預(yù)測值為17.78%。其中21/18三體和性染色體異常的陽性預(yù)測值和檢出率較高。見表2。

表2 三體檢出率和陽性預(yù)測值(%)

2.6不一致的情況 26例21/18/13三大染色體結(jié)果不一致中，有10例在無創(chuàng)產(chǎn)前檢測結(jié)果直接提示了可能是嵌合體。經(jīng)過胎盤取材用高通量測序的方法做拷貝數(shù)變異檢測鑒定為限制性胎盤嵌合體(CPM)。出現(xiàn)了2例18三體假陰性，核型分析結(jié)果該胎兒為18三體嵌合體，見圖2。性染色體結(jié)果不一致主要表現(xiàn)為ChrX+(Mat)和ChrX-，見圖3。

圖2 無創(chuàng)低風(fēng)險(xiǎn)行羊水穿刺培養(yǎng)染色體核型為47XY+18嵌合體

圖3 無創(chuàng)提示性染色體ChrX+(Mat)和ChrX-

3 討 論

先天性胎兒畸形最常見的是染色體非整倍體，患兒多生長發(fā)育遲緩、智力障礙、伴多發(fā)性結(jié)構(gòu)畸形等[6]。臨床尚無有效治療措施，產(chǎn)前診斷是避免罹患胎兒出生的最有效措施。介入性產(chǎn)前診斷取得良好成果，近幾年畸形胎兒出生率有明顯降低，但文獻(xiàn)表明有1%左右的流產(chǎn)或感染風(fēng)險(xiǎn)[7]。介入性產(chǎn)前診斷需要較長的培養(yǎng)周期，且容易發(fā)生優(yōu)勢生長，不利于嵌合體的檢測。而傳統(tǒng)的血清學(xué)篩查技術(shù)影響因素多，假陽性較高，大約為5%，且漏診率較高[8]，盡管劉春燕等[9]的研究認(rèn)為血清學(xué)三聯(lián)篩查可在高齡孕婦中較有效地檢出胎兒唐氏綜合征，其綜合準(zhǔn)確率只能達(dá)到70%左右。而且血清學(xué)篩查技術(shù)只能得出21三體和18三體的風(fēng)險(xiǎn)值，不能檢測13三體和性染色體等其他染色體異常。

無創(chuàng)產(chǎn)前檢測已廣泛應(yīng)用于三大染色體(21/18/13)的三體檢測[10]。有文獻(xiàn)報(bào)道其準(zhǔn)確率可以達(dá)到99%[11]。但其假陽性較高，尤其是性染色體的陽性預(yù)測值偏低[12]，其他常染色體則鮮見報(bào)道。隨著無創(chuàng)產(chǎn)前檢測技術(shù)大規(guī)模地應(yīng)用于臨床，以核型分析為金標(biāo)準(zhǔn)，無創(chuàng)產(chǎn)前檢測結(jié)果的綜合陽性預(yù)測值較低，由此給臨床帶來的假陰性和假陽性問題不容忽視[5]。盡管很多檢測機(jī)構(gòu)在進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測時(shí)已經(jīng)為孕婦提供了一份保險(xiǎn)。但如何降低假陽性、避免假陰性已經(jīng)成為臨床亟待解決的問題。研究者將測序深度加大，采用基于貝瑞和康公司的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測plus技術(shù)，可以檢測出三大染色體和性染色體共100種常見染色體異常。

本研究回顧分析了佛山地區(qū)20 811例無創(chuàng)產(chǎn)前檢測與介入性產(chǎn)前診斷的隨訪結(jié)果，檢出314例染色體核型異常(占1.51%)，我國的胎兒染色體異常的確遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于美國的發(fā)生率。特別是二胎政策放開后，更多高齡孕婦，包括很多通過輔助生殖技術(shù)助孕的，也可能提高了胎兒染色體異常的比例。有231例在知情同意下下行介入性產(chǎn)前診斷。結(jié)果表明21/18/13三大染色體和性染色體的檢出率和陽性預(yù)測值均較高。高齡組占總檢測人數(shù)的39.2%，數(shù)據(jù)表明高齡孕婦傾向于選擇無創(chuàng)產(chǎn)前檢測技術(shù)。輔助生殖技術(shù)孕婦占9.3%，達(dá)到1 935人次，說明輔助生殖技術(shù)的孕婦偏向于選擇無創(chuàng)產(chǎn)前檢測技術(shù)。

對假陽性和假陰性分析。有10例在無創(chuàng)結(jié)果顯示可能為限制性胎盤嵌合體。一例羊水穿刺Fish檢測發(fā)現(xiàn)10%的21三體，核型為46XN，分娩后胎盤嵌合體分析，發(fā)現(xiàn)胎盤母體面為21三體，胎盤胎兒面則為46XY。限制性胎盤嵌合體除了可能導(dǎo)致假陽性，還可能導(dǎo)致假陰性。兩例無創(chuàng)結(jié)果低風(fēng)險(xiǎn)，但核型分析結(jié)果證實(shí)胎兒和胎盤均為18三體嵌合體。LEBO等[13]也發(fā)現(xiàn)了嵌合體導(dǎo)致的假陰性。研究者對部分病例做了胎盤嵌合體分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)的染色體核型分析存在某個(gè)核型優(yōu)勢生長的現(xiàn)象，與GRATI等[14]的發(fā)現(xiàn)一致，一例無創(chuàng)結(jié)果為Chr16+，高通量測序結(jié)果為CNV:47XN+16[35%]/46XN[65%]，核型在110個(gè)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)一個(gè)細(xì)胞47XN+16。一例無創(chuàng)結(jié)果為ChrX-，介入性產(chǎn)前診斷高通量測序CNV結(jié)果為47XYY，但核型分析數(shù)了100個(gè)細(xì)胞才發(fā)現(xiàn)一個(gè)細(xì)胞是47XYY，而未經(jīng)培養(yǎng)FISH檢測卻與CNV檢測結(jié)果一致。1例無創(chuàng)產(chǎn)前檢測提示性染色體異常ChrX-，CNV顯示為47XYY，F(xiàn)ISH羊水分析提示胎兒為47XYY[55%]46XY[45%]的嵌合體，然而核型結(jié)果為正常。1例無創(chuàng)結(jié)果為ChrX+(Y)，F(xiàn)ISH結(jié)果為[99%]47XXY，核型為47XXY[54]/46XY[46]，CNV為47XXY[50%]/46XY[50%]。說明隨著各種檢測技術(shù)的出現(xiàn)，特別是在嵌合體分析上，核型分析結(jié)果不應(yīng)作為唯一的參考。

傳統(tǒng)的核型分析只能檢測出大于10 Mb的異常。而微重復(fù)微缺失檢測可以檢測到100 kb的畸變[15]。1例無創(chuàng)產(chǎn)前檢測結(jié)果提示Chr6+，但核型分析結(jié)果正常，而CNV結(jié)果6p12.1q13區(qū)域小片段的重復(fù)。研究者發(fā)現(xiàn)2例孕婦分別在21q22.3和21q22.2有3Mb的微重復(fù)導(dǎo)致胎兒無創(chuàng)產(chǎn)前檢測結(jié)果為21三體高風(fēng)險(xiǎn)的假陽性結(jié)果。1例無創(chuàng)結(jié)果為18三體但臍血穿刺核型結(jié)果為46XN，der(9)t(9；18)(p22；q11.2)，母親平衡易位46，t(9；18)(p22；q11.2)。1例無創(chuàng)產(chǎn)前檢測結(jié)果為ChrX+Y(Mat)，羊水FISH和核型結(jié)果正常，孕婦核型為47XXX。說明孕婦染色體異常是無創(chuàng)和介入結(jié)果不一致的主要因素。無創(chuàng)產(chǎn)前檢測在雙胎應(yīng)用的局限性以往也有報(bào)道[16]。如何消除這些因素的影響，提高無創(chuàng)產(chǎn)前檢測的準(zhǔn)確率和陽性預(yù)測值是下一步要考慮的。如整合母體血漿測序和母體白細(xì)胞測序來提高其準(zhǔn)確度[17]。此外，由于X染色體含有較多的GC堿基和失活現(xiàn)象以及與Y染色體標(biāo)記序列的相似性影響了性染色體的檢測準(zhǔn)確性也是值得注意的[18]。

4 結(jié) 論

本研究表明無創(chuàng)基因產(chǎn)前檢測在21/18/13染色體檢測中有較高的陽性預(yù)測值，且可以發(fā)現(xiàn)其他常染色體的異常，該技術(shù)已被廣大孕婦特別是通過輔助生殖技術(shù)助孕的孕婦接受。部分以核型分析為標(biāo)準(zhǔn)判斷無創(chuàng)產(chǎn)前檢測結(jié)果為假陽性的病例，通過其他如FISH、CMA、CNV新技術(shù)檢測可能發(fā)現(xiàn)胎兒為嵌合體或染色體微重復(fù)微缺失，應(yīng)予以高度重視。但無創(chuàng)產(chǎn)前檢測也存在一定的局限性，在低比例嵌合體的檢測可能受到影響，也受孕婦染色體異?；蛟袐D腫瘤等因素的影響。