王 鴻，劉權(quán)賢，陳 玲,李瑜琴，袁 陽，張建勇

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院呼吸二科，貴州遵義 563000)

結(jié)核病是結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病，也是由單一病菌引起人類死亡人數(shù)最多的傳染病。我國是全球結(jié)核病高負擔國家之一，據(jù)2017年世界衛(wèi)生組織(WHO)估算，2016年全球約有1 040.0萬新發(fā)結(jié)核病病例，我國新發(fā)病例約91.8萬，居世界第3位[1]。目前，對于結(jié)核病的病原學檢測依賴于傳統(tǒng)的涂片抗酸染色法與培養(yǎng)法，然而結(jié)核病病原學傳統(tǒng)檢測方法已經(jīng)不能滿足臨床早期診斷的需求。早期發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者并進行有效治療是有效減少傳染源、控制結(jié)核病傳播的關(guān)鍵[2]，因此，迫切需要一種快速而有效的結(jié)核分枝桿菌檢測技術(shù)，以提高結(jié)核病的早期診斷能力。

環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(LAMP)是由Notomi及其同事開發(fā)的一種新的核酸檢測擴增技術(shù)，它使用一種DNA聚合酶和一套4種專門設(shè)計的引物，可以識別目標DNA上的6個不同序列，在等溫條件下高效擴增DNA，所產(chǎn)生的大量DNA和反應(yīng)的高度特異性使得可以通過目視檢查熒光或濁度來檢測擴增，而不需要凝膠電泳或儀器檢測標記的探針，使用封閉管系統(tǒng)，最大限度地減少了工作區(qū)被污染的風險。LAMP檢測與培養(yǎng)比有很大的速度優(yōu)勢，也具有極好的靈敏度與特異度，且與其他核酸擴增實驗相比，它不需要專門的核酸擴增設(shè)備，不需要高度的技術(shù)支持，大大降低了成本，使LAMP在肺結(jié)核發(fā)病率高的發(fā)展中國家成為了結(jié)核分子檢測有效工具[2-5]。LAMP法主要用于痰液的檢查，在檢測痰液、腦脊液、尿液及胸腔積液中的結(jié)核分枝桿菌已有報道[6-10]，但用于支氣管肺泡灌洗液(BALF)診斷肺結(jié)核的價值目前尚未見報道。

支氣管肺泡灌洗(BAL)是一種能獲得更直接、更多痰液的有效方法，通過支氣管鏡從病變相應(yīng)的葉或段開口進行灌洗，因機械性的刺激，使得痰液增多，有利于結(jié)核分枝桿菌的檢出。在無痰、涂陰或者標本獲取困難時，可通過支氣管鏡檢查獲得肺泡灌洗液，提高肺結(jié)核的確診率，有助于肺結(jié)核的早期診斷及治療[11-12]。本研究對肺部疾病患者支氣管刷檢物進行涂片抗酸染色檢測，肺泡灌洗液進行LAMP及結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)檢測，通過3種檢測方法進行比較，了解肺泡灌洗液標本LAMP法檢測結(jié)核分枝桿菌的陽性率及陽性檢出率，評價LAMP檢測技術(shù)在肺泡灌洗液中篩查結(jié)核分枝桿菌的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年6月至2018年2月130例因呼吸道癥狀及肺部病變于遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院住院的患者的信息，評估患者行支氣管鏡檢查的可行性，與患者及家屬進行溝通，并取得同意后行支氣管鏡檢查，獲得其病變部位支氣管刷檢物，然后對其同一病變局部進行BAL，獲得肺泡灌洗液標本130例。男性76例，女性54例，年齡13～76歲。130例患者分為兩組，肺結(jié)核組51例，非結(jié)核病組79例。肺結(jié)核組診斷標準參照《肺結(jié)核診斷標準(WS288-2008)》。非結(jié)核病病例中，臨床診斷肺癌14例，肺膿腫4例，慢性支氣管炎5例，慢性阻塞性肺疾病6例，肺炎24例，支氣管擴張并感染6例，肺中葉綜合征3例，肺部炎性假瘤2例，塵肺4例，右肺上葉奇葉1例，肺部陳舊性病變10例。

1.2儀器與試劑 Loopamp恒溫熒光核酸擴增儀(日本榮研株式會社,型號LF-160)。Loopamp核酸快速提取試劑盒(日本榮研株式會社,貨號VMP802)、Loopamp結(jié)核分枝桿菌復合群核酸檢測試劑盒(日本榮研株式會社,貨號VMP521),生物安全柜(濟南鑫貝西生物技術(shù)有限公司)，離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司，型號L530)。

1.3方法

1.3.1LAMP法(根據(jù)試劑盒說明書進行操作) (1)樣本溶液采集。①在生物安全柜中取10 mL BALF標本離心15 min(4 100 r/min)，靜置約10 min后棄上清；②取60 μL沉淀物加入樣本處理試管，顛倒混合3～5次后，將內(nèi)容液甩至底部；③將樣本處理試管放到90 ℃加熱器上，加熱5 min后，在室溫下放置2 min后，顛倒混合3～5次；④取下吸附劑試管的蓋子，將樣本處理試管擰入吸附劑試管后立即進行激烈振蕩，待內(nèi)容物充分混合后，將吸附劑試管水平橫放；⑤在滴注蓋嘴上安裝步驟④中取下的吸附劑試管的蓋子，將吸附劑試管安裝滴注蓋的部分(滴下側(cè))朝上，吸附劑試管(滴下側(cè))的對準線與滴注蓋的對準線對準，先推入后旋緊至雙方的對準線再次幾乎并為一條線為止；⑥將吸附劑試管中的內(nèi)容物完全甩落到在步驟⑤中安裝了蓋子的滴注蓋側(cè)；⑦將安裝在滴注蓋上的蓋子取下，擠壓吸附劑試管的可擠壓部分，形成樣本溶液。(2)試劑與樣本溶液的混合。①將30 μL樣本溶液添加至反應(yīng)試管(結(jié)核分枝桿菌復合群檢查用干燥試劑)中，蓋上反應(yīng)試管蓋子并做好標記(30 μL大致標準為到達反應(yīng)試管的2根刻度線的中間)；②陰性對照結(jié)核分枝桿菌離心后用吸管取40～60 μL，按照操作說明使用核酸快速提取試劑盒提取出的溶液作為陰性對照溶液，在陰性對照反應(yīng)中，代替樣本溶液添加30 μL陰性對照溶液至反應(yīng)試管后蓋上蓋子，做好標記，作為陰性對照；③將陽性對照結(jié)核分枝桿菌離心后，使用附帶的陽性對照用滴管添加30 μL陽性對照結(jié)核分枝桿菌至反應(yīng)試管后蓋上蓋子，做好標記，作為陰性對照；④將反應(yīng)試管顛倒，使溶液移向蓋子，保持顛倒狀態(tài)放置2 min后，將反應(yīng)試管反復顛倒混合5次，確保蓋子上的干燥試劑已被充分溶解后，用力將管內(nèi)溶液甩到反應(yīng)試管底部。(3)擴增反應(yīng)。①確認恒溫熒光核酸擴增儀溫度已達到67 ℃;②將反應(yīng)試管放入恒溫熒光核酸擴增儀中，按下右側(cè)綠色按鈕，開始進行擴增反應(yīng)，反應(yīng)時間40 min。(4)熒光目視判定確認擴增反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)試管放在LF-160熒光目視檢測裝置上，從反應(yīng)試管的側(cè)面進行觀察；在確認陽性對照發(fā)出綠色熒光，陰性對照沒有發(fā)出熒光后，對所檢測樣本進行判定，發(fā)出綠色熒光者為陽性，未發(fā)出熒光者為陰性。

1.3.2羅氏固體培養(yǎng)法(L-J培養(yǎng)) (1)在生物安全柜中取BALF標本10 mL溶于10～20 mL 4%NaOH中(根據(jù)標本性狀，加入的4%NaOH體積為BALF的1～2倍)，間隙振動搖勻，消化15 min，使標本充分液化;(2)用一次性無菌吸管取標本沉淀2～3滴，均勻接種于酸性培養(yǎng)基斜面的上、中、下部，蓋上蓋子(避免完全擰緊)，將接種標本的培養(yǎng)基管斜放入35～37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中；(3)接種結(jié)核分枝桿菌標準菌株(H37Rv)10-3mg/mL菌懸液，作為陽性對照，4周內(nèi)菌落生長為合格；(4)分別于接種后第3、7天觀察1次，以后每周觀察1次，并記錄觀察結(jié)果，直至第8周末。酸性培養(yǎng)基斜面上見菌落生長后再進行抗酸染色復檢，抗酸染色陽性后再進行菌型鑒定，采用對硝基苯甲酸(PNB)鑒定菌落為結(jié)核分枝桿菌復合群(MTBC)還是非結(jié)核分枝桿菌(NTM)[13-15]。

1.3.3涂片抗酸染色法 (1)取支氣管刷檢標本進行涂片，待其自然干燥；(2)染色：玻片經(jīng)火焰固定，加苯酚復紅染液蓋滿玻片，染色5 min；(3)脫色：用流水自玻片一端沖洗染液，瀝去玻片上的水，滴加脫色液，保持1 min;(4)復染：滴加亞甲藍溶液，染色30 s，水洗干燥后鏡檢。結(jié)果判定按照中國防癆協(xié)會制訂的結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程進行[13-15]。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，以L-J培養(yǎng)結(jié)果為標準，計算LAMP檢測的陽性率及陽性檢出率。配對設(shè)計資料的χ2檢驗比較LAMP與抗酸桿菌涂片及結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)在檢出率上是否存在差異，當P<0.05時，差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

涂片法、LAMP法及L-J培養(yǎng)法在結(jié)核組及非結(jié)核組中支氣管刷檢物及BALF結(jié)核分枝桿菌檢出情況如下。51例臨床診斷肺結(jié)核患者中，抗酸染色陽性3例，陽性率為5.9%(3/51)，18例BALF培養(yǎng)陽性，陽性率為35.3%(18/51)，28例LAMP陽性，陽性率為54.9%(28/51)。非肺結(jié)核組79例標本中，支氣管刷檢物行涂片抗酸染色及肺泡灌洗液培養(yǎng)均陰性，LAMP法陽性2例，其中1例臨床診斷為肺癌，另1例臨床診斷為肺炎。在結(jié)核組中，LAMP法與涂片法的結(jié)核分枝桿菌陽性率比較，兩者差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=23.04，P<0.05),LAMP法對結(jié)核分枝桿菌的陽性率明顯高于涂片法。LAMP法與L-J培養(yǎng)在BALF中結(jié)核分枝桿菌陽性率比較，兩者差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=5.0625，P<0.05)，LAMP法對結(jié)核分枝桿菌的陽性率高于L-J培養(yǎng)。見表1、2。

表1 3種方法在肺結(jié)核組及非肺結(jié)核組中檢出結(jié)果的比較[%(n/n)]

表2 51例臨床診斷肺結(jié)核者LAMP法與L-J培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌陽性率比較

3 討 論

LAMP法使用DNA聚合酶和一套4個特別設(shè)計的引物，可以識別目標DNA上總共6個不同的序列，達到高選擇性擴增目標序列的目的。LAMP引物包括一對內(nèi)引物(FIP、BIP)和一對外引物(F3、B3)。含有靶DNA正義鏈和反義鏈序列的內(nèi)引物(FIP)啟動LAMP。由外引物(F3)引發(fā)的鏈置換DNA合成釋放單鏈DNA，單鏈DNA自身形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)；第二個內(nèi)引物(BIP)和外引物(B3)與靶DNA的另一端結(jié)合形成啞鈴狀結(jié)構(gòu)，啞鈴結(jié)構(gòu)是LAMP循環(huán)的起始結(jié)構(gòu)。它以自身為模板進行DNA合成，最后形成莖環(huán)DNA結(jié)構(gòu)。在隨后的循環(huán)中，一個內(nèi)引物與莖環(huán)DNA結(jié)合，通過鏈置換形成原始莖環(huán)DNA和兩倍長度的新莖環(huán)DNA。在低于1 h的時間內(nèi)，循環(huán)反應(yīng)可累積達到109個拷貝目標，最終形成一系列長短不一的含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA產(chǎn)物[3,16]。

本研究共采集了130例支氣管刷檢物及肺泡灌洗液標本，其中臨床診斷肺結(jié)核51例，非肺結(jié)核79例，分別用LAMP、抗酸染色及L-J培養(yǎng)法進行檢測。研究顯示，51例臨床診斷的肺結(jié)核患者支氣管刷檢物及肺泡灌洗液標本中，3例涂片陽性標本中LAMP均陽性；48例涂片陰性標本中，25例LAMP檢測陽性，陽性率52.1%(25/48)。51例培養(yǎng)中，18例培養(yǎng)陽性的標本中3例LAMP為陰性，LAMP的檢出率83.3%(15/18)，但33例培養(yǎng)陰性的標本中13例LAMP檢出陽性，LAMP在培養(yǎng)陰性的標本中陽性檢出率達39.1%(13/33)。

由此可見，在臨床診斷的肺結(jié)核中，涂片法檢出率為5.9%(3/51)，培養(yǎng)法檢出率為35.3%(18/51)，LAMP法檢出率為54.9%(28/51)，LAMP法明顯高于抗酸染色涂片法和L-J培養(yǎng)法。與BAL采樣相比，支氣管刷檢采樣的操作可控性較好，可在直視下確定取材部位，在此條件下，支氣管刷檢物行抗酸染色檢測理應(yīng)比BALF陽性率更高，但本研究中刷檢物涂片行抗酸染色陽性檢出率卻低于BALF樣本，說明LAMP檢測病原菌的優(yōu)勢，提示LAMP法是一種快速、高效率、有價值的診斷技術(shù)，利于肺結(jié)核的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷。

有研究報道，以結(jié)核菌培養(yǎng)為標準，Xpert MTB/RIF方法在BALF中檢測的靈敏度為80%[17]，與本研究LAMP法的檢測靈敏度(83.3%)一致。但TB-LAMP檢測成本較低，不需要昂貴的儀器，更適用于結(jié)核病高負擔國家與地區(qū)。

本研究的51例肺結(jié)核患者BALF標本中，LAMP與L-J培養(yǎng)結(jié)果并非完全一致，其中LAMP陽性而L-J培養(yǎng)陰性者13例，可能原因分析如下：(1)L-J培養(yǎng)法在接種前需將BALF標本溶于4%NaOH中消化，若4%NaOH使用過多或者消化時間過長，可能會影響結(jié)核分枝桿菌活性，或者導致結(jié)核分枝桿菌死亡；(2)LAMP法測定結(jié)核分枝桿菌的DNA，無論是死菌或活菌，均可被檢出，而培養(yǎng)法所檢測出的是活的結(jié)核分枝桿菌[18-19]；(3)LAMP法標本經(jīng)過離心濃縮后進行檢測，培養(yǎng)法標本未經(jīng)過離心，導致載菌量不同，可能影響結(jié)果；(4)盡管LAMP檢測技術(shù)產(chǎn)生標本交叉污染的可能性低，但不能完全除外肺泡灌洗液標本污染可能，如內(nèi)鏡消毒不嚴、標本運送環(huán)節(jié)造成污染等。L-J培養(yǎng)陽性而LAMP陰性者3例，可能原因分析如下：(1)肺泡灌洗液中含有血性物質(zhì)，可能會影響LAMP結(jié)果；(2)LAMP的取樣量小，為60 μL，操作者采樣的量及部位均可影響檢測結(jié)果[18-19]。

針對LAMP法與L-J培養(yǎng)檢測結(jié)果不一致，尚不能除外LAMP法檢測結(jié)核分枝桿菌存在假陽性及假陰性可能，有待今后進一步行結(jié)核分枝桿菌基因測序進行鑒定。

另外，在79例臨床診斷非肺結(jié)核組的BALF標本中，2例LAMP陽性，其中1例病理診斷為肺癌，另1例臨床診斷為肺炎，該2例患者是否同時合并肺結(jié)核尚需進一步追蹤隨訪以明確或排除。

4 結(jié) 論

LAMP法診斷肺結(jié)核具有快速、簡便的特點，但在檢測臨床BALF標本中的應(yīng)用目前尚未見報道，本研究表明LAMP在臨床診斷的肺結(jié)核患者BALF標本中結(jié)核分枝桿菌陽性檢出率明顯高于普通培養(yǎng)與涂片法，值得臨床推廣。