王海生，周亞萍，于海燕，郭素梅，曹利民△

(1．常州市武進中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，江蘇常州 213161；2．江蘇艾賽氏生物科技有限公司，江蘇常州 213017)

吡喃糖氧化酶(PROD)是葡萄糖-甲醇-膽堿氧化還原酶家族的成員，以同源四聚體的形式存在，相對分子質量約為270×103，黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)是其重要的輔酶。該酶主要能催化吡喃醛糖2位碳原子發(fā)生氧化生成2酮醛糖和過氧化氫[1]。在臨床檢驗中，人們利用其偶聯(lián)trinder反應檢測臨床標本中葡萄糖和1,5-脫水葡萄糖醇(1,5-AG)的水平以用于診斷糖尿病[2-3]，但該酶需從國外購買。因此，筆者擬通過基因工程原核表達、純化及鑒定PROD，并配成應用液檢測血糖的水平，分析該法與葡萄糖氧化酶法(GOD法)、已糖激酶法(HK法)檢測血糖診斷糖尿病的效能，以期實現(xiàn)該試劑原料的國產化，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2017年8月至2018年1月由常州市武進中醫(yī)醫(yī)院內分泌科收治的臨床符合WTO糖尿病診斷標準的2型糖尿病患者30例(空腹血糖>7.0 mmol/L)納入本研究。其中，男16例，女14例，年齡34～74歲，排除有應激、腫瘤、肝損傷、心血管事件、非糖尿病性腎臟疾病等患者。另在常州市武進中醫(yī)醫(yī)院體檢中心選擇同期20例健康體檢者，男12例，女8例，年齡35～75歲。2組研究對象的年齡、性別等資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。納入研究者對常州市武進中醫(yī)醫(yī)研究均知情同意，且本研究獲得本院倫理委員會的批準。

1.2儀器與試劑 恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海蘇坤實業(yè)有限公司)、超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)、UV-9600紫外/可見分光光度計(北京北分瑞利分析儀器有限責任公司)、蛋白電泳儀(美國BIO-RAD公司)、發(fā)酵灌(上海鶴禾實業(yè)發(fā)展有限公司)、日立7080生化分析儀(日本HITACHI公司)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，北京百靈威科技有限公司)，His-Trap FF crude柱、Sephadex G-25 S脫鹽柱(美國GE公司)，咪唑、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、疊氮鈉(Sigma公司)，EDTA、Tris、曲拉通X-100、D-葡萄糖、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、4-氨基安替比林(4AA)均為上海國藥集團化學試劑有限公司產品，2-羥基-3-間甲苯胺丙磺酸鈉(TOOS，南京旋光科技有限公司)、亞鐵氰化鉀[生工生物工程(上海)股份有限公司]、過氧化物酶(POD，日本Toyobo公司)，HK法和GOD法血糖檢測試劑盒、抗壞血酸氧化酶、BSA(上海羅氏診斷有限公司)。

1.3方法

1.3.1pET15b-PROD重組質粒的構建 通過DNA Tools、ANTHEPROT等生物信息軟件，比較不同種屬的PROD核苷酸同源序列，獲得可溶性好、活性強的PROD核苷酸表達序列，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成該核苷酸序列，并構建重組質粒pET15b-PROD。

1.3.2融合蛋白的表達 將該重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中。轉化子接種至5 mL LB培養(yǎng)基(含氨芐西林50 mg/L)中，37 ℃ 250 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。然后，按照1%的比例轉種于250 mL LB培養(yǎng)液(含氨芐西林50 mg/L)中，振蕩培養(yǎng)至A600為0.6～0.8時，向其中加入終濃度為0.1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，20 ℃振蕩培養(yǎng)誘導3 h，離心，收集菌體。

1.3.3融合蛋白的純化 將上述收集的菌體重懸于原培養(yǎng)液1/10體積的裂解液(PBS pH7.4，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑，50 μmol/L FAD)中，冰浴超聲破壁10 min，離心，收集上清及沉淀。接著，將該上清液過濾后上樣至預平衡后的His-Trap FF crude柱(平衡液 PBS pH7.4，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑)，上樣結束后再用10倍柱床體積平衡液平衡，最后用5倍柱床體積洗脫緩沖液(PBS pH7.4，500 mmol/L NaCl，pH8.0，500 mmol/L咪唑)洗脫，每管收集1 mL洗脫液。將收集的上清、沉淀及洗脫液通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定。

1.3.4融合蛋白的脫鹽 將上述收集的洗脫液過濾后，上樣至預平衡后的Sephadex G-25 S脫鹽柱(脫鹽液50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，50 μmol/L FAD)，上樣結束后再用2～3倍柱床體積脫鹽液脫鹽，收集前2.0～2.5 mL含PROD的脫鹽液。

1.3.5融合蛋白活性的檢測 在反應體系為3 mL，100 mmol/L MES，pH6.0中進行，內含131 mmol/L D-葡萄糖，0.2 mmol/L 4AA，0.3 mmol/L TOOS和4 kU/L POD。37 ℃預孵育5 min后，加入適量酶液，在546 nm波長下連續(xù)測定2～3 min的吸光度(A)，得到酶的每分鐘A的變化(△A標本)，以不加酶液的反應液為對照，得到空白標本的每分鐘A的變化(△A空白)。定義每分鐘催化葡萄糖生成1 mmol過氧化氫為1個酶活力單位，按照計算公式：酶活性(U/L)=(△A標本-△A空白)×1 890×稀釋倍數(shù)，得到PROD的活力。

1.3.6血糖的檢測 先用上述純化的pET15b-PROD融合蛋白配成檢測血糖的應用液，其中，在50 mmol/L pH8.0的TRIS-HCL緩沖液中，添加終濃度為1 mmol/L 4AA，2 kU/L POD，1 kU/L 抗壞血酸氧化酶，0.01% 曲拉通X-100，0.1%疊氮鈉，攪拌均勻即為R1試劑。在50 mmol/L pH8.0的TRIS-HCL緩沖液中，添加終濃度為10 kU/L PROD，2 mmol/L TOOS，0.01%亞鐵氰化鉀，1%BSA、0.75%EDTA，0.1%疊氮鈉，攪拌均勻即為R2試劑。然后在日立7080生化分析儀上分別用本法和羅氏診斷公司的HK法及GOD法血糖檢測試劑盒檢測上述50例納入研究者空腹時采集的臨床血清標本中血糖的水平。

1.4統(tǒng)計學處理 用SPSS15.0軟件進行統(tǒng)計分析。3種方法檢測血糖用于診斷糖尿病的性能采用受試者工作特征曲線(ROC曲線)進行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1PROD的基因序列 由上海捷瑞生物工程有限公司構建的重組質粒pET15b-PROD經測序可知編碼PROD的基因由1 869個堿基組成，表達623個氨基酸,部分測序圖見圖1。

圖1 PROD部分測序結果

2.2pET15b-PROD融合蛋白的表達 與空質粒和重組質粒誘導前相比較，含有pET15b-PROD融合基因的表達菌BL21經IPTG誘導3 h后在相對分子質量68×103處有一條明顯的蛋白條帶。該菌經超聲離心后在沉淀中此處的條帶很弱，而在上清中較濃，且上清液經Ni柱親和純化后此處的蛋白條帶純度達90%以上，見圖2。

2.3pET15b-PROD融合蛋白的活性 在產生H2O2的反應中，通過檢測得到本批每克純化后的凍干粉中PROD活性超過60×103個單位。

2.43種方法檢測血糖診斷糖尿病的ROC曲線分析 通過繪制ROC曲線可知：GOD法、PROD法及HK法檢測血糖診斷糖尿病的ROC曲線下面積分別為0.994、0.995、0.992(均P=0.000)。根據(jù)約登指數(shù)得知它們檢測空腹血糖診斷糖尿病的最佳臨界點分別為7.16、7.11、7.06 mmol/L。

注：M為蛋白質相對分子質量標準帶；1為空白質粒；2為重組質粒誘導前；3為重組質粒誘導后；4為沉淀；5為上清；6為純化的蛋白

圖2重組質粒pET15b-PROD原核表達產物SDS-PAGE的電泳分析

3 討 論

PROD作為一種氧化還原酶型生物催化劑，在其催化的還原反應中，吡喃醛糖等底物還原FAD形成FADH2和2-酮醛糖，而在其催化的氧化反應中，氧等電子受體接受FADH2的氫產生過氧化氫，但該氧化反應受到pH值的控制，當pH值小于7.6時易于形成C4α-過氧化氫黃素蛋白中間體進而產生過氧化氫[4]。在其還原性底物中，葡萄糖是其最適底物，其Km值為0.83～3.1 mmol/L[1]，且PROD能同時作用于α-和β-D-葡萄糖，而GOD和HK只能作用于β-D-葡萄糖，因此，PROD無需加入變旋酶即可測定標本中葡萄糖水平。除了葡萄糖外，PROD還有一些其他的還原性底物如1,5-AG，半乳糖等。其中，1,5-AG能反映糖尿病患者近期(1 d至1周)的血糖水平，因此，利用PROD檢測葡萄糖水平可實施對糖尿病患者血糖水平的短期監(jiān)控[5-6]。在其氧化性電子受體中，氧是便宜、干凈的電子受體，氧接受電子后生成的過氧化氫，一方面，對木質纖維素的降解有著重要作用，另一方面，人們可利用該反應制成生物傳感器或生物燃料電池[7-10]。此外，PROD除了催化吡喃醛糖C2位氧化，還可催化其C3位氧化，制備一些稀有的糖類如塔格糖等[11]。正由于該酶在臨床檢驗、生物工程及有機化學合成等方面的應用，近年來越來越受到重視。

目前，PROD可通過真菌類微生物如Trametes multicolor提取獲得，但其產量低、純化工藝繁雜，因此，通過基因工程大量獲取高純度的PROD仍是首選。為此，構建優(yōu)良的PROD生產菌株尤為重要。參考相關文獻，本研究所表達的PROD由623個氨基酸組成。其中，167號組氨酸通過N3與FAD的C8位甲基共價連接，由452～457氨基酸殘基構成的環(huán)是葡萄糖等底物結合位點[1]，166號蘇氨酸、448號谷胺酰胺、545號和547號亮氨酸及593號天冬酰胺都與氧的反應性密切相關[12]，另外，593號天冬酰胺也與PROD對底物的C2氧化功能有關[13]。在誘導表達時，通常低溫能增加可溶性蛋白的表達，減少包涵體的形成[14]。因此，本課題組直接選擇20 ℃誘導表達，SDS-PAGE電泳顯示，PROD主要以可溶性蛋白表達為主，表達量達到200 mg/L，這避免了蛋白以包涵體出現(xiàn)而活性不佳的情況。因融合蛋白帶有6個His標簽，因此，本課題組采用Ni2+親和層析柱親和純化蛋白，在純化過程中，發(fā)現(xiàn)含500 mmol/L咪唑的洗脫液能很好地去除雜蛋白。此外，由于FAD是PROD的輔酶，對其催化功能至關重要[1]，因此，本課題組在整個純化和脫鹽過程中均通過添加FAD保證其良好的活性，收獲的凍干粉中每克PROD活性超過60×103個單位，遠高于其他試劑原料商每克10×103個單位，這是由于本課題組在整個生產過程中實驗條件得到了很好的優(yōu)化。用此高活性蛋白配制的應用液和GOD法及HK法血糖檢測試劑盒檢測血糖，其ROC曲線下的面積均大于0.99，根據(jù)約登指數(shù)得到的診斷糖尿病的空腹血糖的臨界值均與WTO確診糖尿病的空腹血糖值7.0 mmol/L相接近，這表明本法與GOD法和HK法一樣，在檢測血糖診斷糖尿病方面具有很好的診斷效能，可用于血糖的檢測。同時，也說明該融合蛋白帶有的His標簽并未影響其功能[15]。后期該菌株經100升發(fā)酵罐放大培養(yǎng)得到約14克活性蛋白，故可批量生產以滿足試劑廠商原料要求。

4 結 論

本研究生產的pET15b-PROD融合蛋白可溶、純度優(yōu)、活性強、產量高。該法測定血糖診斷糖尿病時，與GOD法和HK法一樣，具有很高的準確性，可用于血糖的檢測。在此研究之上可進一步優(yōu)化條件使之應用于臨床標本中1,5-AG的檢測。