韓志興，趙玉千，劉慶軍，紀世琪，張海建

首都醫(yī)科大學附屬北京地壇醫(yī)院泌尿外科，北京100015 0

流行病學研究表明，中國部分地區(qū)膀胱癌的發(fā)病率具有明顯上升趨勢[1]。臨床上膀胱癌的發(fā)生，能夠?qū)е禄颊呖傮w生活水平下降[2-3]。在探討膀胱癌病情進展的相關(guān)生物學機制的過程中，可以發(fā)現(xiàn)不同的細胞因子的改變，能夠通過影響信號通路的激活干預腫瘤細胞的能量代謝等過程，進而促進膀胱癌的病情進展。線粒體融合蛋白2（mitofusion 2，MFN2）的表達上調(diào)，能夠促進線粒體膜的融合，抑制腫瘤細胞的能量合成和代謝，進而抑制上皮細胞的增殖，促進上皮細胞的凋亡[4]；Bmi-1是多巰基家族相關(guān)成員，其能夠通過影響腫瘤細胞的細胞核DNA末端端粒結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，促進腫瘤細胞持續(xù)性增殖，并能夠引起腫瘤細胞的分化障礙[5]。為了進一步揭示MFN2、Bmi-1表達與膀胱癌的關(guān)系，從而為臨床上膀胱癌患者的診療提供理論基礎，本研究選取了80例膀胱癌組織，探討MFN2、Bmi-1在膀胱癌患者病灶組織中的表達情況，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料選取

選取2015年1月至2018年1月在首都醫(yī)科大學附屬北京地壇醫(yī)院保存的膀胱癌組織標本。納入標準：①均經(jīng)病理學檢查確診為膀胱癌；②術(shù)前未行放化療等抗腫瘤治療；③臨床資料保存完整。排除標準：合并有其他惡性腫瘤。根據(jù)納入、排除標準，共選取膀胱癌組織80例，另選取正常膀胱組織80例作對照。80例膀胱癌組織所屬患者中，男53例，女27例；年齡為45～78歲，平均年齡為（60.21±8.91）歲。80例正常膀胱組織所屬患者中，男50例，女30例；年齡為43～79歲，平均年齡為（59.41±10.32）歲。兩組患者的性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05），具有可比性。

1.2 免疫組化檢測方法

采用石蠟進行連續(xù)性切片，脫蠟至水后采用H2O2室溫下孵育10 min。磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5 min。8%的蛋白粉封閉液（購自南京碧云天生物科技公司），封閉2 h。棄封閉液后加入一抗（兔來源一抗?jié)舛?∶1000，4℃冰箱過夜，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5 min；加入二抗（鼠來源二抗?jié)舛?∶400），室溫孵育20～30 min。磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5 min。加入辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶的標志物，室溫孵育10 min。磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5 min。滴加顯色劑二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）（購自南京碧云天生物科技公司），復染，脫水，封片。

1.3 結(jié)果判斷

MFN2蛋白陽性表現(xiàn)為細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒，Bmi-1蛋白陽性表現(xiàn)為細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒。染色強度：無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞比例：﹤26%為1分，26%～50%為2分，﹥50%為3分。根據(jù)染色強度和陽性細胞比例之和判定，得分≥3分為陽性表達，﹤3分為陰性表達。

1.4 觀察指標

比較膀胱癌組織和正常膀胱組織中MFN2、Bmi-1蛋白的表達情況，分析MFN2、Bmi-1蛋白表達與膀胱癌患者臨床特征的關(guān)系，膀胱癌組織MFN2蛋白與Bmi-1蛋白表達的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)性分析。P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌組織與正常膀胱組織中MFN 2、Bmi- 1蛋白陽性表達率比較

膀胱癌組織中MFN2和Bmi-1蛋白的陽性表達率分別為52.50%（42/80）和61.25%（49/80），均高于正常膀胱組織的12.50%（10/80）和17.50%（14/80），差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=29.174、32.073，P﹤0.05）。

2.2 不同臨床特征的膀胱癌患者膀胱癌組織中MFN 2、Bmi- 1蛋白陽性表達率比較

TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者膀胱癌組織中MFN2蛋白的陽性表達率明顯高于TNM分期為Ⅲ期的患者（χ2=15.402，P﹤0.01）；不同年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的患者膀胱癌組織中MFN2蛋白的陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05）。腫瘤直徑﹥3 cm、TNM分期為Ⅲ期的患者膀胱癌組織中Bmi-1蛋白的陽性表達率均明顯高于腫瘤直徑≤3 cm、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期的患者（χ2=19.771、10.963，P﹤0.01）；不同年齡、性別、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的患者膀胱癌組織中Bmi-1蛋白的陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P﹥0.05）。（表1）

2.3 膀胱癌組織中MFN 2與Bmi- 1蛋白表達的相關(guān)性分析

表1 不同臨床特征的膀胱癌患者膀胱癌組織中MFN 2、Bmi- 1蛋白陽性表達情況（ n=80）

經(jīng)Spearman秩相關(guān)性分析，膀胱癌組織中MFN2蛋白表達與Bmi-1蛋白表達呈負相關(guān)（r=-0.602，P﹤0.01）。（表2）

3 討論

膀胱上皮細胞惡性腫瘤的發(fā)生主要考慮與長期吸煙導致的上皮細胞惡性病變，或者家族性遺傳易感基因的攜帶有關(guān)。膀胱癌的發(fā)生發(fā)展，能夠?qū)е禄颊吒吣[瘤臨床負荷的出現(xiàn)，增加了患者近期病情進展的風險[6-7]?，F(xiàn)階段臨床上缺乏對膀胱癌早期診斷的可靠的血清學腫瘤指標，而本研究對于相關(guān)患者體內(nèi)MFN2、Bmi-1表達的分析研究，不僅能夠揭示膀胱癌的發(fā)生發(fā)展機制，還能夠為臨床上膀胱癌血清學腫瘤指標的診斷提供參考。

表2 膀胱癌組織中MFN2與Bmi-1蛋白的表達情況（n=80）

MFN2不僅能夠通過降低鳥苷三磷酸（guanosine triphosphate，GTP）酶的活性降低上皮腫瘤細胞對腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）能量利用的能力，抑制腫瘤細胞的增殖，還能夠通過影響核基因轉(zhuǎn)錄上游的轉(zhuǎn)錄盒的開放閱讀程度，降低轉(zhuǎn)錄激活程度，進而降低膀胱上皮細胞核基因異常突變和轉(zhuǎn)錄的風險。Bmi-1是多巰基相關(guān)蛋白，能夠通過對腫瘤細胞表面配體蛋白末端結(jié)構(gòu)的巰基化修飾作用，提高腫瘤干細胞持續(xù)性自我擴增的能力。Bmi-1的表達上調(diào)能夠?qū)е履[瘤細胞干性特征的顯著增強，促進腫瘤細胞的復發(fā)和轉(zhuǎn)移等病理過程。Bmi-1的表達上調(diào)能夠影響端粒酶的活性及其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，導致腫瘤細胞增殖負性調(diào)控障礙。

本研究探討了MFN2和Bmi-1在膀胱癌患者中的表達情況，發(fā)現(xiàn)在膀胱癌組織中MFN2和Bmi-1的陽性表達率均明顯上調(diào)，提示MFN2和Bmi-1陽性表達均能夠參與膀胱癌的病情進展過程。這主要與MFN2和Bmi-1的下列兩個方面的作用機制有關(guān)：①MFN2表達上調(diào)，主要是由于腫瘤細胞異常增殖過程中線粒體融合程度增加，導致MFN2的反應性升高；②Bmi-1表達上調(diào)，主要是由于腫瘤細胞端粒酶活性改變，影響多巰基化修飾過程。白云等[8]也認為，在膀胱癌患者病灶組織中MFN2的表達水平明顯升高，特別是在膀胱癌遠期生存預后較差的患者中MFN2的表達水平可進一步的上升。免疫組化染色分析研究可見，MFN2和Bmi-1的表達主要定位于腫瘤細胞間質(zhì)成分，推測MFN2和Bmi-1的表達能夠影響腫瘤細胞間信號通路的傳遞或者腫瘤細胞膜內(nèi)相關(guān)因子的激活，進而發(fā)揮其病理性作用。在探討MFN2和Bmi-1的表達與膀胱癌患者臨床特征的關(guān)系過程中，可以發(fā)現(xiàn)在臨床分期較早的患者中，MFN2蛋白的陽性表達率較高，這主要是由于MFN2表達能夠調(diào)控腫瘤細胞線粒體酶的穩(wěn)定性，抑制因線粒體酶的過度激活導致的腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。但本研究并未發(fā)現(xiàn)MFN2的表達與膀胱癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或者分化程度的關(guān)系，提示MFN2的表達并不能影響腫瘤細胞的分化程度或者對淋巴結(jié)組織的黏附能力；在臨床分期較晚或者腫瘤病灶直徑較大的患者中，Bmi-1蛋白的陽性表達率較高，提示Bmi-1蛋白的表達與膀胱癌患者的臨床特征有關(guān)，這主要是由于Bmi-1的表達能夠提高腫瘤細胞的浸潤程度，促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，進而提高膀胱癌的臨床分期。最后，本研究還發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織中MFN2、Bmi-1蛋白表達呈負相關(guān)，提示二者在促進膀胱癌病情進展的過程中可能發(fā)揮了一定的作用。

綜上所述，膀胱癌患者的MFN2、Bmi-1蛋白的陽性表達率均明顯升高，同時MFN2蛋白陽性表達情況與TNM分期有關(guān)，Bmi-1蛋白陽性表達情況與腫瘤直徑、TNM分期有關(guān)。后續(xù)臨床相關(guān)研究可以探討MFN2、Bmi-1的表達與膀胱癌臨床預后的關(guān)系。