王曉蘭，姚嵐，巴金玲，姜言林，劉濤，吳彬，曹銘謙，張殿龍

大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院乳腺甲狀腺外科，遼寧大連1160010

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性的生命健康，臨床主要采取手術(shù)、放化療、內(nèi)分泌治療、生物治療和免疫治療等的綜合治療措施進(jìn)行治療，但乳腺癌具有高度異質(zhì)性，不同組織學(xué)分型乳腺癌患者的治療方法及預(yù)后明顯不同[1]。研究顯示，熱休克轉(zhuǎn)錄因子1（heat shock transcription factor 1，HSF1）的表達(dá)水平與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。HSF1可在生理病理性應(yīng)激條件下快速轉(zhuǎn)錄激活，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，增強(qiáng)細(xì)胞凋亡抗性[3]。但HSF1是否可作為乳腺癌治療靶點尚未達(dá)成一致，為探討HSF1在不同乳腺癌組織學(xué)分型中的表達(dá)及其對預(yù)后的預(yù)測作用，本研究回顧性分析乳腺癌患者的臨床資料，并取石蠟標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色檢測HSF1的表達(dá)水平，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2009年2月至2012年2月大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院收治的乳腺癌患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《現(xiàn)代腫瘤學(xué)》[4]關(guān)于乳腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)病理證實為乳腺癌；②女性；③有石蠟標(biāo)本存檔，臨床資料和隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①繼發(fā)性乳腺惡性腫瘤患者；②病理活檢前接受放化療患者；③長期服藥患者，隨訪期間意外死亡的患者。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入364例乳腺癌患者。根據(jù)雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）的表達(dá)水平差異將364例乳腺癌患者分為Luminal A型組100例、Luminal B型組120例、HER2型組54例及三陰性組90例，4組乳腺癌患者的年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤大小等基本臨床特征比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P﹥0.05）（表1）。

1.2 主要試劑

表1 4組乳腺癌患者的基本臨床特征

免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑均購自北京中山生物技術(shù)有限公司，鼠抗人HSF1、鼠抗人熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）單抗、兔抗人抗凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤因子-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、兔抗人巨噬細(xì)胞移動抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）、兔抗人Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X，BAX）單抗均購自上海優(yōu)寧維生物科技有限公司，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）購自杭州科易生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測

采用免疫組織化學(xué)染色法檢測乳腺癌組織中HSF1、HSP70、Bcl-2、MIF和BAX的表達(dá)情況。取經(jīng)10%福爾馬林固定和石蠟包埋的乳腺癌患者病理標(biāo)本，切片，厚度約3 μm，然后常規(guī)脫蠟脫水，采用檸檬酸鹽緩沖液高壓抗原修復(fù)3 min，并于室溫下采用0.3%雙氧水處理20 min，PBS沖洗，胎牛血清室溫封閉35 min。分別加入鼠抗人HSF1、HSP70，兔抗人Bcl-2、MIF和BAX單抗，4℃冰箱孵育過夜，PBS沖洗，加入生物素標(biāo)記的二抗（其中HSF1、HSP70加入鼠二抗，而Bcl-2、MIF、BAX加入兔二抗），均室溫孵育30 min，PBS沖洗，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，室溫孵育30 min，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。此外，取同一乳腺癌組織標(biāo)本切片作為空白對照，PBS代替一抗。顯微鏡下觀察乳腺癌組織中HSF1、HSP70、Bcl-2、MIF和BAX的表達(dá)情況。

1.4 觀察指標(biāo)和評價方法

采用電話隨訪的方法對所有乳腺癌患者進(jìn)行為期5年的隨訪，無失訪發(fā)生，比較各組患者的生存率。

顯微鏡下觀察細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顆粒為陽性，高倍鏡下任選10個不同視野，計數(shù)陽性和陰性細(xì)胞數(shù)，計算陽性細(xì)胞率，陽性細(xì)胞率=陽性細(xì)胞數(shù)/（陽性細(xì)胞數(shù)+陰性細(xì)胞數(shù)）×100%。其中陽性細(xì)胞率﹤1%記為0分，≥1%且﹤25%記為1分，≥25%且﹤50%記為2分，≥50%且﹤75%記為3分，≥75%記為4分；高倍鏡下觀察乳腺癌組織著色深淺，若不染色則為0分，淡黃色染色為1分，棕黃色染色為2分，棕褐色染色為3分。計算上述兩項評分的乘積，0～3分為陰性表達(dá)，4～12分為陽性表達(dá)，比較4組不同分子分型的乳腺癌患者腫瘤組織中HSF1、HSP70、Bcl-2、MIF和BAX的表達(dá)情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 15.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料采用例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；等級資料比較采用秩和檢驗；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存率的比較采用Log-rank檢驗。以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HSF 1、HSP70、Bcl- 2、MIF和BAX表達(dá)情況的比較

4組乳腺癌患者乳腺癌組織中HSF1、HSP70、Bcl-2、MIF和BAX陽性表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=16.756、24.912、17.416、45.387、59.724，P﹤0.01）。Luminal A型組和Luminal B型組患者乳腺癌組織中HSF1、HSP70、Bcl-2和MIF的陽性表達(dá)率均低于HER2型組和三陰性組患者，BAX陽性表達(dá)率均高于HER2型組和三陰性組患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05）；但Luminal A型組與Luminal B型組患者、HER2型組與三陰性組患者間HSF1、HSP70、Bcl-2、MIF和BAX的陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P﹥0.05）。（表2）

2.2 卵巢癌組織中 HSF 1與 HSP70、Bcl- 2、MIF和BAX表達(dá)的相關(guān)性

表2 4組患者乳腺癌組織中HSF 1、HSP70、Bcl- 2、MIF和BAX陽性表達(dá)情況的比較[ n（%）]

Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，乳腺癌組織中HSF1與 HSP70的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.356，P=0.018），HSF1與Bcl-2的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.389，P=0.016），HSF1與MIF的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.476，P=0.012），HSF1與BAX的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.432，P=0.010）。

2.3 生存情況

HSF1陰性表達(dá)患者的5年生存率54.24%（64/118），明顯高于HSF1陽性表達(dá)患者的18.29%（45/246），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=49.116，P﹤0.01）。（圖1）

3 討論

圖1 HSF 1陰性表達(dá)（ n=118）和HSF 1陽性表達(dá)（ n=246）乳腺癌患者的生存曲線

乳腺癌是發(fā)生于乳腺上皮的惡性腫瘤，早期無典型的臨床癥狀和體征，通常經(jīng)體檢或乳腺癌篩查發(fā)現(xiàn)。乳腺癌的組織形態(tài)、生物學(xué)行為、免疫表型及治療反應(yīng)的差異較大，且腫瘤組織中各種因子表達(dá)水平的差異也可影響乳腺癌患者的治療及預(yù)后[5]。有研究表明，HSF1與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥密切相關(guān)[6-8]，且HSF1在乳腺癌組織中呈高表達(dá)[9]。本研究分析HSF1在不同分子分型乳腺癌中的表達(dá)及其對預(yù)后的影響，探討其是否可作為指導(dǎo)乳腺癌治療及預(yù)測預(yù)后的指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，Luminal A型和Luminal B型組患者乳腺癌組織中HSF1陽性表達(dá)率，均低于HER2型和三陰性組患者，表明HSF1在HER2型和三陰性乳腺癌中高表達(dá)，在Luminal A型和Luminal B型乳腺癌中低表達(dá)。ER和PR均是正常乳腺上皮細(xì)胞中存在的性激素受體，可對乳腺生長、發(fā)育和細(xì)胞增殖進(jìn)行調(diào)控，癌變時ER和PR減少，腫瘤組織的生長和腫瘤細(xì)胞的增殖缺少內(nèi)分泌激素的調(diào)控，導(dǎo)致腫瘤分化程度低，預(yù)后較差[10]。HSF1是轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，存在于真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)分子中，結(jié)構(gòu)及功能高度保守，可促進(jìn)機(jī)體發(fā)育并維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，其表達(dá)及活性異常與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，腫瘤惡性程度越高，HSF1表達(dá)水平越高[11]。研究顯示，ER和PR表達(dá)陰性的子宮內(nèi)膜腺癌組織中HSF1的表達(dá)水平高于ER和PR表達(dá)陽性的子宮內(nèi)膜腺癌組織[12]，與本研究結(jié)果一致，表明惡性腫瘤患者，HSF1表達(dá)水平可能受分子分型的影響，推測ER、PR可能對HSF1具有調(diào)控作用，但仍需要進(jìn)一步探討。

本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中HSF1與HSP70、Bcl-2和MIF的表達(dá)均呈正相關(guān)，與BAX的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，且HSF1陰性表達(dá)患者的5年生存率明顯高于HSF1陽性表達(dá)的患者，表明HSF1表達(dá)對預(yù)測乳腺癌患者預(yù)后的價值較高。HSP70在進(jìn)化中高度保守，可在細(xì)胞受到感染、高熱、缺血缺氧和化學(xué)物質(zhì)等的刺激后迅速合成釋放，促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)和內(nèi)環(huán)境恢復(fù)穩(wěn)定狀態(tài)，并有助于細(xì)胞存活，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[13]。HSF1是HSP表達(dá)的主要調(diào)控因子，也是HSP基因轉(zhuǎn)錄關(guān)鍵因子，機(jī)體處于熱應(yīng)激或其他應(yīng)激刺激時，HSF1可被迅速激活，與位于熱激蛋白基因啟動子上的熱激元件形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，并促進(jìn)HSP70的轉(zhuǎn)錄[14]。Bcl-2是抗凋亡蛋白，可阻斷細(xì)胞因各種因素誘發(fā)的程序性死亡，在多種腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，提高腫瘤細(xì)胞的抗凋亡作用。Granato等[15]研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制HSF1的表達(dá)，可抑制Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。BAX是促凋亡蛋白，不僅可促進(jìn)細(xì)胞自發(fā)凋亡，還可促進(jìn)不同因素誘發(fā)的細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤組織的發(fā)生發(fā)展，在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平較低。研究發(fā)現(xiàn)，HSF1可抑制BAX的表達(dá)，BAX的表達(dá)水平降低可影響患者對化療的敏感性，影響藥物發(fā)揮作用[16]，表明HSF1可能與BAX的表達(dá)密切相關(guān)。MIF是一種T淋巴細(xì)胞因子，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散、侵襲和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤組織的發(fā)生發(fā)展。研究顯示，MIF和HSF1相互作用，促進(jìn)HER2型乳腺癌的惡性轉(zhuǎn)化[17]。由此可見，HSF1在乳腺癌組織中的表達(dá)可能通過某種或某些機(jī)制影響HSP70、Bcl-2、MIF和BAX的表達(dá)，從而影響乳腺癌患者的預(yù)后。

綜上所述，HSF1在HER2型及三陰性乳腺癌中高表達(dá)，在Luminal A型和Luminal B型乳腺癌中低表達(dá)，且HSF1陰性表達(dá)的乳腺癌患者的生存時間明顯延長，表明HSF1可能通過影響HSP70、Bcl-2、BAX和MIF的表達(dá)從而影響乳腺癌患者的預(yù)后，可能作為此類患者臨床治療的新靶點，且對預(yù)后的預(yù)測價值較高。但關(guān)于HSF1影響HSP70、Bcl-2、BAX和MIF表達(dá)的機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。