張小三，張一鳴，趙燕，戚春暉，楊樹軍#

1鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院/河南省腫瘤醫(yī)院內(nèi)科，鄭州 450008

2鄭州第七人民醫(yī)院兒科，鄭州 450006 00

食管癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，預(yù)后較差，轉(zhuǎn)移較早，早期癥狀不明顯，大部分患者就診時(shí)已出現(xiàn)了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[1]，因此，探究早預(yù)防、早發(fā)現(xiàn)、早治療的方法成為食管癌相關(guān)科研工作中需要不斷探索的課題。研究表明，磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，也稱AKT）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能夠通過影響下游多種分子的活化狀態(tài)而對腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)[2]。也有研究報(bào)道稱PI3K/AKT信號通路與腫瘤微淋巴管的形成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。但是，關(guān)于PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白在食管癌組織中的表達(dá)情況與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系的相關(guān)研究目前尚未見報(bào)道。微淋巴管密度（lymphatic microvessel density，LMVD）指的是單位視野中微淋巴管的數(shù)量。有研究顯示，在胃癌組織中，LMVD是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要因素，即LMVD的增加有利于胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，分析其原因可能是因?yàn)槲⒘馨凸軘?shù)量的增加使腫瘤和淋巴管內(nèi)皮接觸的面積增大，從而促使腫瘤細(xì)胞更容易進(jìn)入淋巴管發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[4]。本研究通過免疫組織化學(xué)法檢測PI3K和AKT蛋白在食管癌組織中的表達(dá)情況，并分析PI3K和AKT蛋白表達(dá)與食管癌患者臨床特征以及LMVD的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2017年4月至2018年2月鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院/河南省腫瘤醫(yī)院收治的術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為食管癌的120例患者的組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理組織學(xué)檢查證實(shí)為食管癌；②術(shù)前未行靶向治療、放療、化療或者免疫治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重的心、肺疾?。虎谛g(shù)前行新輔助放化療、靶向治療。120例食管癌患者中，男70例，女50例；年齡40～79歲，平均年齡為（48.87±9.45）歲；按照國際抗癌聯(lián)盟TNM分期第8版[5]：Ⅰ+Ⅱ期64例，Ⅲ+Ⅳ期56例；組織分化程度：高分化40例，中分化50例，低分化30例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移68例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例。同時(shí)收集上述患者癌旁（距腫瘤邊緣﹥2 cm）經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)的120例食管正常黏膜組織標(biāo)本作為對照?；颊呒凹覍倬鶎Ρ狙芯恐橥獠⒑炇鹬橥鈺狙芯拷?jīng)過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過。

1.2 主要抗體和試劑盒

兔抗人PI3K多克隆抗體、兔抗人AKT多克隆抗體、D2-40單克隆抗體均購自北京奧維亞生物技術(shù)有限公司，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒、免疫組織化學(xué)試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色方法

對所有組織標(biāo)本采用10%中性福爾馬林溶液固定，常規(guī)取材，石蠟包埋。后將蠟塊進(jìn)行切片，置入40%的乙醇中，然后置于40℃水浴鍋中水浴4 min，進(jìn)行展開，然后置于60℃烘箱內(nèi)烘干。采用二甲苯脫蠟20 min，然后采用梯度乙醇進(jìn)行水化，對PI3K、AKT、D2-40蛋白進(jìn)行高溫高壓組織修復(fù)，然后加入3%過氧化氫溶液，室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）進(jìn)行沖洗，加入5%羊血孵育30 min，除去封閉液，加入一抗，置于4℃冰箱過夜，PBS沖洗，DAB顯色，然后使用PBS沖洗終止顯色，使用自來水沖洗，鹽酸乙醇分化，乙醇脫水干燥。對PI3K和AKT蛋白表達(dá)情況進(jìn)行判定。

1.4 判定標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1 PI 3 K和AKT陽性判定標(biāo)準(zhǔn)[6]PI3K和AKT蛋白均表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，陽性染色結(jié)果表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。采用染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占百分比兩項(xiàng)評分總分判定PI3K和AKT蛋白是否陽性表達(dá)。依據(jù)染色強(qiáng)度評分：無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。依據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比評分：陽性細(xì)胞﹤10%記為0分；陽性細(xì)胞所占百分比為10%～20%記為1分；陽性細(xì)胞所占百分比為21%～50%記為2分；陽性細(xì)胞所占百分比﹥50%記為3分。最終得分為染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占百分比評分之和，﹥2分為陽性表達(dá)，≤2分為陰性表達(dá)。

1.4.2 LMVD計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)[7]D2-40表達(dá)定位于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，呈棕黃色或棕褐色顆粒，先在低倍鏡下選取微淋巴管染色豐富的區(qū)域，然后在高倍鏡下每個(gè)區(qū)域中選取5個(gè)視野（每個(gè)視野0.16 mm2）分別計(jì)算微淋巴管數(shù)目，取平均值作為LMVD。含有平滑肌或﹥8個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞的管腔及未染色的管腔均不記數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中PI 3 K和AKT蛋白表達(dá)情況的比較

食管癌組織中PI3K和AKT蛋白的陽性表達(dá)率分別為85.0%（102/120）和86.7%（104/120），均明顯高于癌旁食管正常黏膜組織中的4.2%（5/120）和5.8%（7/120），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=158.679、157.704，P﹤0.01）。（表1、圖1）

表1 食管癌組織和癌旁食管正常黏膜組織中PI 3 K和AKT蛋白的表達(dá)情況[ n（%）]

圖1 PI 3 K和AKT在食管癌組織和癌旁食管正常黏膜組織中的表達(dá)情況（免疫組化染色，×200）

2.2 食管癌組織中PI 3 K和AKT蛋白表達(dá)情況與食管癌患者臨床特征的關(guān)系

不同性別、組織分化程度食管癌患者食管癌組織中PI3K、AKT蛋白的陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期食管癌患者的食管癌組織中PI3K蛋白的陽性表達(dá)率均明顯高于無淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅰ+Ⅱ期的食管癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.232、10.756，P﹤0.01）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期的食管癌患者食管癌組織中AKT蛋白的陽性表達(dá)率均高于無淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分期為Ⅰ+Ⅱ期的食管癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.809、5.781，P﹤0.05）。（表2）

2.3 食管癌組織中LMVD與PI 3 K、AKT蛋白表達(dá)的關(guān)系

PI3K蛋白陽性表達(dá)食管癌組織中LMVD為（13.92±3.02），明顯高于PI3K蛋白陰性表達(dá)食管癌組織的（6.54±1.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.228，P﹤0.01）；AKT蛋白陽性表達(dá)食管癌組織中LMVD的數(shù)量為（13.84±3.08），明顯高于AKT蛋白陰性表達(dá)食管癌組織的（6.14±0.89），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.904，P﹤0.01）。

表2 不同臨床特征食管癌患者食管癌組織中PI 3 K、AKT蛋白的陽性表達(dá)情況（ n=120）

3 討論

作為世界上高發(fā)的惡性腫瘤之一，食管癌在中國腫瘤發(fā)病率中排名第5位，病死率中排名第4位，隨著人們生活節(jié)奏的不斷加快，飲食不規(guī)律的現(xiàn)象逐漸增多，因此，食管癌的發(fā)病率也呈逐年增加態(tài)勢。并且，因早期食管癌的臨床癥狀不明顯，患者往往于就診時(shí)已出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，大大增加了患者的病死率[8]。

PI3K是一種胞內(nèi)的磷脂酰肌醇激酶，參與多種生長因子的活化；AKT作為一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，能夠直接對多種轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行磷酸化，從而參與生命活動的調(diào)節(jié)進(jìn)程[9]。研究表明，PI3K/AKT信號通路不僅參與腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)，還與腫瘤微淋巴管的生成和侵襲密切相關(guān)[10]，目前已經(jīng)成為了腫瘤靶向治療研究的熱點(diǎn)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，PI3K在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)率高于癌旁組織，且PI3K的表達(dá)與TNM分期、腫瘤大小密切相關(guān)，而與患者的年齡無關(guān)[9]。Yamamoto等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞中，PI3K/AKT信號通路激活抑制了細(xì)胞周期蛋白的降解，促進(jìn)了G0期細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期（S期），從而促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的異常增殖。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測食管癌和癌旁正常黏膜組織中PI3K和AKT蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，食管癌組織中PI3K和AKT蛋白的陽性表達(dá)率均明顯高于癌旁食管正常黏膜組織（P﹤0.01），提示PI3K/AKT信號通路在食管癌的發(fā)生過程中起著重要的作用。

有研究表明，PI3K/AKT信號通路能夠直接或間接地促進(jìn)腫瘤新生血管的生成，在惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的進(jìn)程中發(fā)揮著極其重要的作用[12]。也有研究認(rèn)為PI3K/AKT信號通路參與了淋巴管的生成，從而參與了腫瘤淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移進(jìn)程[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白陽性表達(dá)食管癌組織中的LMVD分別高于PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白陰性表達(dá)食管癌組織，推測PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白在食管癌淋巴管的生成方面可能起著關(guān)鍵作用；同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移食管癌患者食管癌組織中的PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白陽性表達(dá)率均高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管癌患者（P﹤0.05），TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期食管癌組織中的PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白陽性表達(dá)率均高于TNM分期為Ⅰ+Ⅱ期的食管癌患者（P﹤0.05），推測PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白在促進(jìn)食管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面也起著至關(guān)重要的作用。

綜上所述，PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白在食管癌發(fā)生和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中均起著至關(guān)重要的作用，阻斷該信號通路的某一環(huán)節(jié)，可能成為食管癌的新的治療靶點(diǎn)。