謝 娟，丁 浩，曹東升，方 穎，呂 陽

糖尿病足潰瘍(diabetic foot ulcer，DFU)是臨床上常見的難治性創(chuàng)面之一，其組織活力差，感染不易控制，容易引起危及生命的惡性結(jié)果，如截肢或敗血癥等。因此，在全球范圍內(nèi)，DFU的感染、壞死的控制及組織的修復(fù)已成為世界公共衛(wèi)生的難題[1]。目前糖尿病足潰瘍的臨床治療是在全面清創(chuàng)的基礎(chǔ)上，采用封閉式負(fù)壓引流裝置，其所形成的負(fù)壓環(huán)境減少了組織的水腫并增加了創(chuàng)面中的血液灌注。但對于糖尿病足潰瘍同時(shí)存在末梢血管、神經(jīng)的病變及基礎(chǔ)代謝的紊亂，使局部炎癥修復(fù)細(xì)胞分泌功能障礙，各種生長因子的供應(yīng)不足限制了潰瘍愈合的能力[2]。自體富血小板凝膠(autologous platelet-rich gel，APG)系取自患者自身外周靜脈血，經(jīng)離心處理后與鈣離子和凝血酶激活后可釋放各種類型生長因子，有利于損傷組織修復(fù)再生，研究[3]顯示可用于頜面外科、整形外科、骨科。該研究探討自體富血小板凝膠聯(lián)合封閉負(fù)壓引流(vacuum sealing drainage，VSD)治療糖尿病足的療效是否比單一使用封閉負(fù)壓引流更有效。

1 材料與方法

1.1病例資料本研究納入60例2016年～2018年于安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院整形外科接診的DFU患者。 其中男39例，女21例。排除糖尿病急性并發(fā)癥、合并嚴(yán)重心、肺、肝、腎或血液系統(tǒng)疾病，伴有惡性腫瘤，患有嚴(yán)重精神疾病且無法配合治療，有自身免疫性疾病或服用免疫抑制劑和激素的患者。將患者隨機(jī)分為兩組：實(shí)驗(yàn)組(VSD+富血小板凝膠組)和對照組(VSD組)，每組30例。實(shí)驗(yàn)組(VSD+富血小板凝膠組)，其中男19例，女11例；對照組(VSD組)，其中男20例，女10例。所有的手術(shù)均由同一個(gè)治療小組完成。本研究已經(jīng)通過本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者自愿參加本研究并簽署知情同意書以保護(hù)患者的隱私。

1.2研究方法

1.2.1基礎(chǔ)治療 所有病例均通過口服降糖藥物或肌注胰島素控制血糖，并嚴(yán)格控制患者飲食。對患者創(chuàng)面經(jīng)嚴(yán)格消毒后行清創(chuàng)術(shù)，去除創(chuàng)面的失活組織及無血供壞死骨，清創(chuàng)過程中應(yīng)由淺入深仔細(xì)進(jìn)行。

1.2.2APG制備的探究 為探究在不同離心速度下APG的提取情況，招募共30名身體健康志愿者自愿提供自身外周靜脈血40 ml，隨機(jī)分為A、B兩組，各15名，將離心方法設(shè)定為方法一：A組以3 000 r/min離心10 min，將上清液吸到邊界層下1 mm，將離心管內(nèi)剩余物質(zhì)轉(zhuǎn)移至另一無菌離心管，再以3 000 r/min離心10 min，用無菌巴氏滅菌管吸出3/4上清液，棄去剩余的1/4下層搖勻獲得為富含血小板血漿(PRP)。方法二：B組先以2 000 r/min離心4 min，再以4 000 r/min離心6 min，方法同前。比較各組全血和PRP的PLT濃度及回收率，得出以下結(jié)果：A組和B組全血中血小板濃度無顯著差異；B組PRP中血小板濃度、回收率均明顯高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)，因此，認(rèn)為B組的方法可獲得更高濃度的富血小板血漿。故本實(shí)驗(yàn)研究中APG凝膠的制備選擇了B組的離心程序。

1.2.3APG制備 取患者自身外周靜脈血40 ml，按照APG制備時(shí)的B組離心方法得到PRP后，將PRP與凝血酶-鈣劑(1 ku/ml)按照10 ∶1的比例同時(shí)打進(jìn)三通注射器中, 待其充分混合后可形成凝固狀態(tài)的APG凝膠后均勻推注至實(shí)驗(yàn)組清創(chuàng)后的潰瘍。

1.2.4分組干預(yù) 實(shí)驗(yàn)組第1個(gè)24 h暫不開放VSD負(fù)壓，僅保持創(chuàng)面封閉狀態(tài)，24 h后開始從-125 mmHg開始使用VSD負(fù)壓。對照組則是創(chuàng)面清創(chuàng)后直接覆蓋VSD材料，生物膜密封覆蓋后即刻開通-125 mmHg負(fù)壓。 使用連續(xù)負(fù)壓抽吸并用外鹽沖洗引流管。對照組每周更換VSD輔料1次，實(shí)驗(yàn)組在更換VSD材料時(shí)給予 APG凝膠治療1次(方法同前)，每次更換VSD材料前，將創(chuàng)面內(nèi)分泌物或組織送細(xì)菌培養(yǎng)，直至患者創(chuàng)面愈合或細(xì)菌定量為陰性。

1.2.5取材及記錄相關(guān)指標(biāo) 分別在3周末及6周末拆除VSD后切取創(chuàng)緣直徑約0.5 cm新生皮膚及皮下肉芽組織，HE染色后在顯微鏡下觀察。每次更換VSD之前，分別實(shí)時(shí)記錄每位患者的潰瘍創(chuàng)面細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果、創(chuàng)面愈合情況和創(chuàng)面愈合時(shí)間。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)，使用t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)比較兩組之間變量的差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組患者基本情況的比較實(shí)驗(yàn)組年齡、糖尿病病程、潰瘍病程、潰瘍面積、WBC平均值、CRP平均值與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)組病原菌感染率80%，對照組病原菌感染率79%。見表2。

表1 兩組不同離心方法之間血小板濃度的比較

表2 實(shí)驗(yàn)組患者及對照組患者基本情況的比較

2.2不同時(shí)間點(diǎn)兩組的治愈率、愈合時(shí)間和細(xì)菌轉(zhuǎn)陰時(shí)間的比較比較兩組患者治療3周末的愈合率，實(shí)驗(yàn)組愈合率40.0%高于對照組愈合率16.7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；比較患者治療6周末的愈合率，實(shí)驗(yàn)組愈合率90.0%高于對照組愈合率63.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以6周末為觀察點(diǎn)，在6周末未愈合創(chuàng)面愈合時(shí)間均按照42 d(6周)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)組潰瘍愈合時(shí)間短于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面細(xì)菌轉(zhuǎn)陰時(shí)間短于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。在6周末觀察期結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)組中有3例未達(dá)到愈合標(biāo)準(zhǔn)，用皮膚抑制物封閉殘留的小傷口，對照組有11名患者未痊愈。在8周末時(shí)達(dá)愈合者3例，剩余8例接受了皮片移植術(shù)。

表3 比較兩組的治愈率、愈合時(shí)間和細(xì)菌轉(zhuǎn)陰時(shí)間

DFU創(chuàng)面愈合為治愈，面積縮小為好轉(zhuǎn)

2.3組織學(xué)觀察分別觀察3周末及6周末創(chuàng)面組織HE染色切片，3周末實(shí)驗(yàn)組與3周末對照組相比新生微血管較多，膠原纖維排列有序。6周末實(shí)驗(yàn)組與6周末對照組相比新生微血管豐富，膠原纖維排列與正常皮膚組織類似，較對照組來說排列更有序(圖1)。

2.4創(chuàng)面愈合情況觀察實(shí)驗(yàn)組：患者，男，63歲，糖尿病病史10年，系左足第二趾破潰10余天入院。治療前創(chuàng)面內(nèi)大量壞死肉芽組織，創(chuàng)面血供較差；APG+VSD治療1周后可見創(chuàng)面內(nèi)不見壞死組織，肉芽生長良好；APG+VSD治療兩周后可見創(chuàng)面基本愈合，表皮逐漸愈合(圖2)。

3 討論

DFU治療的原則是在基礎(chǔ)疾病控制的基礎(chǔ)上，注重創(chuàng)面壞死物的清除，感染的控制及采用各種輔助療法促進(jìn)肉芽生長，上皮的爬行。因此在本次實(shí)驗(yàn)中，對兩組病例在清創(chuàng)的基礎(chǔ)上給予了不同的輔助治療手段。對照組采用VSD負(fù)壓引流治療，實(shí)驗(yàn)組采用APG聯(lián)合VSD治療，3周末實(shí)驗(yàn)組愈合率40.0%明顯高于對照組愈合率16.7%，兩組患者6周末實(shí)驗(yàn)組愈合率90.0%顯著高于對照組愈合率63.3%。同時(shí)比較實(shí)驗(yàn)組和對照組患者的潰瘍愈合時(shí)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組平均愈合時(shí)間(23.73±8.54)d，明顯短于對照組(32.07±8.74)d，與對照組相比，使用APG的實(shí)驗(yàn)組顯著縮短了治療時(shí)間并提高了愈合率。

圖1 兩組DFU在3周末及6周末的組織學(xué)標(biāo)本 HE×100

在對照組中，當(dāng)使用VSD時(shí)，建立的負(fù)壓降低了傷口組織的壓力，并且在負(fù)壓的作用下重新打開了閉塞的微小血管。進(jìn)一步擴(kuò)張微血管，使整個(gè)創(chuàng)面的血流供應(yīng)得到改善[4]，但潰瘍創(chuàng)面內(nèi)肉芽的生長、上皮的爬行，都與各種促細(xì)胞生長因子相關(guān)。VSD改善創(chuàng)面血流的供應(yīng)，僅僅是間接的促進(jìn)生長因子的合成和釋放，并且過程較漫長，尤其對于糖尿病潰瘍，本身存在微血管病變，其對潰瘍創(chuàng)面血運(yùn)的恢復(fù)及改善所需時(shí)間往往更長。實(shí)驗(yàn)組在VSD的基礎(chǔ)上給予了APG凝膠，其富含的多種具有活性的生長因子，如類胰島素樣生長因子( IGF)、轉(zhuǎn)移生長因子-β(TGF-β)、血小板源性生長因子(PDGF)等，通過細(xì)胞因子的活化和趨化作用，可以促進(jìn)細(xì)胞如成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，從而促進(jìn)新生血管的形成，從而加速膠原沉積和組織重建。APG同時(shí)含有大量的纖維蛋白，為成纖維細(xì)胞的爬行和遷移提供了良好的支架，從而加速了創(chuàng)面愈合并控制了瘢痕的生長[5]。

圖2 實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面愈合情況觀察A:治療前；B：APG+VSD治療1周后；C：APG+VSD治療2周后

創(chuàng)面的愈合與感染的控制密不可分，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面細(xì)菌轉(zhuǎn)陰時(shí)間平均為(1.87±1.04)周,明顯短于對照組創(chuàng)面細(xì)菌轉(zhuǎn)陰時(shí)間平均為(3.33±1.06)周。APG中富含單核細(xì)胞和白細(xì)胞，血小板經(jīng)活化后可以釋放出多種抗菌活性物質(zhì)，如血小板殺菌蛋白、組胺、免疫球蛋白等均可起到一定的有效抗感染作用，作為絡(luò)合劑，凝血酶可以將這些活性成分凝結(jié)成附著于潰瘍表面的凝膠狀物質(zhì)，這更有利于肉芽的生長，從而加速潰瘍的愈合[6]。

綜上所述，使用自體富血小板凝膠聯(lián)合封閉負(fù)壓引流治療糖尿病足潰瘍優(yōu)于使用負(fù)壓閉式引流，其縮短了患者的住院周期，減少手術(shù)次數(shù)，可以作為一些合并多種基礎(chǔ)疾病，不耐受或?qū)τ诓辉敢饨邮芷つw移植或皮瓣手術(shù)治療糖尿病足潰瘍的老年患者的治療選擇之一。同時(shí)患者住院時(shí)間及住院費(fèi)用顯著降低，提高了患者的生活質(zhì)量，減輕了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。現(xiàn)臨床上 APG聯(lián)合VSD治療糖尿病足潰瘍的應(yīng)用還未普及，可能的原因是APG的提取率不穩(wěn)定，提取過程需嚴(yán)格按照無菌操作，使制備過程中存在人為誤差和一些損耗，影響了最終治療效果。同時(shí)如何量化APG凝膠的使用，即不同潰瘍面積下的APG凝膠的使用劑量及使用方式，仍有待進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究。