李 磊，陳志武

胃癌發(fā)病率在我國(guó)各種惡性腫瘤中位居首位[1]。幽門螺旋桿菌感染、工作壓力增大以及生存環(huán)境改變等原因使患胃癌的人呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)。很多胃癌早期癥狀不明顯，造成胃癌早期診斷率低下[2]。目前胃癌的治療以手術(shù)切除為主，并輔助放化療治療，所以尋找高效的抗腫瘤藥物尤為重要。侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤治療失敗的主要原因，有效控制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是治療的關(guān)鍵。姜黃素具有抗腫瘤作用，可影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)階段，且?guī)缀鯚o(wú)不良反應(yīng)[3-4]。美國(guó)食品藥品管理局已將其作為21世紀(jì)抗癌新藥[3-4]。該研究以胃癌SGC-7901細(xì)胞株為研究對(duì)象，探討姜黃素對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的影響及其分子機(jī)制，揭示了姜黃素對(duì)胃癌細(xì)胞的作用與作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料TRIzol試劑、RPMI1640培養(yǎng)基、FBS、CCK8均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；姜黃素購(gòu)自上海碧云天生物科技公司；一抗GAPDH、JAK、STAT3及二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；胃癌細(xì)胞SGC-7901購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理首先將復(fù)蘇的胃癌細(xì)胞加入含10%胎牛血清及1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基，放入恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)90%左右時(shí)消化、傳代。將試驗(yàn)細(xì)胞分為4組，每組按照1×104/ml的密度接種，并用不同濃度姜黃素(0、15、25、35 μmol/L)分別處理各組細(xì)胞并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3CCK8法檢測(cè)胃癌細(xì)胞增殖活性姜黃素處理受試細(xì)胞后，選取24 、48 h時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞，用含有10% CCK8的培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定四組受試細(xì)胞的吸光度(optical density，OD)值。

1.4Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞侵襲能力姜黃素處理(0、25、35 μmol/L)胃癌細(xì)胞24 h后，胰酶消化，用不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液加入小室上室，下室加入含有血清的培養(yǎng)液，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，保證每個(gè)小室內(nèi)接種的細(xì)胞數(shù)一致。把細(xì)胞板置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用棉簽擦去上室內(nèi)未穿膜的細(xì)胞后進(jìn)行結(jié)晶紫染色，顯微鏡下隨機(jī)選取每個(gè)膜上的5個(gè)視野計(jì)數(shù)。

1.5劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞遷移能力用姜黃素處理(0、25、35 μmol/L)胃癌細(xì)胞24 h后，將細(xì)胞接種于細(xì)胞板，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)一段時(shí)間。然后采用小槍頭在孔底做劃線處理，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗被劃下的細(xì)胞，加入新的培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后進(jìn)行拍照。

1.6細(xì)胞總RNA的提取及cDNA合成姜黃素處理胃癌細(xì)胞24 h后，將1 ml TRIzol加入每孔細(xì)胞中進(jìn)行裂解，將裂解液轉(zhuǎn)移至EP管，向每管加入200 μl氯仿并搖勻，室溫放置10 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min。吸取上層水相至新的EP管，加入500 μl異丙醇，室溫放置一段時(shí)間后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，所得白色沉淀即為RNA。用75%乙醇洗滌RNA 2次，自然晾干后將RNA溶解于DEPC水中。cDNA合成使用TAKARA的One Step PrimeScript cDNA Synthesis Kit，按照說(shuō)明書指示進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作。

1.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)在ABI 7300 Real-Time PCR System儀器上按照One Step SYBR? PrimeScriptTMRT-PCR Kit(TAKARA)說(shuō)明書進(jìn)行操作，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃、30 s，40個(gè)循環(huán)的95 ℃、5 s及 60 ℃、30 s。GAPDH作為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔΔCt表示。相關(guān)引物序列及產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。

表1 qPCR引物列表

1.8Westernblot實(shí)驗(yàn)姜黃素處理胃癌細(xì)胞24 h后，毎孔中加入200 μl蛋白裂解液，冰上裂解30 min，將裂解液轉(zhuǎn)入EP管中。12 000 r/min離心10 min，取上清液，BCA法測(cè)定總蛋白濃度。每組取等量蛋白樣品加入適量SDS上樣緩沖液，混勻后置于100 ℃水浴鍋中加熱5 min，變性失活。然后進(jìn)行凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉中室溫孵育2 h，封閉完成后孵育一抗(稀釋比為1 ∶1 000)，4 ℃過(guò)夜。次日在室溫下孵育二抗1 h，TBST洗滌3次，用ECL化學(xué)發(fā)光顯色液顯色，凝膠成像設(shè)備進(jìn)行結(jié)果觀察并拍照，Image J軟件進(jìn)行條帶灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1姜黃素抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖活性姜黃素對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖活性的抑制效果見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示：測(cè)試濃度(15～35 μmol/L)下的姜黃素作用24 h和48 h均能顯著抑制胃癌細(xì)胞株SGC-7901的增殖水平(P<0.05)，并呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性，即隨著姜黃素濃度增大，抑制效果增強(qiáng)。

圖1 姜黃素對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞增殖活性的影響

2.2姜黃素抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的侵襲和遷移姜黃素影響胃癌細(xì)胞SGC-7901侵襲和遷移的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示，測(cè)試濃度(25、35μmol/L)的姜黃素對(duì)受試胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移均產(chǎn)生了明顯抑制作用，且隨著姜黃素濃度增大，其抑制效果增強(qiáng)(P<0.05)。

圖2 姜黃素對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901侵襲與遷移能力的影響

2.3姜黃素處理抑制胃癌細(xì)胞增殖相關(guān)熱休克蛋白90(heatshockproteins，HSP90)、賈納斯激酶2(januskinase，JAK2)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signaltransducerandactivatoroftranscription3，STAT3)基因的表達(dá)胃癌細(xì)胞SGC-7901經(jīng)姜黃素處理后，HSP90 mRNA、JAK2 mRNA和STAT3 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平均顯著下降(P<0.05)，且具有明顯的濃度依賴性，即隨著姜黃素處理濃度的增大，其對(duì)細(xì)胞中增殖相關(guān)基因表達(dá)的抑制效果越明顯。見(jiàn)圖3。

圖3 姜黃素對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901中相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.4姜黃素處理抑制胃癌細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白HSP90、JAK2和STAT3的表達(dá)/激活各濃度姜黃素均未顯著影響胃癌細(xì)胞JAK2與STAT3表達(dá)水平(圖4統(tǒng)計(jì)圖中未展示)。25 μmol/L姜黃素處理對(duì)胃癌細(xì)胞中HSP90表達(dá)、JAK2和STAT3的表達(dá)與激活(p-JAK2和p-STAT3)水平?jīng)]有顯著影響。而35 μmol/L姜黃素可導(dǎo)致胃癌細(xì)胞中HSP90表達(dá)水平、JAK2和STAT3激活水平的顯著下調(diào)(P<0.01)。見(jiàn)圖4。

圖4 姜黃素對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

控制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是決定患者預(yù)后狀況的重要因素[5]。阻斷胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移成為目前醫(yī)學(xué)及生命科學(xué)領(lǐng)域急需解決的問(wèn)題。研究[6]顯示，植物中的某些活性化合物，如紫衫烷、姜黃素在腫瘤治療方面發(fā)揮著相關(guān)作用。如在結(jié)腸癌細(xì)胞中，姜黃素衍生物降低了癌細(xì)胞的增殖遷移，促進(jìn)了癌細(xì)胞凋亡[7]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了不同濃度姜黃素對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖的影響。結(jié)果表明，姜黃素顯著抑制了癌細(xì)胞的增殖，且濃度增加，抑制效果越強(qiáng)。Transwell和劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示，姜黃素也對(duì)受試胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移具有顯著抑制作用，且呈現(xiàn)濃度依賴性。這與之前的報(bào)道相一致[7-8]。

癌癥的發(fā)生發(fā)展是多因素參與的復(fù)雜過(guò)程。其中，癌細(xì)胞中增殖相關(guān)信號(hào)通路的異常激活發(fā)揮著重要作用，而其顯著特點(diǎn)是關(guān)鍵蛋白表達(dá)與激活水平的升高[1-2]。JAK2/STAT3 信號(hào)通路在多種腫瘤中都有激活。STAT3經(jīng)磷酸化的方式活化后進(jìn)入胞核參與調(diào)控多種基因的表達(dá)，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和血管生成等。抑制JAK活性可抑制STAT3核轉(zhuǎn)位與腫瘤形成。本研究顯示，姜黃素處理組(特別是35 μmol/L濃度組)的胃癌細(xì)胞內(nèi)，無(wú)論在mRNA水平還是蛋白水平，STAT3及其上游調(diào)控蛋白JAK的激活均顯著下調(diào)，并且這些基因表達(dá)與蛋白激活水平的變化也伴隨著細(xì)胞增殖與侵襲遷移能力的下降。說(shuō)明姜黃素可能是通過(guò)改變胃癌細(xì)胞JAK/STAT3信號(hào)通路的激活來(lái)調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲遷移。在胃癌細(xì)胞中，p-JAK及p-STAT3可能是持續(xù)高表達(dá)的，這對(duì)于胃癌的發(fā)生、癌細(xì)胞的浸潤(rùn)與遷移具有重要的輔助作用[9]。而本研究用35 μmol/L姜黃素處理胃癌細(xì)胞24 h后，才出現(xiàn)對(duì)p-JAK及p-STAT3的顯著抑制效果(但仍然具有較高表達(dá)水平)，這可能是由于胃癌細(xì)胞對(duì)藥物具有較強(qiáng)抵抗性。

分子伴侶HSP90在包括胃癌在內(nèi)的多種惡性實(shí)體腫瘤中高表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并與其耐藥和不良預(yù)后密切相關(guān)[10-11]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α在多種上皮細(xì)胞癌中高表達(dá)，參與多種靶基因的轉(zhuǎn)錄激活，其中多數(shù)蛋白產(chǎn)物可促進(jìn)血管形成并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對(duì)缺氧的適應(yīng)，最終促進(jìn)其轉(zhuǎn)移與侵襲[12]。而HSP90對(duì)維持HIF的正確構(gòu)象或募集其他輔助因子必不可少[13]。HSP90表達(dá)也可促進(jìn)STAT3磷酸化激活，而p-STAT3可促進(jìn)熱休克因子作用于HSP90基因靶點(diǎn)上，從而促進(jìn)HSP90基因的轉(zhuǎn)錄[14]。本研究表明，姜黃素顯著抑制了胃癌細(xì)胞HSP90的mRNA轉(zhuǎn)錄以及蛋白表達(dá)水平，說(shuō)明姜黃素能夠通過(guò)下調(diào)胃癌細(xì)胞HSP90來(lái)發(fā)揮抗腫瘤功效。

本研究揭示了姜黃素可通過(guò)抑制胃癌細(xì)胞Hsp90-JAK/STAT3信號(hào)通路激活來(lái)限制其侵襲和遷移，對(duì)于胃癌的臨床治療具有一定借鑒意義。但其臨床應(yīng)用效果及安全性等有待進(jìn)一步研究。