程 浩,宋立成, 奐劍波, 陳麗娜, 陳旭昕, 韓志海

煙霧吸入后，其固有的高溫及富含有毒有害顆粒等特性可導致氣管及肺實質(zhì)的直接和間接損害，從而引發(fā)煙霧吸入性肺損傷(smoke inhalation induced acute lung injury, SI-ALI)?；馂闹腥艉喜⒂袩熿F吸入性肺損傷，死亡率將上升至60%～80%[1]。煙霧吸入后，氧化應激的加強對肺損傷的加重起著重要作用[2]。近年來學者發(fā)現(xiàn)激活PKC β/P66Shc信號通路會加強機體氧化應激，致使機體損傷加重[3-4]。而特異性PKC β抑制劑LY333531能夠抑制該通路激活，減少機體氧化應激的損傷。目前，已有研究證實，應用LY333531后能有效減輕高氧刺激對細胞的損傷[5]。但是，在煙霧吸入性肺損傷中，LY333531是否能夠通過抑制PKC β/P66Shc信號通路進而減輕氧化應激損傷，尚不明確。因此，本實驗擬通過建立SD大鼠煙霧吸入性肺損傷模型，探究LY333531能否減輕煙霧吸入后肺組織的氧化應激損傷。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組40只體質(zhì)量為(200±10)g的健康雄性SPF級SD大鼠由軍事醫(yī)學科學院動物實驗中心提供，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0002，大鼠隨機分成4組:空白對照組(吸入空氣+無干預)、抑制劑對照組(吸入空氣+LY333531干預)、煙霧吸入組(吸入煙霧+無干預)、煙霧吸入+抑制劑組(吸入煙霧+LY333531干預)，每組各10只大鼠。實驗方案通過海軍總醫(yī)院動物倫理委員會批準。

1.2實驗儀器自制產(chǎn)煙箱、集煙箱(產(chǎn)煙箱與集煙箱用管道聯(lián)通，產(chǎn)煙箱一側(cè)有排風扇)；產(chǎn)煙用電爐(興化市楚水電熱電器廠)；電熱恒溫干燥箱(上海上邁電子儀器有限公司)；泵吸式四合一氣體檢測儀(加拿大BW公司)；低溫離心機、酶標儀、微量移液器(美國Thermo公司)；一次性采血針(江蘇治宇醫(yī)療器材有限公司)；真空采血管等[北京積水醫(yī)療科技(中國)有限公司]。

1.3實驗試劑MDA試劑盒、NOS試劑盒、SOD試劑盒、CAT試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Anti-SHC抗體[EP332Y]、Anti-SHC(phospho S36)抗體[6E10](英國Abcam公司)；GAPDH抗體(美國CST公司)；ECL超敏發(fā)光液(北京索萊寶科技有限公司)蛋白酶抑制劑LY333531(美國CST公司)；二甲基亞砜(德國Applichem公司)等。

1.4實驗方法

1.4.1實驗動物預處理 抑制劑對照組大鼠及煙霧吸入+抑制劑組大鼠在進行煙霧實驗前1周按1 mg/(kg·d)[6]腹腔注射蛋白酶抑制劑LY333531?？瞻讓φ战M與煙霧吸入組均無干預。四組大鼠均按正常飲食飼養(yǎng)。

1.4.2實驗動物模型建立 本實驗選用室內(nèi)火災中常見的易燃材料發(fā)泡橡塑絕熱制品、阻尼材料、電纜線、硅丙乳膠漆等混合材料作為產(chǎn)煙材料。將各種產(chǎn)煙材料(各10 g)粉碎后充分混勻置于產(chǎn)煙箱中的電磁爐托盤上，封閉產(chǎn)煙箱，將電磁爐通電，加熱維持爐絲溫度300 ℃。待煙霧充滿產(chǎn)煙箱后，打開排風扇將煙霧吹向集煙箱中，監(jiān)測集煙箱中氣體成分及濃度，利用排風扇控制集煙箱中CO:300～500 ppm，H2S:10～15 ppm,O2:20%～21.9%。將預處理完畢的煙霧吸入組和煙霧吸入+抑制劑組SD大鼠置于集煙箱中，封閉集煙箱，穩(wěn)定吸入25 min。25 min后將實驗大鼠移出煙霧環(huán)境置于正常環(huán)境?？瞻讓φ战M與抑制劑對照組也放入集煙箱中吸入空氣25 min。觀察各組大鼠呼吸、心跳、精神狀態(tài)，記錄大鼠死亡率。

1.4.3實驗動物處理 各組SD大鼠在吸入處理后正常食水喂養(yǎng)12 h，12 h后各組SD大鼠腹腔注射戊巴比妥(30 mg/kg)麻醉后解剖。

1.4.4實驗動物標本采集 實驗大鼠麻醉后開腹，于腹主動脈抽取5 ml動脈血置于真空采血管中，隨后置于離心機中，3 500 r/min離心10 min后取上清液置于EP管中于-80 ℃冰箱中凍存以備后用。抽取動脈血后放血處死大鼠，隨后開胸、結(jié)扎氣管，取出肺組織，結(jié)扎右肺，用生理鹽水對左肺行肺泡灌洗，收集約1 ml BALF 3 500 r/min離心10 min后取上清液置于EP管中于-80 ℃冰箱中凍存以備后用。隨后分離右肺各葉；右肺上葉稱重后置于60 ℃恒溫箱中烘干至質(zhì)量不再改變后再稱重，檢測其濕干比(W/D);右肺中葉取出后置于EP管中于-80 ℃冰箱中凍存以備后用；右肺下葉取出后迅速放入4%多聚甲醛溶液中固定，24 h后進行石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察肺組織病理學改變。

1.4.5肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中蛋白濃度測定 將收集的BALF采用BCA法檢測肺泡灌洗液中的蛋白濃度，檢測方法按照BCA蛋白試劑盒(美國Thermo公司)說明書進行。

1.4.6肺組織勻漿及血清中丙二醛(malondialdehyde, MDA)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)濃度測定 將取出的右肺中葉研磨制成肺組織勻漿以及收集的血清分別按照各自試劑盒說明書操作檢測肺組織勻漿和血清中反映氧化應激的MDA、NOS、SOD、CAT。

1.4.7Western blot方法檢測肺組織勻漿中P66Shc及磷酸化P66Shc蛋白表達情況 將上述取出的右肺中葉取出0.1 g與1 ml裂解液混合后研磨制成肺組織勻漿，應用BCA法檢測蛋白濃度，隨后按lodding buffer ∶肺組織勻漿液=1 ∶3比例制成蛋白樣本，加樣后于10%的丙烯酰胺凝膠分離蛋白，60 mA濕轉(zhuǎn)3 h至PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉1 h，適量稀釋比例的一抗P66Shc(1 ∶1 000)、磷酸化P66Shc(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜，1×TBST洗膜3次，二抗室溫孵育(1 ∶10 000)1 h，1×TBST洗膜3次，ECL化學顯影，運用Image J軟件對Western blot結(jié)果行半定量灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1實驗大鼠呼吸、心率、精神狀態(tài)及死亡率與空白對照組、抑制劑對照組相比，煙霧吸入組與煙霧吸入+抑制劑組大鼠在煙霧吸入25 min后，呼吸頻率、心率明顯加快。接受吸入處理后至解剖處理前，煙霧吸入組大鼠死亡3只(3/10)，煙霧吸入+抑制劑組大鼠死亡2只(2/10)?？瞻讓φ战M與抑制劑對照組大鼠無死亡。成活大鼠中，煙霧吸入組和煙霧吸入+抑制劑組大鼠精神萎靡，煩躁，偶有呃逆現(xiàn)象出現(xiàn)。置于正常環(huán)境后，上述現(xiàn)象逐漸好轉(zhuǎn)，在吸入處理3 h后大鼠精神狀態(tài)恢復。

2.2BALF蛋白濃度與空白對照組相比，抑制劑對照組BALF濃度無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與空白對照組、抑制劑對照組比較，煙霧吸入組和煙霧吸入+抑制劑組BALF中蛋白濃度均明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),與煙霧吸入組比較，煙霧吸入+抑制劑組BALF蛋白濃度減少，差異有統(tǒng)計學意義P<0.05)。見表1。

2.3肺組織W/D比較與空白對照組比較，抑制劑對照組W/D無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與空白對照組、抑制劑對照組比較，煙霧吸入組與煙霧吸入+抑制劑組肺組織W/D均上升(P<0.05)，其中，煙霧吸入組大鼠肺組織W/D上升更明顯；與煙霧吸入組比較，煙霧吸入+抑制劑組大鼠肺組織W/D有所下降(P<0.05)。見表1。

2.4肺組織勻漿MDA、NOS、SOD、CAT

2.4.1MDA 與空白對照組比較，抑制劑對照組肺組織勻漿中MDA無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與空白對照組、抑制劑對照組比較，煙霧吸入組與煙霧吸入+抑制劑組肺組織勻漿中MDA均升高(P<0.05)；與煙霧吸入組比較，煙霧吸入+抑制劑組大鼠肺組織MDA有所下降(P<0.05)。見表2。

2.4.2總一氧化氮合酶(total nitric oxide synthase，TNOS)和誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS) 與空白對照組比較，抑制劑對照組大鼠肺組織勻漿TNOS和iNOS無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與空白對照組、抑制劑對照組比較，煙霧吸入組大鼠和煙霧吸入+抑制劑組大鼠肺組織勻漿中TNOS和iNOS均上升(P<0.05)；與煙霧吸入組比較，煙霧吸入+抑制劑組TNOS與iNOS均未見明顯減少，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

2.4.3SOD 與空白對照組比較，抑制劑對照組大鼠肺組織勻漿SOD活力無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與空白對照組、抑制劑對照組比較，煙霧吸入組及煙霧吸入+抑制劑組大鼠SOD活力明顯下降(P<0.05)；與煙霧吸入組比較，煙霧吸入+抑制劑組大鼠SOD活力有所上升(P<0.05)。見表2。

2.4.4CAT 與空白對照組比較，抑制劑對照組大鼠肺組織勻漿CAT活性無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與空白對照組、抑制劑對照組比較，煙霧吸入組及煙霧吸入+抑制劑組大鼠CAT活性明顯下降(P<0.05)；與煙霧吸入組比較，煙霧吸入+抑制劑組CAT活性未見明顯增加，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表1 各組大鼠BALF蛋白濃度、肺組織W/D結(jié)果

與空白對照組比較：*P<0.05;與抑制劑對照組比較：#P<0.05; 與煙霧吸入組比較：△P<0.05

表2 各組大鼠肺組織勻漿MDA、NOS、SOD、CAT結(jié)果

與空白對照組比較：*P<0.05;與抑制劑對照組比較：#P<0.05; 與煙霧吸入組比較：△P<0.05

表3 各組大鼠血清MDA、NOS、SOD、CAT結(jié)果

與空白對照組比較：*P<0.05;與抑制劑對照組比較：#P<0.05; 與煙霧吸入組比較：△P<0.05

2.5血清MDA、NOS、SOD、CAT

2.5.1MDA 與空白對照組比較，抑制劑對照組血清中MDA無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與空白對照組、抑制劑對照組比較，煙霧吸入組與煙霧吸入+抑制劑組血清中MDA濃度均增加(P<0.05)；與煙霧吸入組比較，煙霧吸入+抑制劑組大鼠血清MDA有所下降(P<0.05)。見表3。

2.5.2TNOS和iNOS 與空白對照組比較，抑制劑對照組血清中TNOS、iNOS無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與空白對照組、抑制劑對照組比較，煙霧吸入組大鼠和煙霧吸入+抑制劑組大鼠血清中TNOS和iNOS均明顯上升(P<0.05)；與煙霧吸入組比較，煙霧吸入+抑制劑組TNOS，iNOS水平下降(P<0.05)。見表3。

2.5.3SOD 與空白對照組比較，抑制劑對照組血清SOD活力無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與空白對照組、抑制劑對照組比較，煙霧吸入組及煙霧吸入+抑制劑組大鼠血清中SOD活力明顯下降(P<0.05)；與煙霧吸入組比較，煙霧吸入+抑制劑組大鼠血清SOD活力升高(P<0.05)。見表3。

2.5.4CAT 與空白對照組比較，抑制劑對照組血清CAT活性無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與空白對照組和抑制劑對照組比較，煙霧吸入組及煙霧吸入+抑制劑組大鼠血清中CAT活性明顯下降(P<0.05)；與煙霧吸入組比較，煙霧吸入+抑制劑組大鼠血清中CAT活性增加(P<0.05)。見表3。

2.6肺組織勻漿P66Shc、磷酸化P66Shc表達Western blot顯影結(jié)果顯示空白對照組與抑制劑對照組P66Shc蛋白表達較低，煙霧吸入組大鼠肺組織P66Shc蛋白表達明顯增加，煙霧吸入+抑制劑組較煙霧吸入組有所減輕。而活化后的磷酸化P66shc,抑制劑對照組表達明顯低于空白對照組，而煙霧吸入組與煙霧吸入+抑制劑組表達明顯上升。運用Image J軟件對顯影結(jié)果行灰度值分析可見，與空白對照組比較，抑制劑對照組p-P66Shc/P66Shc比值明顯下降(P<0.05),煙霧吸入組p-P66Shc/P66Shc比值則明顯上升(P<0.05)；煙霧吸入+抑制劑組p-P66Shc/P66Shc比值明顯上升(P<0.05)；與煙霧吸入組比較，煙霧吸入+抑制劑組p-P66Shc/P66Shc比值上升(P<0.05)，見圖1。

圖1 Western blot檢測各組大鼠肺組織P66Shc及p-P66Shc蛋白表達情況

2.7肺組織病理學特征光鏡下可見空白對照組與抑制劑對照組肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡間隔正常，肺泡腔內(nèi)可見少許炎性細胞浸潤。煙霧吸入組肺泡結(jié)構(gòu)遭到破壞，出現(xiàn)肺泡斷裂，肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔內(nèi)大量炎性細胞浸潤以及粉紅色液體滲出。煙霧吸入+抑制劑組肺泡結(jié)構(gòu)相對完整，肺泡間隔增厚，肺泡腔內(nèi)有炎性細胞及紅色滲出物出現(xiàn)，與煙霧吸入組相比，損傷較輕。見圖2。

圖2 肺組織病理HE染色 HE×400

3 討論

合并煙霧吸入是火災中死亡最主要的原因。而氧化應激在煙霧吸入性肺損傷中也占據(jù)著重要地位，其中，脂質(zhì)過氧化、i NOS過表達引起的肺水腫、抗氧化相關(guān)酶的大量消耗等均是機體損傷的重要原因[2]。煙霧吸入后，刺激引起機體產(chǎn)生過多的活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)，而機體內(nèi)大部分ROS需通過抗氧化酶SOD、CAT等還原成無氧化毒性的水，從而保證機體氧化還原平衡[7-8]?；钚缘杂苫?reactive nitrogen species，RNS)的過多表達則是由于煙霧吸入后，機體內(nèi)的iNOS顯著增多，iNOS分解L-精氨酸產(chǎn)生遠超過生理劑量的NO，進而加重機體氧化應激損傷[9]；故機體內(nèi)的氧化還原酶常用來反映機體氧化應激的水平。PKC β/P66Shc信號通路的激活是機體氧化應激加強的重要因素，LY333531是特異性蛋白激酶(PKC β)抑制劑，能抑制PKC β/P66Shc信號通路的激活，減輕機體氧化應激[3,10]。本實驗顯示煙霧吸入后，大鼠BALF蛋白濃度、W/D、MDA、NOS明顯增加，SOD、CAT明顯減少，而預防注入LY333531后則有所緩解，可說明煙霧吸入后機體氧化應激加重，而LY333531可減輕煙霧吸入性肺損傷大鼠的氧化應激水平，進而減輕機體損傷。

銜接蛋白P66Shc是機體調(diào)控凋亡與調(diào)節(jié)氧化應激的重要蛋白，正常情況下，P66Shc處于失活狀態(tài)，主要定位于細胞質(zhì)。當機體接受外源性刺激或內(nèi)源性刺激時，PKC/P66SHC信號通路被激活，該蛋白發(fā)生構(gòu)象改變，并轉(zhuǎn)移至線粒體中，并在線粒體內(nèi)氧化細胞色素C使電子不能順利傳遞至復合體IV 形成H2O，而是形成ROS(H2O2)[11]。蛋白激酶抑制劑LY333531能夠抑制PKC β/P66Shc信號通路的激活，有研究[12]表明運用該抑制劑能通過抑制NADPH氧化酶，增加SOD的表達減輕糖尿病腎病大鼠模型中氧化應激的腎損害；也有學者研究發(fā)現(xiàn)LY333531能減少大鼠心肌組織的氧化損傷，進而發(fā)揮其心臟保護作用[13]。本實驗Western blot結(jié)果顯示,煙霧吸入后，大鼠肺組織P66Shc及活化后的p-P66Shc蛋白表達明顯增多，而煙霧吸入+抑制劑組則表達相對較少。行灰度值分析時，發(fā)現(xiàn)煙霧吸入+抑制劑組p-P66Shc與P66Shc灰度值比值高于煙霧吸入組，這可能是因為煙霧吸入組P66Shc表達遠高于煙霧吸入+抑制劑組，而不是因為后者活化p-P66Shc表達更多。結(jié)合上述W/D、BALF濃度、氧化還原酶結(jié)果及肺組織病理特點。課題組推斷：煙霧吸入后，大鼠體內(nèi)PKC β/P66Shc信號通路激活，下游P66Shc蛋白表達增多，并且活化的磷酸化P66Shc蛋白表達也明顯增多，進入線粒體后阻斷氧化呼吸鏈傳遞，產(chǎn)生過多的H2O2，使得ROS含量明顯上升，同時煙霧刺激使得iNOS表達增多，進而體內(nèi)NO含量明顯上升，最終加重大鼠機體的氧化應激損傷。隨著ROS的增加，大量脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA聚集，并且消耗體內(nèi)原有的抗氧化酶SOD、CAT等，使得機體損傷進一步加重。蛋白激酶抑制劑LY333531能特異性抑制PKC β/P66Shc信號通路的激活,使P66Shc活化減少，導致ROS、RNS產(chǎn)生減少，最終使得機體氧化應激減輕，肺水腫、滲出等損傷隨之減輕。