丁西平，毛玉娣，汪朝靚，周 歡，程 前

胃癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和死亡率[1]。早期胃癌無(wú)明顯的癥狀和體征，極大限制了早期的診斷率，并且錯(cuò)過(guò)了治療的最佳時(shí)期，因此，目前胃癌的5年生存率仍然不令人滿意[2]。胃癌在病理特征上常繼發(fā)于慢性萎縮性胃炎和異型增生，其中包含眾多遺傳與表觀遺傳的改變，基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜多元。例如，以往的研究[3]證明多種促炎基因之間相互作用參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。為了提高胃癌早期診斷率，尋找新的臨床標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，該文應(yīng)用高通量基因芯片技術(shù)，研究胃萎縮性炎惡變過(guò)程基因表達(dá)譜的變化，并且通過(guò)生物信息學(xué)分析基因間的相互作用及所涉及的生物過(guò)程和信號(hào)通路。

1 材料與方法

1.1病例資料臨床標(biāo)本的收集由中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。所有標(biāo)本均來(lái)自中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)內(nèi)鏡中心，包括5例慢性萎縮性胃炎伴腸上皮化生組織和5例進(jìn)展期胃癌組織，并符合病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)。兩組臨床標(biāo)本均來(lái)自于男性患者，年齡分別為42～64(55±10.03)歲和45～65(57±9.14)歲(P=0.77)。所有胃癌患者均未接受任何治療包括手術(shù)、化療、放療以及生物治療等。內(nèi)鏡下夾取的標(biāo)本立即放入RNA later(美國(guó)Thermo Fisher公司)溶液中穩(wěn)定RNA，防止降解，然后儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中。

1.2RNA提取與定量TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)用來(lái)提取各臨床標(biāo)本中總RNA，并進(jìn)一步采用 NucleoSpin? RNA clean-up試劑盒(740.948.250)對(duì)總RNA進(jìn)行過(guò)柱純化。使用分光光度法(Nanodrop 2000，美國(guó)Thermo Scientific公司)檢測(cè)RNA的純度與總量，合格標(biāo)準(zhǔn)為吸光度A260/280≥1.80且RNA總量≥1 μg。瓊脂糖凝膠電泳用來(lái)檢測(cè)RNA完整性。

1.3基因芯片檢測(cè)提取各組織中的總RNA先合成cDNA，并在體外轉(zhuǎn)錄成cRNA，既而反轉(zhuǎn)錄合成cDNA, 經(jīng)Nucleospin? Extract Ⅱ試劑盒(MN公司，Cat.No.740609.250)純化后使用紫外分光光度計(jì)定量，然后經(jīng)熒光染料標(biāo)記后與 mRNA 表達(dá)譜芯片V4.0(GeeDom)進(jìn)行雜交?；蛐酒s交、清洗和掃描由北京博奧生物有限公司完成。

1.4GO富集和KEGG信號(hào)通路分析GO(Gene Ontology)富集分析包括細(xì)胞組分、分子功能和生物過(guò)程三個(gè)獨(dú)立的分析體系，可以整合生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中的資源。 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 信號(hào)通路和GO分析用來(lái)探索差異性表達(dá)的基因參與的信號(hào)通路及生物過(guò)程。Cytoscape V3.2.1軟件用來(lái)解讀差異性基因相關(guān)的信號(hào)通路及功能，顯著性的檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

1.5PPI(Protein-ProteinInteraction)網(wǎng)絡(luò)分析STRING數(shù)據(jù)庫(kù)是檢索基因間相互作用的搜索工具，可以提供實(shí)驗(yàn)性和預(yù)測(cè)性的基因之間的相互作用和聯(lián)系。STRING 10.0版本用于繪制和分析差異性表達(dá)基因間的相互作用。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理Agilent Feature Extraction軟件用于處理基因芯片掃描圖并得到原始數(shù)據(jù)，GeneSpring 軟件將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化分析并以Excel格式輸出數(shù)據(jù)。通過(guò)SPSS 17.0軟件進(jìn)行雙樣本T檢驗(yàn)，差異表達(dá)基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為Fold Change(FC，變化倍數(shù))≥2.0且P<0.05；Cluster 3.0軟件用于聚類分析，GraphPad Prism 6軟件用于圖形展示。

2 結(jié)果

2.1胃萎縮性炎癥惡變過(guò)程中基因表達(dá)譜的變化為了全面分析胃萎縮性炎惡變至胃癌過(guò)程中基因表達(dá)譜的變化，本研究收集了5例慢性重度萎縮胃炎伴腸上皮化生組織和5例進(jìn)展期胃癌組織進(jìn)行高通量基因芯片檢測(cè)。轉(zhuǎn)錄組基因芯片分析技術(shù)顯示了萎縮性胃炎組織及胃癌組織中基因表達(dá)譜的變化， 共2 779個(gè)具有明確注釋的基因差異性表達(dá)(FC>2且校正后P<0.05認(rèn)為是具有顯著差異性表達(dá))，與萎縮性胃炎組織相比，有1 288個(gè)基因在胃癌組織中高表達(dá)，1 491個(gè)基因在胃癌組織中低表達(dá)?；鹕綀D可以更加清晰的顯示差異性基因的表達(dá)情況，綠色表示在萎縮性胃炎組織中低表達(dá)的基因，紅色表示在萎縮性胃炎組織中高表達(dá)的基因，黑色標(biāo)記的基因表示沒(méi)有顯著性變化的基因，但是它們的變化倍數(shù)可能很大，或者P值可能極小，見(jiàn)圖1。

圖1 全部檢測(cè)基因火山圖差異比較

以變化倍數(shù)(fold change ,FC)的log2為橫軸，以校正后P值的lg值負(fù)數(shù)為縱軸，繪制火山圖，分析全部檢測(cè)基因的差異；圖中灰色橫線是校正后P值=0.05的位置，兩條灰色的豎線是FC=2的位置

2.2胃萎縮性炎癥惡變過(guò)程中變化最顯著的基因在基因芯片檢測(cè)篩選的2 779個(gè)差異性表達(dá)的基因中，其中在萎縮性炎惡變過(guò)程中變化最為顯著的基因，如上調(diào)的有CXCL1、S100A9、CXCL8、CHI3L1、S100A8、BCL2AL、SAA1、PI3；下調(diào)的有DAZ2、DAZ1、GAST、MSMB、C6orf58、DAZL、KCNE2、GIF、ATP4B、KRT20。具體信息見(jiàn)表1。此外，為了更加直觀的顯示這30個(gè)顯著差異表達(dá)的基因在萎縮性胃炎組織及胃癌組織中的表達(dá)水平，使用Cluster 3.0軟件進(jìn)行聚類分析，結(jié)果用熱圖展示，見(jiàn)圖2。

圖2 熱圖分析展示

2.3胃萎縮性炎癥惡變過(guò)程中差異性表達(dá)基因的GO富集分析為了探索萎縮性胃炎與胃癌組織中差異性基因表達(dá)所代表的生物學(xué)功能，對(duì)這些基因進(jìn)行了GO富集分析，GO富集分析是生物信息學(xué)研究中非常重要的工具。共篩選出130個(gè)富集的生物過(guò)程(校正后的P<0.05)及每個(gè)生物過(guò)程中所包含的差異性表達(dá)的基因。其中前10個(gè)富集的生物學(xué)過(guò)程分別是炎癥反應(yīng)、白細(xì)胞趨化作用、細(xì)胞遷移、血管生成、對(duì)細(xì)菌來(lái)源分子的反應(yīng)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞黏附作用、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的調(diào)節(jié)、趨化因子介導(dǎo)信號(hào)通路、脂多糖介導(dǎo)信號(hào)通路。圖3直觀地顯示了差異性表達(dá)的基因與富集的生物過(guò)程的關(guān)聯(lián)程度。

表1 在胃癌組織中變化最明顯的15個(gè)下調(diào)基因和15個(gè)上調(diào)基因

2.4胃萎縮性炎癥惡變過(guò)程中KEGG信號(hào)通路分析為進(jìn)一步研究從胃萎縮性炎惡變至胃癌過(guò)程中所涉及的信號(hào)通路，對(duì)異常表達(dá)的基因進(jìn)行了KEGG信號(hào)通路分析。結(jié)果顯示，在KEGG PATHWAY數(shù)據(jù)庫(kù)中，以P<0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出31條信號(hào)通路，其中包括TNF信號(hào)通路、NF-kappa B信號(hào)通路、化學(xué)致癌作用、趨化因子信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路等。圖4總結(jié)了前15個(gè)差異性最為顯著的信號(hào)通路。

2.5差異性表達(dá)基因PPI網(wǎng)絡(luò)分析為了解差異性表達(dá)基因編碼蛋白質(zhì)的功能及蛋白與蛋白之間的功能，將前100名差異性表達(dá)最為顯著的基因輸入STRING 10.0數(shù)據(jù)庫(kù)中，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖5)。研究顯示，在胃萎縮性炎癥惡變至胃癌過(guò)程中，差異性表達(dá)基因編碼的蛋白質(zhì)CXCL1、PPBP、CCL20、CXCR2、IL8、STT和SAA1關(guān)聯(lián)程度強(qiáng)； IL6、IL11、MMP3、CSF3和OSM之間也具有明顯的相互作用。

圖3 GO分析顯示差異性表達(dá)的基因富集最顯著的前10個(gè)生物過(guò)程

圖4 在KEGG PATHWAY數(shù)據(jù)庫(kù)中差異性表達(dá)的基因富集最明顯的15條信號(hào)通路

圖5 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

慢性炎癥在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用，研究[4]證明高達(dá)25%的惡性腫瘤繼發(fā)于慢性炎癥，例如胃癌。胃癌在我國(guó)仍具有相當(dāng)高的發(fā)病率，發(fā)病機(jī)制不清楚，一般認(rèn)為在萎縮性胃炎基礎(chǔ)上出現(xiàn)腸上皮化生，異型增生，進(jìn)而發(fā)展為胃癌。從萎縮性胃炎惡變至胃癌過(guò)程中，分子機(jī)制復(fù)雜多元，其在遺傳和表觀遺傳改變的積累驅(qū)動(dòng)炎癥細(xì)胞進(jìn)行性轉(zhuǎn)化為惡性衍生物成為研究熱點(diǎn)。此外，胃癌早期診斷對(duì)臨床預(yù)后起著很重要的作用，通過(guò)對(duì)胃癌分子機(jī)制的研究，探討胃癌早期診斷顯得非常重要。

為了更加全面的了解胃癌的發(fā)病機(jī)制，本研究收集了萎縮性胃炎和胃癌組織進(jìn)行基因芯片檢測(cè)，共篩選出2 779個(gè)差異性表達(dá)的基因，總結(jié)了變化最明顯的15個(gè)上調(diào)基因及15個(gè)下調(diào)基因。以往的研究已經(jīng)證明了一些基因在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，例如，基因芯片結(jié)果顯示在胃癌組織中高表達(dá)的CXCL8可以增加慢性炎癥惡變至腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，并且可以促進(jìn)胃癌的增殖和轉(zhuǎn)移[5]。S100A9和S100A8是一類鈣結(jié)合蛋白，兩者在多種腫瘤中高表達(dá)，可以激活MMP-2的表達(dá)和NF-kappa B 促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲和遷移的，并且可以作為胃癌臨床診斷標(biāo)志物[6-8]。在胃癌組織中低表達(dá)的KCNE2、SOSTDC1、ATP4A和ATP4B均被報(bào)道與胃癌的病理機(jī)制及臨床特征相關(guān)[9-11]。這些基因在胃癌中的表達(dá)情況與我們基因芯片檢測(cè)的結(jié)果一致，說(shuō)明它們?cè)谖肝s性炎癥惡變過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)了一些在胃癌中未見(jiàn)報(bào)道的腫瘤相關(guān)基因?；蛐酒Y(jié)果顯示CPA2在胃癌組織中低表達(dá)，最新的研究證明CPA2缺失與胰腺癌的發(fā)生有關(guān)[12]；HCAR3的高表達(dá)與乳腺癌有關(guān)[13]，本研究顯示其在胃癌發(fā)生過(guò)程中上調(diào)。BCL2A1是BCL-2蛋白家族成員，調(diào)控細(xì)胞凋亡，有研究[14]表明它可以作為MYC的靶分子誘導(dǎo)發(fā)生白血病B細(xì)胞白血病。這些腫瘤相關(guān)基因在胃萎縮性炎癥惡變過(guò)程中差異性表達(dá)非常顯著，為胃癌發(fā)病分子機(jī)制的研究指出新的方向。

為了探索差異性表達(dá)基因所表示的生理意義，本研究進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。GO分析和KEGG信號(hào)通路分析分別展示了在胃萎縮性炎癥惡變過(guò)程中富集的生物過(guò)程和信號(hào)通路。如CXCL1、CXCL8、CCL20、IL11共同參與炎癥反應(yīng)和趨化因子信號(hào)通路， BCL2A1 參與NF-kappa B 信號(hào)通路，ATP4A和ATP4B共同參與胃酸分泌。ITGAX參與細(xì)胞遷移、黏附和運(yùn)動(dòng)。腫瘤發(fā)生涉及復(fù)雜基因網(wǎng)絡(luò)的改變，本研究使用了PPI網(wǎng)絡(luò)分析胃萎縮性炎惡變過(guò)程中基因網(wǎng)絡(luò)的改變，更加清晰地顯示基因編碼蛋白之間的聯(lián)系程度。高表達(dá) IL8、CCL2、TNF-α和OSM的胃癌干細(xì)胞GC-MSCs的培養(yǎng)液可以活化嗜中性粒細(xì)胞，進(jìn)而激活I(lǐng)L6-STAT3信號(hào)途徑促進(jìn)胃癌的遷移[15]，此點(diǎn)在PPI基因網(wǎng)絡(luò)圖譜中得到同樣的體現(xiàn)。

本文提供了在胃萎縮性炎癥惡變過(guò)程中宏觀基因表達(dá)譜的變化，將為今后的研究提供重要的參考依據(jù)。并且這些差異性表達(dá)的基因可能與胃癌的發(fā)病機(jī)制和臨床特征相關(guān)，但是仍然需要更多的樣本和實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。