李 莉，樊 華，夏 琴，柳田田，程 錦，朱德發(fā)

橋本甲狀腺炎(Hashimoto′s thyroiditis，HT)又被稱為慢性淋巴細胞性甲狀腺炎，是一種逐年高發(fā)的自身免疫性甲狀腺疾病，多見于女性。近年來研究[1]發(fā)現(xiàn)HT可引起女性不孕。不孕是由多種因素綜合作用的結(jié)果，有文獻[2]指出妊娠期間子宮內(nèi)膜容受性降低是女性不孕的因素之一。穩(wěn)定的子宮內(nèi)膜容受性能夠促進胚胎與內(nèi)膜的相互作用,利于胚胎著床。半乳糖凝集素-3(galectin-3)是一種通過其糖識別域識別細胞表面糖蛋白、糖脂和β半乳糖苷結(jié)構(gòu)并與其結(jié)合的蛋白質(zhì)，是半乳糖凝集素家族中的一員[3]。有研究[4]表明galectin-3可在子宮內(nèi)膜著床窗口期能夠調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的容受性，改善內(nèi)膜細胞間粘附能力，增強胚胎對子宮內(nèi)膜的植入，從而參與生殖過程。galectin-3在子宮內(nèi)膜中的表達具有時空特異性，主要參與到人月經(jīng)周期分泌中晚期、小鼠動情期以及胚泡種植的過程中[4-5]。有研究[6]發(fā)現(xiàn)小鼠動情期是一關(guān)鍵時期，在此期內(nèi)能夠進行排卵，與妊娠關(guān)系密切。對于galectin-3有利于妊娠并維持其過程的原因，有研究[7]表明在于此蛋白能調(diào)節(jié)機體免疫機制的平衡。目前，關(guān)于galectin-3在橋本小鼠妊娠準備階段子宮內(nèi)膜的表達情況在國內(nèi)報道較少見。該研究選取未妊娠的NOD雌鼠，旨在觀察對照組和橋本組小鼠子宮內(nèi)膜動情周期galectin-3的表達水平，為進一步探討HT引起女性不孕的機制提供相關(guān)的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物取8～9周齡清潔級健康NOD雌性小鼠64只，20～23 g，購自北京華阜康生物科技有限公司，于安徽醫(yī)科大學(xué)毒理實驗室動物標準飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)，保證室溫20～24 ℃，濕度40%～60%，實驗過程遵循《安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物管理和使用指南》。

1.2主要試劑及儀器豬甲狀腺球蛋白(porcine thyroglobulin，pTg)、完全弗氏佐劑(complete Freund′s adjuvant，CFA)、不完全弗氏佐劑(incomplete Freund′s adjuvant，IFA)均購自美國Sigma公司；三碘甲狀腺原氨酸(triiodothyronine，T3)試劑盒、四碘甲狀腺原氨酸 (tetraiodothyronine，T4)試劑盒、甲狀腺球蛋白抗體(thyroglobulin antibody，TgAb)、甲狀腺過氧化物酶抗體(thyroid peroxidase antibody，TPOAb)試劑盒均購自德國Roche公司；ELISA試劑盒(USCNLIFE、CEA463Mu)；瑞氏染色液(南京建成科技有限公司)；蘇木精-伊紅染色試劑盒(上?？茀R生物技術(shù)有限公司)；兔抗鼠galectin-3多克隆抗體(美國Abcam公司)；免疫組化化學(xué)染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋公司)；普通PCR儀(杭州晶格科學(xué)儀器有限公司)；高速臺式冷凍離心機(安徽嘉文儀器裝備有限公司)；熒光定量PCR儀、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo Scientific 公司)；細胞因子試劑盒、BD FAC-SCalibur流式細胞儀(美國BD公司)；熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(Image-ProPLus 6.0，美國MEDIA CYBERNETICS公司)。

1.3動物模型制備NOD雌性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為2組：正常對照組(CON組)、橋本甲狀腺炎組(HT組)，每組各32只。HT組造模步驟：將25 μg pTg溶于100 μl PBS溶液中，隨后CFA與pTg溶液按1 ∶1混于研缽中，在冰浴條件下研磨成“油包水”狀，即完全乳化。再用注射器抽取制備好的乳狀劑，固定好小鼠，在小鼠尾根部1 cm處皮下注射，每只0.1 ml。對照組注射等量不含pTg的CFA。第14天將模型組的CFA替換成IFA制備成乳液，操作方法同前，對照組注射等量不含pTg的IFA。造模周期為49 d。實驗經(jīng)由安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審核批準。

1.4方法

1.4.1動情周期確定 小鼠動情周期分為動情前期、動情期、動情后期、動情間期，周期為4～5 d，每只小鼠每日動情時期各不相同，為保證CON、HT兩組小鼠處死時的動情各期數(shù)量相當(dāng)(均為8只)，故采取1周內(nèi)進行小鼠陰道脫落細胞瑞氏染色涂片，當(dāng)日做完涂片確定所處時期后立即靜脈取血、頸椎脫臼法處死小鼠。

1.4.2血清甲狀腺激素水平測定 下腔靜脈取血1 ml，3 000 r/min離心10 min，分離血清，于4 ℃冰箱保存。電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測血清T3、T4、TgAb、TPOAb，ELISA法檢測血清促甲狀腺激素(thyrotropin，TSH)。

1.4.3標本制備 取血后小鼠立即頸椎脫臼處死，于冰臺迅速暴露小鼠腹腔“Y”形子宮，完整取出后于子宮“Y”形中間分叉處剪斷，將左半邊子宮于4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋，矢狀位連續(xù)切片，片厚5 μm，用于HE染色、免疫組化染色；右半邊子宮浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定，待做組織勻漿用于子宮局部細胞因子檢測。

1.4.4HE染色 通過小鼠陰道脫落細胞瑞氏染色確定小鼠動情周期后再結(jié)合HE染色法觀察動情各期小鼠子宮內(nèi)膜的形態(tài)及腺體變化。將子宮切片經(jīng)脫蠟、復(fù)水后，蘇木精染料染色20 min，鹽酸乙醇分色、藍化后伊紅染料染色10 s，再經(jīng)脫水、透明后烘干封片。光學(xué)顯微鏡下拍攝圖片。

1.4.5免疫組織化學(xué)染色 小鼠子宮蠟片置于60 ℃烤箱30 min，二甲苯脫蠟3次，每次15 min，梯度乙醇水化；TritonX-100細胞通透，30%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；檸檬酸鹽微波爐加熱暴露抗原決定簇；山羊血清封閉；以上各步驟間使用PBS洗滌3次，每次3 min。galectin-3抗體(1 ∶50)室溫孵育1 h后孵育過夜(4 ℃)；HRP標記山羊抗兔IgG孵育30 min(37 ℃)；以上各步驟間使用PBS洗滌5次，每次5 min；DAB顯色，蘇木精復(fù)染20 s，PBS返藍10 min，常規(guī)脫水、透明、封片。每張切片鏡下隨機選取5個視野在同一放大倍數(shù)下(×400)進行觀察，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡拍攝；運用IPP6.0圖像分析軟件分析免疫反應(yīng)產(chǎn)物的光密度值，取平均光密度(average optical density，AOD)值。

1.4.6RT-PCR反應(yīng) 每100 mg子宮標本中加入1 ml TRIzol提取RNA后，進行分離、沉淀、洗滌溶解后于-80 ℃保存；在0.2 ml EP管中，加入總RNA(質(zhì)量為1 μg)、10 μmol/L Oligo(dT)1 μl、DEPC水補足至12 μl，進行離心、加熱、水??；在上述EP管中加入5×Reaction Buffer 4.0 μl、10 mmol/L dNTP Mix 2 μl、RibolockTMRnase inhibitor 1 μl、RevertAidTMM-MLV Reverse Transcniptase 1 μl于42 ℃加熱60 min，70 ℃加熱5 min；取出上述反應(yīng)液，即為cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?；取出cDNA作為熒光定量模板，使用Thermo Scientific公司的RevertAid Reverse Transcniptase建立反應(yīng)體系；進行目的基因擴增；galectin-3上游引物：5′-ACGCCATGATCTAAGCCAGA-3′;下游引物：5′-GCGATGGGTATCTCTCAGCC-3′。觀察反應(yīng)結(jié)果，進行產(chǎn)物分析。

1.4.7流式微球捕獲技術(shù)(CBA法)檢測細胞因子 將子宮組織勻漿后作為待測樣品，準備好緩沖液等試劑，將白細胞介素-2(interleukin-2，IL-2)、白細胞介素-4(interleukin-4，IL-4)兩種細胞因子標準品凍干粉轉(zhuǎn)移到離心管中，用稀釋液進行重懸、梯度稀釋、混勻后將分裝的捕獲微球立即混勻并裝入流式管中，標記為混合微球；各實驗管中加入混合好的捕獲微球50 μl，將標準管中加入上述梯度稀釋好的標準品，樣本管中加入50 μl待測樣品，棄去上清液。所有管均室溫避光孵育2 h，同時用流式儀器調(diào)校微球進行實驗條件設(shè)置，清洗捕獲微球/樣本/標準品復(fù)合物，上機檢測，進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1小鼠血清甲狀腺激素及抗體水平與CON組相比，HT組TgAb、TPOAb水平升高(P<0.05)，T3、T4、TSH水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 各組小鼠T3、T4、TSH、TgAb、TPOAb水平

與CON組比較：*P<0.05

2.2小鼠子宮內(nèi)膜動情期HE染色動情期是有利于小鼠交配的最關(guān)鍵時期，故選取兩組小鼠動情期子宮內(nèi)膜初步比較。光鏡下顯示：HT組較CON組，內(nèi)膜增厚明顯，腔上皮多呈分支絨毛狀結(jié)構(gòu)，固有層腺體多而大。見圖1。

圖1 兩組小鼠子宮內(nèi)膜動情期 HE×50A：CON組動情期；B：HT組動情期

2.3免疫組化光鏡結(jié)果光鏡下可見galectin-3在各動情周期小鼠子宮內(nèi)膜組織中均有表達，呈棕黃色顆粒，主要分布于腔上皮、腺上皮胞質(zhì)中，尤其是頂端面，間質(zhì)細胞胞質(zhì)中分布較少，各細胞核中則幾乎無分布。見圖2。

2.4免疫組化AOD值結(jié)果與CON組比較，HT組galectin-3的AOD值在動情期、動情后期降低(P<0.05)，而在動情前期、動情間期的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

2.5RT-PCR結(jié)果與CON組比較，HT組galectin-3 mRNA在四期間的表達均降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

表2 兩組小鼠動情周期免疫組化染色AOD值

與CON組比較：*P<0.05

表3 兩組小鼠動情周期galectin-3 mRNA表達水平

與CON組比較：*P<0.05

2.6小鼠子宮組織細胞因子水平HT組IL-2水平(0.346±0.015)低于CON組(0.712±0.020)(P<0.05，t=14.461)；IL-4水平(0.333±0.015)低于CON組(0.676±0.021)(P<0.05，t=13.333)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 galectin-3在動情周期小鼠子宮內(nèi)膜的表達 ×400A：CON組；B：HT組；1：動情前期；2：動情期；3：動情后期；4：動情間期

3 討論

陰道涂片法是目前常用的小鼠動情周期判定方法之一，本實驗先采用陰道脫落細胞瑞氏染色涂片法確定小鼠動情周期后，再結(jié)合HE染色法光鏡下觀察各期小鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)。宋婉玲 等[6]的研究表明，動情期是排卵并接受交配的最佳時期，此期內(nèi)膜較其他三期明顯變厚，故本實驗直接選取CON組和HT組的動情期HE染色涂片進行觀察。HE染色顯示，HT組的子宮內(nèi)膜肉眼較CON組變厚，腺體也較大而多，推測可能是由于造模成功導(dǎo)致橋本鼠子宮出現(xiàn)上述結(jié)果，具體機制尚不清楚。

免疫組化結(jié)果示，galectin-3主要表達于子宮內(nèi)膜腔上皮、腺上皮和基質(zhì)細胞細胞質(zhì)，且腔上皮表達強于腺上皮與基質(zhì)，這與Popovici et al[8]的文獻報道一致。免疫組化法與RT-PCR法顯示，HT組galectin-3表達在動情期較CON組降低，這提示動情期作為參與妊娠的關(guān)鍵時期，其出現(xiàn)可能有利于galectin-3的表達；同時提示HT組小鼠子宮內(nèi)膜雖具有接受胚胎植入的能力，但其中g(shù)alectin-3的低表達可能減弱了內(nèi)膜基質(zhì)細胞間的黏附作用，不利于維持妊娠。Quintino-Moro et al[1]在文中也提及HT女性患者可以受孕，但受孕概率較低。此外，免疫組化與PCR法顯示，HT組galectin-3在動情后期表達低于CON組，而動情前、間期兩組無差異，推測可能是由于galectin-3表達和性激素含量有關(guān)，而性激素的分泌受動情周期調(diào)控。Talebi et al[9]的研究表明，受精后動情后期雌激素水平開始降低，孕激素水平逐漸升至高峰。galectin-3含量受雌孕激素調(diào)控，且孕激素能夠協(xié)同galectin-3表達增加[10]；若未受精，后期黃體萎縮，孕激素開始退化[11]。這提示HT組的較低受孕率可能導(dǎo)致后期孕激素含量降低，促使galectin-3表達低于CON組。galectin-3 mRNA和蛋白質(zhì)的表達譜在動情周期中的差異，可能是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控使galectin-3蛋白的穩(wěn)定性受到了影響，Yang et al[4]研究galectin-3在基因與蛋白水平的表達也不完全一致。

本實驗HT小鼠是通過尾部皮下注射免疫球蛋白進行造模，對于HT組小鼠動情期蛋白的低表達推測可能與子宮局部的免疫狀況相關(guān)。有報道[12-13]表明，IL-2、IL-4是免疫機制平衡中相對立的兩種細胞因子。IL-2、IL-4在體內(nèi)主要是由活化的T淋巴細胞產(chǎn)生，T淋巴細胞存在于機體各個器官，包括子宮組織，其中IL-2主要起促進炎癥作用，IL-4主要起抵抗炎癥作用[12-13]。本實驗通過CBA法檢測兩組小鼠子宮局部IL-2、IL-4的水平。結(jié)果顯示，HT組的IL-2、IL-4較對照組降低，提示HT小鼠體內(nèi)的免疫機制可能發(fā)生失衡，并推測這可能與HT組小鼠galectin-3蛋白的低表達有關(guān)。Karlsson et al[14]的研究表明，galectin-3參與IL-2及中性粒細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)并在炎癥病灶處大量產(chǎn)生，以清除炎癥部位的炎性介質(zhì)，減輕炎癥反應(yīng)。同時體外試驗表明, galectin-3的消除可阻斷IL-4的存活，減弱其抗炎的效應(yīng)[15]。這提示了在本實驗中，HT組小鼠內(nèi)膜的galectin-3可能傾向于調(diào)節(jié)促炎與抗炎反應(yīng)的穩(wěn)定，維持免疫機制的平衡，使得自身水平處于不斷變化之中。Kouo et al[7]的研究表明galectin-3可通過免疫調(diào)節(jié)改變機體免疫狀態(tài)的平衡。

綜上所述，HT小鼠子宮內(nèi)膜galectin-3蛋白在不同周期均有表達，動情期升高明顯，但較正常對照組降低，提示橋本小鼠可以妊娠，但在受精結(jié)合的關(guān)鍵環(huán)節(jié)即動情期可能受到影響。對于其妊娠受到影響的原因，推測可能與其子宮內(nèi)膜局部細胞因子的改變有關(guān)。