李 菁，朱 雪，欒菁菁，張曉平，2*

(1．山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南 250300;2．山東中醫(yī)藥大學(xué) 青島中醫(yī)藥科學(xué)院，山東 青島 266112)

金櫻子又名刺榆子、刺梨子、金罌子、山石榴、山雞頭子、糖罐，為薔薇科薔薇屬植物金櫻子(Rosa laevigata Michx．)的干燥成熟果實(shí)。主要產(chǎn)于四川、湖南、廣東、江西。10～11月果實(shí)成熟變紅時采收，干燥，除去毛、刺、核用。其氣微，味甘、微澀。以個大，色紅黃者為佳。生用。金櫻子藥性酸、甘、澀、平，歸腎、膀胱、大腸經(jīng)，具有固精縮尿［1］、收斂止瀉［2］的功效，主治腎虛精關(guān)不固之遺精滑精，膀胱失約之遺尿尿頻，沖任不固之崩漏帶下，脾虛之久瀉久痢。據(jù)《本草新編》等典籍記載，“遺精夢遺之癥，皆尿竅閉而精竅開，不兼用利水之藥以開尿竅，而僅用澀精之味以固精門，故愈澀而愈遺也”，其具有固精縮尿、固崩止帶、澀腸止瀉等功能。其主要化學(xué)成分有多糖、黃酮［3］類物質(zhì)、三萜類及其衍生物［4］等。金櫻子在我國也有較多研究。隨著現(xiàn)代科技的不斷進(jìn)步，對金櫻子的研究更加深入，對其功效也有了進(jìn)一步的了解。

本研究立足于在丙酮、甲醇、乙醇溶劑中金櫻子提取物含量的測定，通過分析其提取物對于病毒活性的抑制作用，發(fā)現(xiàn)金櫻子抗病毒作用的優(yōu)勢，為開發(fā)金櫻子作為抗病毒活性藥物奠定基礎(chǔ)。

1 儀器及材料

1．1 材料

金櫻子藥材(購置于漱玉平民大藥房，經(jīng)相關(guān)專家鑒定其滿足本實(shí)驗(yàn)要求)。

1．2 受體細(xì)胞以及侵染病毒

Hep2(人喉表皮樣癌細(xì)胞，為RSV受體細(xì)胞)、RD(人橫紋肌肉瘤細(xì)胞，為EV71受體細(xì)胞)、呼吸道合胞病毒、手足口病毒為山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供，本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)保存。

1．3 試劑

細(xì)胞培養(yǎng)液(美國 HyClone公司，批號:AAJ207653)，含10%新生牛血清及100 U/mL青霉素和鏈霉素，除菌，分別置于4℃下備用;細(xì)胞維持液(美國 HyClone公司，批號:AAJ207653)，含2%新生牛血清及100 U/mL青霉素及鏈霉素，除菌，分別置于4℃儲存?zhèn)溆?;新生牛血清(浙江天杭生物科技有限公司，批號:141013);PBS磷酸鹽緩沖液(美國HyClone公司，批號:AAK2－8442);EDTA－0．25%胰酶(美國Gibco公司，批號:1737903);CCK－8試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，編號:C0039);DMSO(amresco公司，批號:2705C127);丙酮(分析純)，甲醇(分析純)，乙醇(分析純)。

1．4 儀器

CO2恒溫培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司，批號:HF90);生物安全柜(上海力申科學(xué)儀器有限公司，批號:HFsafe－1200TE);倒置顯微鏡(Olympus公司，批號:CKX－31);酶標(biāo)儀(Molecular Device，Spectra Max M5)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2．1 供試品溶液的制備

取4份干燥的金櫻子藥粉20 g，過60目篩;分別用200 m L水、丙酮、甲醇、60%乙醇超聲提取30min，抽濾，濾液干燥，取產(chǎn)物用2%的二甲亞砜溶液配成16 mg/mL的供試品溶液待用。

2．2 藥物對細(xì)胞毒性的測定

用2%維持液將供試品藥物按二倍比稀釋10個濃度梯度，在已經(jīng)長好細(xì)胞的96孔板上依次接種，并設(shè)置4個復(fù)孔、空白對照孔和細(xì)胞對照孔，在37℃、5%CO2病毒培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長形態(tài)，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)90%的病變時停止培養(yǎng)，每孔加10μLCCK－8進(jìn)行染色處理，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長測定吸光度OD值。運(yùn)用Reed－Muench公式，計(jì)算藥物半數(shù)中毒濃度TC50，并確定細(xì)胞存活率在90%以上的最大無毒濃度TC0。

相關(guān)計(jì)算公式:

細(xì)胞存活率=(OD各組－OD病毒對照)/OD正常細(xì)胞×100%

細(xì)胞病變率=1－細(xì)胞存活率

細(xì)胞比距=(高于50%病變率－50%)/(高于50%病變率－低于50%病率)×100%

TCID50=Antilg(lg高于50%病變的病毒最高稀釋度+細(xì)胞比距×稀釋因子對數(shù))

2．3 藥物對被侵染細(xì)胞作用

供試品從無毒濃度起用2%1640培養(yǎng)基，按二倍比系列稀釋10個濃度，以每孔100μL的量接種在已經(jīng)長成單層細(xì)胞的96板孔上，每孔再加100μL100倍TCID50的病毒液，同時設(shè)陽性對照組(利巴韋林)、病毒對照組及空白對照組，每組4個復(fù)孔，置于37℃、5%CO2病毒培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 h于倒置顯微鏡下觀察一次細(xì)胞對照，待病毒對照出現(xiàn)90%以上的病變時，停止對細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)，每孔加10μLcck－8進(jìn)行染色處理，用酶標(biāo)儀在450 nm波長測定吸光度A值。應(yīng)用Reed－Muench公式計(jì)算藥物半數(shù)有效濃度(EC50)和治療指數(shù)(TI)。

EC50=［Antilog(高于50%CPE百分率病毒稀釋度的值－比距)］×C

治療指數(shù)(TI)=半數(shù)毒性濃度(TC50)/半數(shù)有效濃度(EC50)

3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及結(jié)果

圖1 EV71侵染RD細(xì)胞

圖2 RSV侵染Hep2細(xì)胞

表1 抗病毒作用結(jié)果

由表1可知，三種超聲提取物對兩種病毒均有抑制作用，對EV71的作用效果要優(yōu)于RSV，其中，60%乙醇超聲提取物對兩種病毒的抑制作用均較其他兩種提取方式好，其TI值分別為6．10和6．19;丙酮超聲提取物對兩種病毒的抑制作用較差，其TI值分別為4．51 和5．08。

4 討論

據(jù)臨床統(tǒng)計(jì)，病毒所導(dǎo)致的疾病在所有感染性疾病中所占的比例高達(dá)75%以上［5］，因此，抗病毒治療異常重要。然而，病毒對大多數(shù)抗生素等西藥并不敏感，而且西藥費(fèi)用昂貴，服用后不良反應(yīng)也比較大。中醫(yī)藥對病毒具有多重作用，很少產(chǎn)生耐藥性，不良反應(yīng)較小，價格低廉，部分藥物還兼有解熱、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等優(yōu)勢［6］。目前，據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)資料報(bào)道，抗病毒中藥［7］在臨床中的應(yīng)用，幾乎已經(jīng)遍及國內(nèi)目前常見的病毒感染性疾病，如流行性感冒、傳染性肝炎、流行性乙型腦炎、流行性出血熱、病毒性心肌炎、病毒性腸炎、流行性腮腺炎等［8］，治療效果顯著。

近年來，隨著禽流感病毒感染、流行性出血熱、埃博拉(Ebola virus)寨卡病毒等的出現(xiàn)和蔓延，中藥抗病毒研究再次成為熱點(diǎn)。目前，對中藥抗病毒［9］研究主要集中于從中藥中分離的化學(xué)單體;單味中藥及其提取物;中藥復(fù)方制劑等。從有效成分分布來看，幾乎遍及生物堿類、黃酮類、苷類、揮發(fā)油、有機(jī)酸、氨基酸、酚、醛、鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)、多糖和單糖等。金櫻子水煎液中含有 Mn、Ca、Fe 、Mg 、Cu、Zn、Ni、Cr、Co 9 種微量元素［10］，其中 Mn、Ca、Fe 3種元素具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而其他元素溶出比較少。研究發(fā)現(xiàn)金櫻子的活性成分主要為有機(jī)酸、多糖、黃酮類物質(zhì)、三萜類及其衍生物等，藥理作用主要有抗氧化、抗菌、抗炎、免疫活性、降糖降脂等作用［11］。金櫻子是一種藥食兩用植物［12］，不僅含有糖、酸、蛋白質(zhì)、維生素等多種營養(yǎng)成分，而且含有類黃酮、多糖和糖苷元、三萜類有機(jī)酸、烏所酸、齊墩果酸、兒茶酸、谷甾醇等多種人體生命活性物質(zhì)和人體生長發(fā)育必需的微量元素。人們對金櫻子的研究主要集中在藥效、制劑等方面，并且研究得不深入。金櫻子化學(xué)成分復(fù)雜，人們對其藥理作用及其他成分的研究還較淺?，F(xiàn)代藥理研究證明:金櫻子煎煮液針對于金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、痢疾桿菌及流感病毒有著較強(qiáng)的抑菌作用或抗病毒作用;金櫻子果實(shí)是有極大開發(fā)利用價值的第三代野生水果，既是一種良好的天然綠色食品，同時也可作為保健食品的基料，具有很大的開發(fā)價值?？傊?，金櫻子具有很大的潛在價值，這還需要我們不斷的深入研究，相信通過對金櫻子進(jìn)一步的研究，它將會發(fā)揮更大的作用。

超聲提取的方法與其他實(shí)驗(yàn)方法相比，具有縮短實(shí)驗(yàn)提取時間、降低提取溫度、提高實(shí)驗(yàn)提取效率、便于產(chǎn)品的純化、對提取物的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)無影響等優(yōu)點(diǎn)，因此，本研究選取超聲法提取金櫻子。選擇甲醇、丙酮、60%乙醇作為提取溶劑的原因，是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室內(nèi)部經(jīng)過長期對抗病毒藥物的篩選，發(fā)現(xiàn)這幾種溶劑提取物抗病毒效果普遍較好。

實(shí)驗(yàn)研究表明，金櫻子60%乙醇超聲提取物抗病毒效果較好，乙醇作為一種提取溶劑，可將中藥的大學(xué)部分成分(如苷類、多糖、鞣質(zhì)、有機(jī)酸鹽、蛋白質(zhì)、酶和少量揮發(fā)油)不同程度的提取出來，且極性比甲醇、丙酮大。但其抗病毒物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，應(yīng)對其進(jìn)一步研究。