蔡 琳

(徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇徐州 221006)

1 實(shí)驗(yàn)材料

1．1 藥材與試劑

四甲基偶氮唑鹽(MTT)，二甲基亞砜(DMSO)，DMEM/F12培養(yǎng)基，胰蛋白酶，膠原酶，5－溴－2－脫氧尿嘧啶核苷(5－BRDU)，胎牛血清(FBCS)，青霉素，鏈霉素。

1．2 儀器與設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱，生物潔凈工作臺(tái)，倒置相差顯微鏡，Milli－Q超純水處理裝置，酶標(biāo)儀，不銹鋼正壓濾器，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，循環(huán)水式真空泵，恒溫水浴鍋，電子天平:，真空干燥箱，血球計(jì)數(shù)板，96孔無(wú)菌培養(yǎng)板，200目細(xì)胞篩。

手術(shù)器械:手術(shù)刀、手術(shù)剪、鑷子、5 mL無(wú)菌注射器、1 mL無(wú)菌注射器、50 mL滅菌錐形瓶、碘酒、75%酒精。

2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程與結(jié)果

2．1 連二亞硫酸鈉(Na2 S2 O4)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷模型的建立

將細(xì)胞按照5．0×105個(gè)/mL接種于96孔板上，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為①正常對(duì)照組:正常的高糖培養(yǎng)液培養(yǎng);②低糖培養(yǎng)液組;③Na2S2O4模型組:同一板上不同列加入濃度分別為800、400、200、100、50μmol/L的Na2S2O4溶液+低糖培養(yǎng)液組作用1 h后，換成正常的高糖培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)MTT法檢測(cè)吸光度值A(chǔ)492，計(jì)算細(xì)胞活力，以確定最佳損傷濃度［1］。

2．2 MTT法藥效檢測(cè)

2．2．1 實(shí)驗(yàn)原理

MTT法是檢測(cè)細(xì)胞增值的經(jīng)典方法，可間接反映細(xì)胞的數(shù)目。活細(xì)胞線粒體中含有脫氫酶，脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶狀甲瓚(Formazan)顆粒，沉淀在細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞周圍，而死細(xì)胞無(wú)此功能。在一定細(xì)胞濃度范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量與細(xì)胞的數(shù)目成正比。用二甲基亞砜(DMSO)溶解細(xì)胞中的藍(lán)紫色結(jié)晶物，用酶標(biāo)儀檢測(cè)其光密度值大小可以用Formazan的多少，間接反映細(xì)胞數(shù)量，即反映細(xì)胞的活力。

2．2．2 具體方法

取培養(yǎng)2～3 d，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞96孔培養(yǎng)板，每孔100μL，繼續(xù)培養(yǎng)約12 h待細(xì)胞貼壁完全。設(shè)加藥試驗(yàn)孔、空白對(duì)照孔(加細(xì)胞，但不加藥物)和空白調(diào)零孔(只加培養(yǎng)基，酶標(biāo)儀調(diào)零用)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔加20μL(5 mg/mL)MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸凈孔內(nèi)上清液，每孔加入150μLDMSO。在微量振蕩器上振搖10 min使紫色結(jié)晶溶解。用酶標(biāo)儀在492 nm處掃描，測(cè)定吸光值(OD);計(jì)算細(xì)胞存活率和損傷抑制率［2］。

細(xì)胞存活率=OD實(shí)驗(yàn)/OD對(duì)照×100%。

2．2．3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用X(－)±S表示。P＜0．05或P＜0．01提示有異顯著差或高度顯著性水平。采用SPSS16．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，組間比較用單因素方差和LSD檢驗(yàn)分析。

2．3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2．3．1 存活心肌細(xì)胞確認(rèn)

倒置顯微鏡下，胰蛋白酶與膠原酶Ⅰ的混合溶液消化后的心肌細(xì)胞呈圓形，懸浮。臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)示心肌細(xì)胞存活率達(dá)96%。4 h后開(kāi)始逐漸貼壁，高度折光，初為放射狀的圓形，后為梭形，細(xì)胞在瓶壁逐漸展開(kāi)、伸出偽足，似島嶼狀，變?yōu)槿切?、多邊形等不?guī)則的形態(tài)。24 h后可見(jiàn)細(xì)胞陸續(xù)伸出偽足。細(xì)胞團(tuán)最先開(kāi)始搏動(dòng)，隨后，可見(jiàn)單個(gè)細(xì)胞開(kāi)始搏動(dòng)，搏動(dòng)頻率各異，多在50～120次/min次左右。48 h大部分細(xì)胞都伸出偽足，形成不規(guī)則的星形，同步搏動(dòng)頻率為60～90次/min［3－4］。

2．3．2 Na2S2O4損傷濃度與細(xì)胞存活率的關(guān)系

取接種完成的96孔板，隨機(jī)分成6組，①正常對(duì)照組:不進(jìn)行任何處理，只加相應(yīng)體積的DMEM/F12培養(yǎng)液，溫度為37℃、5%CO2飽和濕度的條件下常規(guī)培養(yǎng);②缺血/再灌注性損傷模型組:分別加入800、400、200、100、50 μmol/L 的 Na2S2O4溶液，在溫度為37℃、5%CO2飽和濕度的條件下常規(guī)培養(yǎng)1 h后，換成正常的DMEM/F12培養(yǎng)液，繼續(xù)在在溫度為37℃、5%CO2飽和濕度的條件下常規(guī)培養(yǎng)［5－6］。MTT法檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1與圖1。

表1 Na2 S2O4損傷濃度與細(xì)胞存活率的關(guān)系

圖1 Na2 S2 O4損傷濃度與細(xì)胞存活率的關(guān)系

以正常對(duì)照組心肌細(xì)胞的吸光度值作為對(duì)照，對(duì)不同濃度Na2S2O4損傷模型組心肌細(xì)胞進(jìn)行活力測(cè)定。結(jié)果顯示，各濃度 Na2S2O4(800、400、200、100、50 μmol/L)損傷組心肌細(xì)胞的活力均有所下降，與正常濃度組比較均有顯著性差異(P＜0．05)，且Na2S2O4對(duì)心肌細(xì)胞的損傷效應(yīng)呈劑量依賴性，隨濃度增加，逐漸出現(xiàn)細(xì)胞功能改變，凋亡甚至死亡。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，低濃度的Na2S2O4主要造成心肌細(xì)胞的氧化損傷，而高濃度的心肌細(xì)胞造成缺血/再灌注損傷。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，參照文獻(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)采用選擇400μmol/L的Na2S2O4損傷1 h建立心肌細(xì)胞的缺血/再灌注損傷模型［7－8］。

2．3．3 Na2S2O4損傷時(shí)間與細(xì)胞存活率的關(guān)系

表2 Na2 S2 O4損傷時(shí)間與細(xì)胞存活率的關(guān)系

圖2 Na2 S2O4損傷時(shí)間與細(xì)胞存活率的關(guān)系

取接種完成的96孔板，隨機(jī)分成6組，①正常對(duì)照組:不進(jìn)行任何處理，只加相應(yīng)體積的DMEM/F12培養(yǎng)液，溫度為37℃、5%CO2飽和濕度的條件下常規(guī)培養(yǎng);②缺血/再灌注性損傷模型組:分別加入400μmol/L的Na2S2O4溶液，在溫度為37℃、5%CO2飽和濕度的條件下分別常規(guī)培養(yǎng) 0．5、1、2、4、8 h 后，換成正常的DMEM/F12培養(yǎng)液，繼續(xù)在在溫度為37℃、5%CO2飽和濕度的條件下常規(guī)培養(yǎng)。MTT法檢驗(yàn):結(jié)果見(jiàn)表2，圖2。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，隨著損傷劑作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的存活率明顯下降，為使實(shí)驗(yàn)以滿足冠心病的心肌損傷的實(shí)際要求，且更加具有可信性，本實(shí)驗(yàn)選擇存活率在50%左右劑量為最佳的劑量，因此選擇濃度為400μmol/L的Na2S2O4損傷心肌細(xì)胞1 h作為心肌細(xì)胞缺血/再灌注性損傷的最佳劑量。

3 小結(jié)

低濃度的Na2S2O4主要造成心肌細(xì)胞的氧化損傷，而高濃度的心肌細(xì)胞造成缺血/再灌注損傷。隨著損傷劑作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的存活率明顯下降，為使實(shí)驗(yàn)以滿足冠心病的心肌損傷的實(shí)際要求，且更加具有可信性，本實(shí)驗(yàn)選擇選擇濃度為400μmol/L的Na2S2O4損傷心肌細(xì)胞1 h作為心肌細(xì)胞缺血/再灌注性損傷的最佳劑量。