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(1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院,浙江寧波 315211;2.寧波大學(xué)科學(xué)技術(shù)學(xué)院,浙江寧波 315211)

墨魚是軟體門,頭足綱,十腕目,烏賊科,也叫目魚、烏賊魚等,中國(guó)的墨魚大多源自中國(guó)東海,有曼氏無(wú)針烏賊和金烏賊兩個(gè)種。墨魚是我國(guó)著名的海產(chǎn)品之一,與大黃魚、小黃魚、帶魚統(tǒng)稱為“四大經(jīng)濟(jì)魚類”,深受廣大消費(fèi)者喜愛[1]。墨魚纏卵腺是雌性生殖腺的附屬腺,因形似禽蛋,所以又稱墨魚蛋,墨魚蛋營(yíng)養(yǎng)豐富,解暑驅(qū)寒,具有開胃利水的功效,是我國(guó)古代八珍之一[2]。

糖蛋白是由分支的寡糖鏈與多肽鏈共價(jià)結(jié)合形成的一類重要的生物大分子,在生物體中有著至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞識(shí)別、免疫保護(hù)、代謝調(diào)控等都與糖蛋白中的糖鏈有關(guān)[3-4]。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外研究人員對(duì)糖蛋白的研究越來(lái)越重視,根據(jù)糖蛋白的溶解性不同,研究人員通過水提法、鹽提法、酸堿提法及有機(jī)溶劑等方法提取生物體中的糖蛋白。包郁明等[5]通過丙酮脫脂、NaCl溶液超聲浸提、硫酸銨分級(jí)沉淀、透析,柱層析等從鮑魚臟器中提取了一種糖蛋白,經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳發(fā)現(xiàn),該糖蛋白純度達(dá)到電泳純,分子質(zhì)量為73.7 kDa。王倩等[6]采用NaOH溶液在魷魚纏卵腺中提取了糖蛋白,經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化工藝,得出魷魚纏卵腺糖蛋白的最佳提取工藝為提取時(shí)間3.44 h,提取溫度25 ℃,NaOH濃度為0.37 mol/L,在此工藝條件下糖蛋白提取率為12.79%。隨著海洋生物的深入研究,關(guān)于海洋生物中糖蛋白的研究,也逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究的熱門。目前已有從海蜇[7]、海兔[8]、河蜆[9]、魷魚[10]、章魚[11]等海洋生物中提取了糖蛋白,發(fā)現(xiàn)其具有顯著的抗氧化、抗疲勞、降血脂等功效。目前尚未有發(fā)現(xiàn)墨魚蛋糖蛋白的研究。

糖蛋白的純化是指去除粗糖蛋白中的小分子蛋白、糖等雜質(zhì),主要參考蛋白和多糖的純化方法,目前國(guó)內(nèi)外較常用的分離方法有色譜法[12-13]、膜分離法[14]、電泳法[15]。Wang等[16]采用DEAE-52 celloulus陰離子交換柱層析結(jié)合凝膠柱層析、電泳法,對(duì)大蒜中的糖蛋白進(jìn)行提純、鑒定,得到一種純度達(dá)到電泳純的糖蛋白,為本文的提純方法提供了一定的設(shè)計(jì)思路。

本課題參考王倩[17]的提取方法在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用堿法提取,選擇NaOH濃度、提取時(shí)間、提取溫度、料液比、超聲功率為單因素,對(duì)墨魚纏卵腺糖蛋白提取工藝進(jìn)行了研究,結(jié)合Wang等[16]、Senthilkumar等[18]的方法,運(yùn)用DEAE-52柱層析、Sephacryl S-300HR柱層析,對(duì)糖蛋白粗提物進(jìn)行純化,得到純化后的糖蛋白再進(jìn)行SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn),鑒定其純度,為后續(xù)墨魚纏卵腺糖蛋白的結(jié)構(gòu)及生物活性研究提供基礎(chǔ)保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

墨魚纏卵腺 寧波市江北區(qū)路林市場(chǎng),清理后除去外層薄膜置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?30%的丙烯酰胺、1.5 mol/L的Tris-HCl、1 mol/L的Tris-HCl、10% SDS、10%過硫酸銨、TEMED試劑、Schiff試劑 Solarbio公司;乙醇、氫氧化鈉、濃硫酸、葡萄糖、蒽酮、牛血清蛋白、DEAE-52、考馬斯亮藍(lán)R-250、磷酸、PBS(pH7.4)、鹽酸、高碘酸、偏重亞硫酸鈉、三氯乙酸等 均為分析純。

GL21MC型冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;UV-3300型紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司;DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠;HD-A層析系統(tǒng)(泵、紫外檢測(cè)器、記錄儀、收集器、控制器) 上海滬西分析儀器廠有限公司;DYY-12型電泳儀 北京市六一儀器廠;KYC-100B空氣恒溫?fù)u床 寧波江南儀器廠;MD44透析袋(截留分子量8000～14000 Da) 北京索萊寶科技有限公司;DY89-Ⅱ型勻漿機(jī) 寧波新芝儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程 取2 g墨魚纏卵腺,去外層薄膜,洗凈加一定量的NaOH溶液8000 r/min勻漿2 min,超聲波控溫反應(yīng)一定時(shí)間后離心10000 r/min 15 min,取上清,2倍無(wú)水乙醇醇沉4 h,放入透析袋中透析48 h,冷凍干燥機(jī)中-60 ℃(下同)凍干得粗品。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 以粗糖蛋白得率為指標(biāo),選定NaOH濃度、提取溫度、提取時(shí)間、料液比、超聲波功率為單因素,設(shè)定基本條件為NaOH濃度0.3 mol/L、提取溫度25 ℃、提取時(shí)間2 h、料液比1∶20 g/mL、超聲波功率180 W,改變其中一個(gè)條件,其它條件保持不變,分別考察NaOH濃度(0.1、0.3、0.5、0.8、1.2 mol/L)、提取溫度(4、15、25、35、45 ℃)、提取時(shí)間(0.5、1、2、3、4、5 h)、料液比(1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40 g/mL)和超聲波功率(40、80、120、160、200 W)等因素對(duì)墨魚纏卵腺糖蛋白得率的影響,每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行,結(jié)果取平均值。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以NaOH濃度、提取溫度、提取時(shí)間三個(gè)因素為因子,粗糖蛋白得率為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次,結(jié)果取平均。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素表見表1。

表1 Box-Benhnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Box-Benhnken experimental factor level table

1.2.4 粗糖蛋白得率的測(cè)定

得率(%)=(粗糖蛋白凍干質(zhì)量/干物料質(zhì)量)×100

1.2.5 糖蛋白純化

1.2.5.1 DEAE-52陰離子交換柱層析 運(yùn)用HD-A層析系統(tǒng)將響應(yīng)面優(yōu)化條件下制備的粗糖蛋白按1∶50的比例溶解在緩沖液中(pH7.4的PBS),微膜過濾(孔徑0.1～1 μm),過DEAE-52陰離子交換柱,用NaCl梯度洗脫(濃度范圍0～1 mol/L),洗脫速度為1 mL/min,每隔1 min記錄蛋白280 nm下的吸光度值,收集每個(gè)蛋白峰的流出液,再用硫酸蒽酮法測(cè)糖含量,收集既有糖又有蛋白的峰,凍干得糖蛋白半純品[19]。

1.2.5.2 Ssphacyl S-300HR柱層析 運(yùn)用HD-A層析系統(tǒng)將糖蛋白半純品按1∶50的比例溶解在pH7.4的PBS緩沖液中,0.1～1 μm微膜過濾,再用該緩沖液洗脫,洗脫速度為0.5 mL/min,每隔1 min記錄蛋白吸光度值,收集每個(gè)蛋白峰流出液,分別檢測(cè)糖含量,收集既有蛋白又有糖的峰,蒸餾水透析24 h,凍干得糖蛋白純品[5]。

1.2.5.3 SDS-PAGE電泳 電泳樣品預(yù)處理:取10 mL濃度為1 g/100 mL的糖蛋白樣品,加入2 μL電泳緩沖液。10%分離膠、5%濃縮膠、80 V起始電壓,待樣品進(jìn)入分離膠后電壓升至100 V,同一塊膠進(jìn)行蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)R-250染色,PAS糖染色[19],觀察電泳條帶。

1.2.6 墨魚纏卵腺純化物基本成分含量測(cè)定 總糖含量測(cè)定:采用硫酸-蒽酮法[20]測(cè)定,以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)作圖,線性回歸分析得標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=0.0047x-0.0038,R2=0.9997,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算糖含量,計(jì)算公式如下:

式(1)

式(1)中:y-墨魚纏卵腺中總糖含量,g;m-樣品溶液中總糖含量,g;M-干物料質(zhì)量,g。

蛋白含量測(cè)定:采用考馬斯亮藍(lán)R-250法[21],以牛血清清蛋白的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)作圖,線性回歸分析得標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y(%)=0.0061x+0.0056,R2=0.9996,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白含量,計(jì)算公式如下:

式(2)

式(2)中:y-墨魚纏卵腺中蛋白含量,g;m-樣品溶液中蛋白含量,g;M-干物料質(zhì)量,g。

脂類測(cè)定:參照GB/T 14772-2008進(jìn)行[22];水分測(cè)定:采用水分測(cè)定儀;灰分測(cè)定:采用馬弗爐灼燒法[5]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)條件的確立

2.1.1 NaOH濃度對(duì)墨魚纏卵腺糖蛋白提取工藝的影響 由1圖可知,隨著NaOH濃度的增大,得率呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì),當(dāng)NaOH濃度達(dá)到0.4 mol/L時(shí),糖蛋白得率達(dá)到最大值11.22%,NaOH濃度超過0.4 mol/L時(shí)蛋白含量,糖蛋白得率明顯下降,可能是因?yàn)镹aOH濃度過高破壞了糖蛋白的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致糖和蛋白的結(jié)合斷裂,使得得率直線下降[17],因此選擇最佳NaOH濃度為0.4 mol/L。

圖1 NaOH濃度對(duì)墨魚纏卵腺糖蛋白得率的影響Fig.1 Effects of NaOH concentration on the extraction yield of nidamental gland glycoprotein from cuttlefish

2.1.2 提取溫度對(duì)墨魚纏卵腺糖蛋白提取工藝的影響 由2圖可知,糖蛋白得率隨著溫度的升高,呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì),在25 ℃時(shí)達(dá)到最大值10.33%,當(dāng)溫度低于25 ℃時(shí),可能由于在低溫條件下糖蛋白在NaOH溶液中的溶出率不高,導(dǎo)致糖蛋白得率低,而溫度過高則導(dǎo)致糖蛋白糖鏈斷裂,小分子糖無(wú)法在乙醇中沉淀,影響糖蛋白得率[24],因此選擇最佳浸提溫度為25 ℃。

圖2 不同提取溫度對(duì)墨魚纏卵腺糖蛋白得率的影響Fig.2 Effects of different temperature on the extraction yield of nidamental gland glycoprotein from cuttlefish

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)墨魚纏卵腺糖蛋白提取工藝的影響 由3圖可知,在浸提時(shí)間小于3 h時(shí),糖蛋白得率隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大,在3～4 h之間糖蛋白得率相差不大,達(dá)到9%左右,但當(dāng)浸提時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，得率開始降低,可能是由于浸提時(shí)間過長(zhǎng)糖蛋白分解成小分子蛋白和糖[23],在后期純化過程中被除去,導(dǎo)致得率降低。因此選擇浸提時(shí)間3或4 h為最佳浸提時(shí)間。

圖3 不同提取時(shí)間對(duì)墨魚纏卵腺糖蛋白得率的影響Fig.3 Effects of different time on the extraction yield of nidamental gland glycoprotein from cuttlefish

2.1.4 料液比對(duì)墨魚纏卵腺糖蛋白提取工藝的影響 由圖4可知,料液比在1∶5 g/mL時(shí),浸提液中NaOH含量相對(duì)偏低,使得糖蛋白無(wú)法充分富集,導(dǎo)致糖蛋白得率較低,料液比在1∶20 g/mL時(shí),糖蛋白得率達(dá)到11.53%,再增加浸提液量,糖蛋白得率無(wú)明顯變化,并且浸提液過多時(shí),糖蛋白不易收集。綜合考慮選擇最佳料液比1∶20 g/mL,并不繼續(xù)對(duì)料液比進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化研究。

圖4 不同料液比對(duì)墨魚纏卵腺糖蛋白得率的影響Fig.4 Effects of different solid-liquid ratio on the extraction yield of nidamental gland glycoprotein from cuttlefish

2.1.5 超聲功率對(duì)墨魚纏卵腺糖蛋白提取工藝的影響 由圖5可知,糖蛋白隨著超聲功率的增大而增大,超聲波促進(jìn)了糖蛋白在NaOH溶液中的溶解度,使得糖蛋白得率明顯增加,因此選擇超聲功率200 W作為糖蛋白提取的最佳超聲功率,且不對(duì)其進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化研究。

圖5 不同超聲功率對(duì)墨魚纏卵腺糖蛋白得率的影響Fig.5 Effects of different ultrasonic power on the extraction yield of nidamental gland glycoprotein from cuttlefish

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化墨魚纏卵腺糖蛋白提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及方差分析

2.2.2 回歸模型方差分析 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2,采用Design-Expert 8.06對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多項(xiàng)擬合回歸,得到糖蛋白得率Y的回歸方程模型:Y=16.06-0.4A+0.37B-0.97C-0.29AB+0.17AC+0.31BC-1.36A2-0.54B2-1.67C2。該回歸方程中各項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值表示該因素對(duì)響應(yīng)值影響程度的大小,系數(shù)的正負(fù)則表示該因素對(duì)響應(yīng)值影響的方向[24]。

表2 響應(yīng)面結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface method

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析 利用Design-Expert V8.0.6軟件分析,得到的3D圖可直觀反映響應(yīng)因素,如圖6所示。

圖6 各因素交互作用響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface graph between the various factors interaction effect

由圖6可知,提取溫度和提取時(shí)間,提取時(shí)間和NaOH濃度的交互作用呈橢圓形狀,曲面陡峭,說明提取溫度與提取時(shí)間之間交互作用和提取時(shí)間與NaOH濃度的交互作用對(duì)糖蛋白得率影響較強(qiáng),而提取溫度與NaOH濃度之間的交互作用等高線較疏,表明提取溫度與NaOH濃度交互作用對(duì)糖蛋白得率的影響較弱[27],這與方差分析中回歸模型的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果一致,由圖6可知,響應(yīng)面最高點(diǎn)在所選范圍內(nèi),說明糖蛋白得率存在最大值。

2.2.4 墨魚纏卵腺糖蛋白最佳提取工藝確定及驗(yàn)證 利用Design Expert 8.06軟件對(duì)糖蛋白提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,得到墨魚纏卵腺糖蛋白的最佳提取工藝參數(shù)為提取溫度24.01 ℃,提取時(shí)間3.66 h,NaOH濃度0.37 mol/L,料液比1∶20 g/mL,超聲功率200W,此條件下,墨魚纏卵腺糖蛋白提取得率預(yù)測(cè)值為16.2862%,結(jié)合現(xiàn)實(shí)條件,將實(shí)際工藝簡(jiǎn)化為:溫度24 ℃,時(shí)間3.6 h,NaOH濃度0.4 mol/L,料液比1∶20 (g/mL),超聲功率200 W。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn),得出墨魚纏卵腺糖蛋白實(shí)際得率為16.13%±0.16%,與預(yù)測(cè)值誤差僅為0.96%,任艷國(guó)等[7]采用緩沖液法在海蜇頭中提取糖蛋白得率為9.14%,曾婷婷等[9]采用超聲輔助鹽溶液法提取河蜆中的糖蛋白,得率僅為0.4466%,說明堿法提取糖蛋白效果較好,該模型對(duì)優(yōu)化墨魚纏卵腺糖蛋白提取工藝具有可行性。

2.3 糖蛋白純化結(jié)果

2.3.1 DEAE-52純化 將凍干的糖蛋白粗品經(jīng)DEAE-52纖維素陰離子交換層析柱層析,用0～1 mol/L的NaCl洗脫，分別檢測(cè)蛋白和糖含量,得到流出曲線如圖7。

如圖7所示,經(jīng)層析柱分離,每隔1 min收集流出液,用硫酸-蒽酮法在吸光度為620 nm處檢測(cè)糖含量,發(fā)現(xiàn)有兩組重疊峰(11～20 min,21～31 min),由于21～31 min的重疊峰中含有兩個(gè)糖峰,考慮到后期純化過程,故選擇11～20 min時(shí)的重疊峰為研究對(duì)象,經(jīng)透析,冷凍干燥得糖蛋白半純品。

圖7 DEAE-52柱層析分離圖譜Fig.7 DEAE-52 column chromatography separation map

2.3.2 Sephacyl S-300 HR柱層析 將凍干的糖蛋白半純品經(jīng)Sephacyl S-300 HR柱層析,用0.02 mol/L的PBS(pH7.4)緩沖液洗脫分別檢測(cè)蛋白和糖的吸光值,得到流出曲線如圖8。

圖8 Sephacyl S-300 HR柱層析分離圖譜Fig.8 Sephacyl S-300 HR column chromatography separation map

由圖8可知,經(jīng)過Sephacyl S-300 HR柱層析,采用硫酸-蒽酮法在吸光度為620 nm處檢測(cè)糖的吸光值,得到一組重疊組峰,收集高峰重疊部分,經(jīng)透析,凍干后得到白色糖蛋白純品。

2.3.3 SDS-PAGE電泳鑒定純化后的糖蛋白 通過蛋白染色和糖染色條帶可以發(fā)現(xiàn),兩塊染色膠在同一位置顯示條帶,且都只有一個(gè)條帶,說明純化物是糖蛋白,純度達(dá)到電泳純。根據(jù)marker條帶顯示墨魚纏卵腺糖蛋白的分子量約為80 kDa。

圖9 SDS-PAGE電泳圖Fig.9 SDS-PAGE Electrophoresis注:1:電泳標(biāo)準(zhǔn)蛋白(marker);2～4:墨魚纏卵腺糖蛋白考馬斯亮藍(lán)染色條帶;5～7:墨魚纏卵腺糖蛋白PAS染色條帶。

2.3.4 墨魚纏卵腺糖蛋白各組分含量 由表4可知,墨魚纏卵腺去外層薄膜后脂類含量較少,水分、蛋白、糖含量較多,純化后得到純化物的蛋白含量為65.53%±0.8%,糖含量為31.74%±1.1%,說明提取純化過程有效。

表4 墨魚纏卵腺原料、墨魚纏卵腺糖蛋白基本成分(%)Table 4 Basic ingredients of cuttlefish egg-wrapping glands and cuttlefish egg-wrapping glands glycoprotein(%)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用單因素結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化墨魚纏卵腺糖蛋白提取工藝,采用Design-Expert軟件的中心組合設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。根據(jù)分析結(jié)果并結(jié)合操作實(shí)際得出墨魚纏卵腺糖蛋白最佳提取工藝為:溫度24 ℃,時(shí)間3.6 h,NaOH濃度0.4 mol/L,料液比1∶20 g/mL,超聲功率200 W。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),得出墨魚纏卵腺糖蛋白實(shí)際得率為16.13%±0.16%,與預(yù)測(cè)值誤差僅為0.96%,說明該模型對(duì)優(yōu)化墨魚纏卵腺糖蛋白提取工藝具有可行性。

對(duì)最優(yōu)工藝下的提取物進(jìn)行純化,經(jīng)EDAE-52離子交換柱層析分離、Sephacryl S-300HR柱層析分離后得到純品糖蛋白,經(jīng)電泳分析得出所純化的糖蛋白純度達(dá)到電泳純,其中蛋白含量為65.53%±0.8%,總糖含量為31.74%±1.1%,得率為墨魚纏卵腺去外層薄膜原料的0.91%。