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(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010110;2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑部,內(nèi)蒙古呼和浩特 010059)

鼠李糖乳桿菌(LactobacillusrhamnosusGG,LGG)屬于乳桿菌屬(Lactobacillus),最適生長(zhǎng)溫度37 ℃,兼性厭氧[1-2]。LGG由兩位美國(guó)科學(xué)家Sherwood Gorbach和Barry Goldin在上世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn),該菌分離自健康人體腸道[3],大量研究證明LGG能夠定植于腸道,通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群,起到抵御病原微生物的侵襲等作用,具有預(yù)防和治療腹瀉、預(yù)防呼吸道感染、預(yù)防齲齒、抗過(guò)敏的作用,提高機(jī)體免疫力等功效[4],LGG在酸奶、飲料、奶粉、奶酪、保健品等均有應(yīng)用。

通常,LGG可通過(guò)液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝獲得,進(jìn)一步通過(guò)冷凍干燥的方法獲得菌粉,菌粉是微生物的最佳保存方式,然而冷凍干燥會(huì)不可避免的造成乳桿菌細(xì)胞膜的損傷,具體的損傷包括:機(jī)械損傷、溶質(zhì)損傷、細(xì)胞膜滲透性損傷[5]、蛋白質(zhì)變性失活、pH平衡的破壞和細(xì)胞膜脂肪酸的變化[6-7]。然而,微生物也會(huì)通過(guò)改變膜的流動(dòng)性和改變蛋白質(zhì)的翻譯來(lái)適應(yīng)低溫環(huán)境。冷休克蛋白(cold shock proteins,Csps)是微生物為適應(yīng)低溫環(huán)境產(chǎn)生的應(yīng)激蛋白,大腸桿菌在低溫誘導(dǎo)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量GspA蛋白,可占到細(xì)胞總蛋白合成的13%,隨后又發(fā)現(xiàn)了8中同源性蛋白:CspB、CspC、CspD、CspE、CspF、CspG、CspH、CspI蛋白[8]。枯草芽孢桿菌在低溫環(huán)境下有13個(gè)Csps蛋白被誘導(dǎo)產(chǎn)生。在低溫條件下Csps蛋白可以作為RNA的分子伴侶,與mRNA結(jié)合,穩(wěn)定RNA,促進(jìn)菌體在低溫條件下轉(zhuǎn)錄并翻譯[9],其中CspA、CspB、CspG、CspI蛋白在低溫誘導(dǎo)下產(chǎn)生,CspC、CspE蛋白在正常培養(yǎng)條件下產(chǎn)生[10,11]。然而,與CspA蛋白不同的是CspC蛋白的表達(dá)量隨溫度的升高而降低,使用基因敲除的方法去除大腸桿菌的cspc基因后,發(fā)現(xiàn)菌體的生長(zhǎng)明顯加快[12]。說(shuō)明CspC有抑制菌體生長(zhǎng)的作用,因此在生長(zhǎng)過(guò)程中抑制CspC蛋白的表達(dá)可能會(huì)有利于提高菌體的生長(zhǎng)速率。然而對(duì)于LGGcspcmRNA基因的研究還未見報(bào)道。

本文通過(guò)對(duì)LGG進(jìn)行溫度誘導(dǎo)處理,通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)的方法檢測(cè)cspc的表達(dá),并且對(duì)誘導(dǎo)后的菌體進(jìn)行生長(zhǎng)速率的測(cè)定,以考察溫度誘導(dǎo)對(duì)cspcmRNA基因表達(dá)的影響,以及對(duì)菌體生長(zhǎng)速率的影響,揭示cspcmRNA基因與生長(zhǎng)速率的關(guān)系,為提高LGG的產(chǎn)量提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鼠李糖乳桿菌(LactobacillusrhamnosusGG,LGG)GD20150520 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生物制藥實(shí)驗(yàn)室;酪蛋白胨、酵母粉、牛肉粉 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;葡萄糖、乙酸鈉、檸檬酸三銨、吐溫-80、MgSO4、K2HPO4、瓊脂粉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;cspc基因引物序列(F:5′-TGATAA GGGTTACGGCTTCA′,R:5′-GGCCACGATCAGATTG TTCTAC-3′),產(chǎn)物長(zhǎng)度140 bp、16S rDNA引物序列(F:5′-TAGCGTACCATCTGATCCAGTA′,R:5′-GAAGTCGTCGCGTTGACA-3′),產(chǎn)物長(zhǎng)度187 bp 美國(guó)Invitrogen;RNA提取試劑盒(RNAiso PlusD9108A)、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT reagent KitDRR037A)、RT-PCR試劑盒 日本Takara。

ViiA7熒光定量PCR儀 美國(guó)ABI;Mini-sub cell GT電泳儀 美國(guó)Bio-Rad;Mutiskan FC酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鼠李糖乳桿菌的發(fā)酵 培養(yǎng)菌種采取四級(jí)發(fā)酵培養(yǎng)方法,一、二、三級(jí)為種子擴(kuò)大培養(yǎng)基,四級(jí)為最終發(fā)酵培養(yǎng)基,一級(jí)培養(yǎng)基接入0.3 g的凍干菌種,混勻,放置恒溫厭氧培養(yǎng)箱37 ℃靜置培養(yǎng)16 h。二級(jí)培養(yǎng)基由培養(yǎng)好的一級(jí)發(fā)酵液按4%的接種量接入,培養(yǎng)12 h。以此類推,傳代到四級(jí)最終發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2.2 活菌數(shù)的測(cè)定 采用平板混菌計(jì)數(shù)法[13]。

1.2.3 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 四級(jí)發(fā)酵液按不同的時(shí)間點(diǎn)(0、1、2、3、4、6、8、10、12、16、20 h)取樣,測(cè)定發(fā)酵液活菌數(shù),制作生長(zhǎng)曲線。

1.2.4cspcmRNA基因表達(dá)量法檢測(cè) mRNA的表達(dá)量根據(jù)GenBank上報(bào)道的鼠李糖乳桿菌的cspc基因序列,利用Prime5.0軟件設(shè)計(jì)RT-PCR法檢測(cè)cspc基因的引物。提取鼠李糖乳桿菌總RNA,按試劑盒說(shuō)明書方法操作,用酶標(biāo)儀檢測(cè)RNA純度,OD260/OD280在1.8～2.0為符合要求的RNA。反轉(zhuǎn)錄cDNA,按照試劑盒說(shuō)明操作,RNA上樣量為2.0 μL(約500 ng),反應(yīng)條件:37 ℃,15 min;85 ℃,5 s結(jié)束反應(yīng),得到cDNA。

熒光定量PCR,按照試劑盒說(shuō)明書方法操作,以cDNA為模板,加入cspc基因的引物,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光實(shí)時(shí)定量PCR(Real time PCR,RT-PCR)方法擴(kuò)增cspc基因。反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃ 30 s;變性95 ℃ 5 s,退火60 ℃ 34 s讀板,共40個(gè)循環(huán);從65 ℃到95 ℃制作融解曲線。以16s rDNA為內(nèi)參基因,以確定cspcmRNA基因的相對(duì)表達(dá)量。產(chǎn)物做電泳檢測(cè)分析,膠回收,產(chǎn)物送測(cè)序Invitrogen公司,NCBI blast比對(duì)分析。

RT-PCR所獲得的數(shù)據(jù),利用2-ΔCt(ΔCt=cspc基因Ct值-16S rRNA Ct值)公式進(jìn)行cspcmRNA基因在LGG中相對(duì)表達(dá)量計(jì)算。

1.2.5 溫度誘導(dǎo)cspcmRNA基因表達(dá)試驗(yàn) 將鼠李糖乳桿菌四級(jí)發(fā)酵液分別置于37、39、41、43、45 ℃的恒溫水浴中分別處理10、15、20、25、30 min,即按照5組(溫度)×5組(時(shí)間)設(shè)計(jì),共25組試驗(yàn),每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù),37 ℃為對(duì)照組。RT-PCR法檢測(cè)cspcmRNA基因的表達(dá)量[14]。

1.2.6 溫度誘導(dǎo)后菌體的生長(zhǎng)速率測(cè)定 在三級(jí)發(fā)酵接種到四級(jí)培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h時(shí),即菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后,按1.2.5確定的最佳誘導(dǎo)溫度和時(shí)間進(jìn)行溫度誘導(dǎo),之后繼續(xù)培養(yǎng)4 h再次進(jìn)行溫度誘導(dǎo),之后再繼續(xù)培養(yǎng)12 h結(jié)束發(fā)酵。RT-PCR法檢測(cè)菌體的cspcmRNA基因表達(dá)量,活菌數(shù)法測(cè)定菌體生長(zhǎng)曲線,并計(jì)算生長(zhǎng)速率,生長(zhǎng)速率=(lg活菌數(shù)t1-lg活菌數(shù)t0)/(t1-t0)(t1、t0表示發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)),以未進(jìn)行溫度誘導(dǎo)作為對(duì)照[14]。

1.2.7 凍干驗(yàn)證試驗(yàn) 為了考察溫度誘導(dǎo)對(duì)鼠李糖乳桿菌凍干存活率的影響,在終止發(fā)酵后對(duì)菌體進(jìn)行冷凍干燥[14]。鼠李糖乳桿菌四級(jí)發(fā)酵誘導(dǎo)組、對(duì)照組,發(fā)酵液經(jīng)10000 r/min離心20 min,棄去上清液,保留菌體,加入凍干保護(hù)劑(凍干保護(hù)劑:25%脫脂奶粉、10%乳糖、10%抗壞血酸)混勻,-40 ℃預(yù)冷30 min,真空干燥36 h得到凍干菌粉。菌粉懸溶于100 mL PBS中混勻,活菌數(shù)法測(cè)定混懸液的活菌數(shù),計(jì)算凍干菌粉總活菌數(shù)(凍干菌粉總活菌數(shù)=混懸液活菌數(shù)濃度×100 mL)。根據(jù)發(fā)酵液總活菌數(shù)(發(fā)酵液總活菌數(shù)=發(fā)酵液活菌數(shù)濃度×發(fā)酵液體積),計(jì)算凍干存活率。凍干存活率(%)=凍干菌粉總活菌數(shù)/發(fā)酵液總活菌數(shù)×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù),試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差表示,應(yīng)用Tukey test檢驗(yàn)進(jìn)行分析,p<0.05表示差異顯著，p<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鼠李糖乳桿菌生長(zhǎng)曲線

鼠李糖乳桿菌生長(zhǎng)曲線如圖1。

圖1 鼠李糖乳桿菌生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Lactobacillus rhamnosus GG

如圖1所示,鼠李糖乳桿菌生長(zhǎng)良好,0～3 h是菌體的適應(yīng)期,3～12 h是菌體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,12～16 h是菌體的穩(wěn)定生長(zhǎng)期,16 h之后菌體進(jìn)入衰退期。

2.2 鼠李糖乳桿菌cspc基因克隆及電泳驗(yàn)證

鼠李糖乳桿菌cspc基因克隆電泳結(jié)果見圖2。

圖2 cspc基因RT-PCR電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis results of cspc RT-PCR product注:M:Marker;S1、S2:cspc基因樣品1、2。

如圖2所示鼠李糖乳桿菌cspc基因克隆片段,大小為140 bp,產(chǎn)物經(jīng)電泳、膠回收、測(cè)序、比對(duì),確認(rèn)為cspc目標(biāo)基因。

2.3 溫度誘導(dǎo)對(duì)cspc mRNA基因表達(dá)的影響

CspC蛋白是CspA蛋白家族中的一個(gè)成員,與CspA蛋白不同的是,CspC蛋白不需要低溫誘導(dǎo)表達(dá),在37 ℃即可表達(dá),研究顯示[15-16],CspC蛋白與染色體凝集和細(xì)胞分裂有關(guān),并且有抗轉(zhuǎn)錄終止的作用。Shenhar等[17]研究表明,CspC蛋白可以促進(jìn)細(xì)菌脅迫應(yīng)答因子(RpoS)的表達(dá),RpoS是微生物在環(huán)境壓力產(chǎn)生的適應(yīng)性因子,因此可以說(shuō)CspC蛋白是微生物對(duì)抗環(huán)境壓力的重要因子。然而,其具體的生物學(xué)功能還不是十分明確。與CspA蛋白不同的是,CspC蛋白的表達(dá)量隨溫度的升高而降低,然而對(duì)于鼠李糖乳桿菌cspcmRNA基因的研究還未見報(bào)道。本研究通過(guò)升高溫度抑制LGGcspcmRNA基因的表達(dá),如圖3所示,在對(duì)照37 ℃時(shí),不同的作用時(shí)間對(duì)其表達(dá)量沒(méi)有影響,而在溫度高于37 ℃時(shí),菌體cspcmRNA基因的表達(dá)量明顯下調(diào),說(shuō)明溫度升高可以抑制菌體產(chǎn)生cspcmRNA基因,且在43 ℃誘導(dǎo)30 min,菌體cspcmRNA基因的表達(dá)量最低,且差異極顯著(p<0.01)。

圖3 溫度誘導(dǎo)后csps mRNA基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative mRNA expression of csps after temperature treatment注：*代表差異性顯著(p<0.05);**代表差異性極顯著(p<0.01)，圖6同。

2.4 溫度誘導(dǎo)后菌體的生長(zhǎng)速率測(cè)定結(jié)果

本研究中,通過(guò)升高溫度抑制菌體cspcmRNA基因的表達(dá),結(jié)果如圖4所示,在接種后生長(zhǎng)第4和8 h,菌體經(jīng)43 ℃、30 min誘導(dǎo),菌體cspcmRNA基因的表達(dá)明顯降低,而隨著溫度降至37 ℃,cspcmRNA基因的表達(dá)又恢復(fù)到原來(lái)水平。如圖5所示,經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)后的鼠李糖乳桿菌生長(zhǎng)明顯加快,且活菌數(shù)明顯升高。如圖6所示,經(jīng)過(guò)兩次誘導(dǎo)后,與對(duì)照組相比,誘導(dǎo)組4～6 h以及8～10 h的生長(zhǎng)速率明顯增高,差異顯著(p<0.05),而6～8 h和10～12 h兩組的生長(zhǎng)速率差異不顯著。

圖4 溫度誘導(dǎo)條件下菌體cspc mRNA基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative mRNA expression of cspc after temperature induction

圖5 溫度誘導(dǎo)條件下菌體的生長(zhǎng)曲線Fig.5 Growth curves of cells after temperature induction

圖6 溫度誘導(dǎo)條件下菌體4～12 h的生長(zhǎng)速率Fig.6 Growth rate in 4～12 h after temperature induction

2.5 鼠李糖乳桿菌凍干驗(yàn)證試驗(yàn)

如圖7所示,誘導(dǎo)組與對(duì)照組相比,其凍干存活率無(wú)明顯差異,說(shuō)明溫度誘導(dǎo)只影響菌體的生長(zhǎng)速率,并不影響菌體的凍干存活率。

圖7 菌體凍干存活率驗(yàn)證結(jié)果Fig.7 Testify result of freeze-drying survival rate of bacteria

3 結(jié)論

本研究對(duì)鼠李糖乳桿菌進(jìn)行不同溫度和時(shí)間的誘導(dǎo)處理,考察cspcmRNA基因的表達(dá)量,并考察在溫度誘導(dǎo)后菌體的生長(zhǎng)速率,結(jié)果顯示,經(jīng)43 ℃、30 min誘導(dǎo),菌體cspcmRNA基因的表達(dá)明顯降低,且誘導(dǎo)后菌體的生長(zhǎng)速率明顯升高,溫度誘導(dǎo)相比基因敲除具有安全的優(yōu)點(diǎn),可應(yīng)用于鼠李糖乳桿菌規(guī)模化發(fā)酵過(guò)程中,以提高菌體的產(chǎn)量。此外,研究顯示,通過(guò)兩次溫度誘導(dǎo),鼠李糖乳桿菌的凍干存活率并未下降,也證明了該方法的可行性。