文奇 ,廖秀海 ,潘虹 ,胡傳琛 ,龔甜 ,李健雄
(1.新余市疾病預(yù)防控制中心,江西 新余 338000;2.江西省疾病預(yù)防控制中心,江西 南昌 330029)
麻疹是麻疹病毒引起的一種傳染性很強(qiáng)的急性呼吸道疾病,在疫苗可預(yù)防的病毒性傳染病中,麻疹的發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)位居前列[1]。消除麻疹是全球共同致力于實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)[2]。中國(guó)大陸作為WHO西太區(qū)成員之一,自2006年開(kāi)始實(shí)施消除麻疹行動(dòng)計(jì)劃和方案,通過(guò)落實(shí)含麻疹成分疫苗(Measles-containing Vaccine,MCV)接種、加強(qiáng)麻疹監(jiān)測(cè)和疫情調(diào)查處置等綜合消除措施,麻疹報(bào)告發(fā)病率自2009年逐年下降,而2012年之后卻有所回升[3-5],麻疹消除工作面臨較大的挑戰(zhàn)。加強(qiáng)MCV適齡兒童的基礎(chǔ)免疫接種、開(kāi)展特定人群的補(bǔ)充免疫活動(dòng)(Supplementary Immunization Activity,SIA)仍是當(dāng)前消除工作的首要任務(wù)。監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn),少部分人在MCV接種后出現(xiàn)發(fā)熱、出疹癥狀,這些病例究竟是疫苗相關(guān)麻疹病例還是偶合感染麻疹野病毒[6-8],需要認(rèn)真對(duì)待并加以區(qū)分。本文引進(jìn)周劍惠、龔甜等人創(chuàng)建的麻疹疫苗株與野毒株鑒別方法[9,10],用以鑒別新余市2014年部分麻疹確診病例,現(xiàn)將有關(guān)分析情況進(jìn)行報(bào)告。
1.1 標(biāo)本來(lái)源 2014年新余市轄區(qū)內(nèi)共采集47例麻疹疑似病例咽拭子標(biāo)本,市疾控中心對(duì)這些標(biāo)本進(jìn)行麻疹、風(fēng)疹病毒核酸檢測(cè)。選擇8例麻疹病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性的病例標(biāo)本作為研究對(duì)象,選擇北京天壇生物公司的麻疹風(fēng)疹聯(lián)合減毒活疫苗(內(nèi)含S191麻疹疫苗株,批號(hào):201501007)作為陽(yáng)性對(duì)照,各選取1例2014年麻疹和風(fēng)疹病毒核酸檢測(cè)均陰性、風(fēng)疹核酸檢測(cè)陽(yáng)性的病例標(biāo)本作為陰性對(duì)照,編號(hào)分別為M1409、M1424。
1.2 麻疹病毒RNA提取 根據(jù)Qiagen公司的RNeasy Mini Kit試劑盒 (Cat.No:74106,Lot No:145022097)說(shuō)明書(shū)提取麻疹病毒RNA。
1.3 RT-PCR擴(kuò)增麻疹病毒H基因 采用Qiagen公司 One Step RT-PCR Kit試劑盒(Cat:210212,Lot No:148047795)進(jìn)行 RT-PCR 反應(yīng)。上游引物:5′-CTCAATCGAGCATCAGGTCA-3′,下游引物:5′-TACATTCCCTGGGACGTCAT-3′。 RT 反應(yīng)條件:60℃ 1min,42℃ 10min,50℃ 30min,95℃ 15min。PCR 循環(huán)如下:94℃ 30s,50℃ 30s,72℃ 60s,30 次循環(huán),72℃ 10min,在 MJ Research PTC-200 儀器上進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為438bp。
1.4 RFLP分析 每份RT-PCR產(chǎn)物均設(shè)立對(duì)照管和RFLP管,對(duì)照管為10μl的DNA產(chǎn)物,RFLP管為酶切產(chǎn)物,酶切反應(yīng)體系是:Takara公司AflII限制 性 酶 (Lot No:1236A)1μl, 緩 沖 液 2μl,DNA 10μl,37℃下酶切 1h。麻疹疫苗株 (A基因型)被AflII酶切成287bp和151bp 2個(gè)片段,而麻疹野病毒(非A基因型)不能被酶切。
1.5 電泳 One Step RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及其RFLP產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠、北京六一產(chǎn)的DYY-6C型電泳儀電泳 1h,BIO-RAD公司 Universal HoodⅡ凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果。
2.1 2014年新余市麻疹、風(fēng)疹陽(yáng)性病例特征 2014年新余市共檢測(cè)47例麻疹疑似病例標(biāo)本,檢出麻疹核酸陽(yáng)性11例、風(fēng)疹核酸陽(yáng)性2例。這些陽(yáng)性病例中,男、女比例為 1.17:1;MCV 接種史情況如下:0次的有3例 (均為<8月齡的嬰兒),1次的有2例 (其中1例為首劑MCV接種第10d出疹的患兒,編號(hào)為M1415),2次的有1例,接種史不明的有7例(其中5例>15歲);<8月的小月齡人群和>15歲的大年齡人群的人數(shù)占總陽(yáng)性病例數(shù)的61.5%(8/13)。
2.2 麻疹病毒H基因的RT-PCR-RFLP結(jié)果分析選取的新余市麻疹陽(yáng)性標(biāo)本 M1415、M1430、M1431、M1432、M1434、M1435、M1436、M1443 在AflII酶切前、后僅可見(jiàn)大小約438bp的RT-PCR產(chǎn)物 (未被酶切消化),2例陰性對(duì)照標(biāo)本M1409、M1424均未出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物,而陽(yáng)性對(duì)照S191麻疹疫苗株的RT-PCR產(chǎn)物可被酶切成大小約為287bp、151bp的兩個(gè)片段(圖 1),表明 2014年新余市被分析的8例麻疹病例(包括MCV首劑接種第10d出疹的患兒)均為麻疹野病毒感染所致。
圖1 新余市2014年部分麻疹病毒H基因RT-PCR產(chǎn)物及其RFLP產(chǎn)物電泳圖譜
目前我國(guó)兒童實(shí)行2劑次的MCV免疫程序,即8月齡接種第1劑(麻疹-風(fēng)疹聯(lián)合疫苗),18月齡~24月齡接種第2劑 (麻疹-流腮-風(fēng)疹聯(lián)合疫苗)[11]。MCV接種后若出現(xiàn)發(fā)熱、出疹癥狀,存在以下三種情形:一是由于疫苗中微量的雞胚細(xì)胞、小牛血清和抗生素等雜質(zhì)引起的過(guò)敏反應(yīng),通常在接種后十幾小時(shí)或幾十小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生一過(guò)性皮疹[12,13],大約有 2%的受種者出現(xiàn)此類(lèi)反應(yīng)[14,15];二是人工感染,疫苗中的減毒活病毒在機(jī)體內(nèi)復(fù)制、產(chǎn)生免疫應(yīng)答而形成的疫苗相關(guān)病例[16],一般發(fā)生在接種后1~2周內(nèi)[17],多見(jiàn)于首次接種MCV的嬰兒[18];三是偶合感染麻疹野病毒或其他發(fā)熱出疹性疾病,在接種疫苗時(shí)已處在發(fā)病的潛伏期[18]。在麻疹消除工作的關(guān)鍵時(shí)期,如何從病原學(xué)方面鑒別MCV受種者感染的麻疹病毒是疫苗株還是野生株,是個(gè)值得深究的課題。
基因序列分析無(wú)疑是最準(zhǔn)確、可靠的方法,但在基層實(shí)驗(yàn)室受條件所限,只能將標(biāo)本外送測(cè)序,不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力,而且代價(jià)昂貴,難以大范圍推廣運(yùn)用。周建惠等人受到Mori的啟發(fā)[19],建立了利用RT-PCR-RFLP方法來(lái)鑒別中國(guó)麻疹病毒疫苗株與野生株的檢測(cè)技術(shù)。她們?cè)谘芯恐袊?guó)麻疹病毒疫苗株與23種野生代表株的基因差異后,發(fā)現(xiàn)疫苗株H基因7666bp~7671bp上存在AflII酶切位點(diǎn)(CTTAAG),其長(zhǎng)度為438bp的目的擴(kuò)增片段可被AflII酶切成287bp、151bp的2個(gè)片段,23種野生株在相應(yīng)位置均無(wú)AflII酶切位點(diǎn)卻不被酶切消化,借此區(qū)分麻疹病毒疫苗株與野生株。相比于序列分析,RT-PCR-RFLP方法簡(jiǎn)便、快速,更具經(jīng)濟(jì)實(shí)用性,非常適合基層實(shí)驗(yàn)室使用。
在江西省疾控中心疾檢所工作人員的協(xié)助下,我們成功引進(jìn)并驗(yàn)證了上述麻疹病毒的RT-PCR-RFLP鑒別技術(shù)。疫苗株S191的擴(kuò)增產(chǎn)物被AflII酶切成大小約為287bp、151bp的2個(gè)片段,2例麻疹陰性標(biāo)本 (含1例風(fēng)疹陽(yáng)性標(biāo)本)未被擴(kuò)增,8例待分析的麻疹陽(yáng)性病例標(biāo)本成功得到擴(kuò)增但不被AflII酶所消化,說(shuō)明8例麻疹陽(yáng)性病例均由麻疹野病毒所引起的,這與我省宜春市的報(bào)道相一致[20];M1415患兒在MCV接種時(shí)已偶合感染麻疹野病毒,不屬于疫苗相關(guān)病例。另外通過(guò)對(duì)新余市2014年麻疹、風(fēng)疹病例信息進(jìn)行分析,我們發(fā)現(xiàn)這些陽(yáng)性病例幾乎不體現(xiàn)出性別差異,年齡分布呈“雙向移位”趨勢(shì),主要是<8月的嬰兒和>15歲的人群,原因是<8月的嬰兒尚未接種疫苗,而>15歲的人群常為無(wú)MCV接種史。