吾魯木汗·那孜爾別克，瑪依拉·吐爾地別克，恩特馬克·布拉提白

(伊犁師范大學(xué)生物與地理科學(xué)學(xué)院，新疆 伊寧 835000)

植物內(nèi)生菌(Plant Endophyte)是指生活在健康植物組織內(nèi)部且不引起植物組織明顯侵染及癥狀的一類菌，包括真菌、細(xì)菌和放線菌[1].內(nèi)生菌與宿主植物長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化.由于基因轉(zhuǎn)移及對(duì)內(nèi)化學(xué)環(huán)境的適應(yīng)性，內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的活性成分，因此藥用植物內(nèi)生細(xì)菌次生代謝產(chǎn)物的研究越來越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[2].研究者們也從藥用植物的內(nèi)生細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了一些新穎的次生代謝產(chǎn)物，如由內(nèi)生的丁香假單孢菌(Pseudomonassyringae)產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)Pseudomycins，由禾本科植物內(nèi)生的綠黃假單孢菌(Pseudomnasviridiflava)產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)新穎的脂肽類化合物Ecomycins，它們對(duì)新生隱球菌和白假絲酵母等人體病原真菌具有很強(qiáng)的抑菌活性，可被開發(fā)成新型抗生素[3-4].

土木香(InulaheleniumL.)是菊科旋覆花屬的多年生草本植物，主要分布于河南、河北、浙江、四川、山西、陜西、甘肅及新疆等地.土木香具有健脾和胃、調(diào)氣解郁、止痛安胎的功能，臨床常用于治療胸脅、脘腹脹痛、嘔吐瀉痢、胸脅挫傷、岔氣作痛、胎動(dòng)不安等[5].土木香中主要的化學(xué)成分是倍半萜內(nèi)酯類，包括土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、土木香醇、土木香酸、二氫土木香內(nèi)酯等，其中土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯具有抑制腫瘤細(xì)胞、驅(qū)蟲、抗菌、抑制平滑肌、降血糖和利膽等作用[6-13].但關(guān)于藥用植物土木香的已有文獻(xiàn)當(dāng)中，未見有其內(nèi)生細(xì)菌的研究報(bào)道，因此，筆者擬對(duì)土木香根、莖和葉部?jī)?nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離并進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)和鑒定，為尋找新的具有禽巴氏桿菌的活性代謝產(chǎn)物提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物與供試菌株 藥用植物土木香于2017年6月下旬從伊犁尼勒克縣唐布拉草原采集，帶回實(shí)驗(yàn)室后經(jīng)表面沖洗、消毒等處理后進(jìn)行內(nèi)生菌的分離.供試細(xì)菌大腸桿菌CGMCC1.1103、枯草芽孢桿菌CGMCC1.769、禽多殺性巴氏桿菌C48-3均由本實(shí)驗(yàn)室保存.

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基 PCR試劑、DNA marker購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、蛋白胨培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基、檸檬酸鹽培養(yǎng)基、糖發(fā)酵培養(yǎng)基和葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基用于土木香內(nèi)生細(xì)菌的分離和生理生化鑒定；TB(tryprtose broth)培養(yǎng)和DSA(dextrose starch agar)培養(yǎng)基均為美國(guó)Bacto公司產(chǎn)品，用于禽巴氏桿菌的培養(yǎng).

1.2 方法

1.2.1 土木香內(nèi)生菌的分離 首先將土木香根、莖和葉片切成0.5 cm的小片，無(wú)菌水沖洗3次；然后用Tween-20處理30 s，8%次氯酸鈉溶液消毒5 min，無(wú)菌水沖洗3次；接著用75%乙醇浸泡5 min，無(wú)菌水沖洗3次；最后用無(wú)菌組織勻漿器研磨組織塊，將組織勻漿液按10倍梯度稀釋至10-1～10-3，分別吸取100 μL涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，每個(gè)梯度重復(fù)3次.同時(shí)，吸取樣本處理時(shí)最后一次無(wú)菌水沖洗液各100 μL涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基做相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng).若培養(yǎng)后無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，則表明表面消毒徹底.37 ℃倒置培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)基中可見菌落形成.根據(jù)菌落形態(tài)差異挑取不同的內(nèi)生細(xì)菌單菌落，接種于5 mL的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，37 ℃震蕩培養(yǎng)24 h；然后將菌液接種于牛肉膏蛋白胨平板，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h；取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，用顯微鏡觀察菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)，經(jīng)反復(fù)轉(zhuǎn)接得到純化菌株.

1.2.2 土木香內(nèi)生細(xì)菌抑菌活性檢測(cè) 拱試菌株的培養(yǎng)：將大腸桿菌和枯草芽孢桿菌分別接種于5 mL的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18 h，然后用新鮮培養(yǎng)液將菌液稀釋為1×105CFU/mL，取100 μL菌液涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上；將禽巴氏桿菌接種于5 mL的TB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18 h，然后用新鮮TB培養(yǎng)基將菌液稀釋為1×105CFU/mL，取100 μL菌液接種于DSA固體培養(yǎng)基上.抑菌活性測(cè)定：采用濾紙片法測(cè)定內(nèi)生細(xì)菌的抑菌活性，將土木香內(nèi)生細(xì)菌接種于50 mL的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，然后將發(fā)酵液9 000 r/min離心15 min，過濾除菌，接著將濾紙片置于供試菌的固體培養(yǎng)基上，點(diǎn)入15 μL發(fā)酵液，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，觀察并測(cè)定抑菌圈的直徑.

1.2.3 土木香內(nèi)生細(xì)菌的鑒定 參照文獻(xiàn)[14]對(duì)具有抑菌活性的土木香內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行生理生化鑒定.用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒制備細(xì)菌的基因組DNA，并用通用引物F8(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和R1492(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR產(chǎn)物由上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序.序列相似性分析利用BLAST軟件在線進(jìn)行.從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得相關(guān)種屬的16S rRNA基因序列，建立系統(tǒng)發(fā)育樹.用ClustalX1.83軟件對(duì)序列進(jìn)行排列，用鄰接法(Neighbor-Joining method)計(jì)算進(jìn)化距離，采用P-distances法和Kimura-2-prarmeter雙參數(shù)法在用MEGA5.0軟件中建立系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)化樹分支的置信度采用Bootstrap法分析，重復(fù)次數(shù)為1 000.

2 結(jié)果與討論

2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離

采用組織分離法從土木香根、莖和葉片中共分離得到菌落和菌體形態(tài)特征不同的細(xì)菌32株，其中根部16株，頸部10株，葉片6株.表這明土木香根、莖和葉片組織中分離得到的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量有一定的差異.

2.2 內(nèi)生細(xì)菌的抑菌活性

采用濾紙片法從32株土木香內(nèi)生細(xì)菌中篩選出10株具有抑菌活性的細(xì)菌.抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示：菌株YIR-4對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為12 mm，菌株YIR-3對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別為13，11 mm，菌株YIR-5對(duì)枯草芽孢桿菌和禽巴氏桿菌的抑菌圈直徑分別為16，9 mm，菌株YIR-6，YIR-7，YIR-8，YIR-9對(duì)大腸桿菌和禽巴氏桿菌的抑菌圈直徑均為15 mm，菌株YIS-2對(duì)枯草芽孢桿菌和禽巴氏桿菌的抑菌圈直徑分別為18，13 mm，菌株YIL-3對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和禽巴氏桿菌的抑菌圈直徑分別為14，12，13 mm，菌株YIS-1對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和禽巴氏桿菌抑菌圈直徑分別為19，17，20 mm(圖1).表明在10株土木香內(nèi)生細(xì)菌中菌株YIS-1對(duì)3種指示菌的抑菌作用最強(qiáng).

3，4—無(wú)菌水對(duì)照組；(A)1，2—大腸桿菌CGMCC1.1103；(B)1，2—枯草芽孢桿菌CGMCC1.769；(C)1，2—禽巴氏桿菌C48-3.圖1 土木香內(nèi)生菌YIS-1發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和禽巴氏桿菌的抑菌作用Fig. 1 Antibacterial Effect of Endophytic Yeast YIS-1 Fermentation Broth on Escherichia Coli, Bacillus Subtilis and Avian Pasteurella Multocida

2.3 內(nèi)生細(xì)菌的生理生化特征

生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：菌株YIR-5，YIR-7，YIR-8，YIR-9均能利用葡萄糖、不能利用乳糖，甲基紅試驗(yàn)陰性，V-P試驗(yàn)陽(yáng)性，能分解檸檬酸鹽，產(chǎn)生淀粉酶、不產(chǎn)生蛋白酶，屬革蘭氏陰性菌；菌株YIR-3，YIR-6均能利用葡萄糖和乳糖，甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)陽(yáng)性，能分解檸檬酸鹽，產(chǎn)生淀粉酶和蛋白酶，屬革蘭氏陰性菌；菌株YIR-4能利用葡萄糖和乳糖，分解檸檬酸鹽，甲基紅試驗(yàn)陰性，V-P試驗(yàn)陽(yáng)性，不產(chǎn)生淀粉酶和蛋白酶，屬革蘭氏陰性菌；菌株YIS-1，YIS-2，YIL-3均能利用葡萄糖和乳糖，V-P試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)陰性，產(chǎn)生淀粉酶、不產(chǎn)生蛋白酶，屬革蘭氏陽(yáng)性菌.根據(jù)細(xì)菌的生理生化特征，初步將菌株YIR-5，YIR-7，YIR-8，YIR-9歸屬為假單胞菌屬(Pseudomonas)，菌株YIR-3，YIR-6歸屬為沙雷菌屬(Serratia)，菌株YIR-4歸屬為拉恩氏菌屬(Rahnella)，菌株YIS-1，YIS-2，YIL-3歸屬為芽孢桿菌屬(Bacillus).

2.4 細(xì)菌16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增

用通用引物F8和R1492R從10株土木香內(nèi)生細(xì)菌基因組DNA中擴(kuò)增出大小約為1.4 kb的DNA片段.結(jié)果如圖2所示，與預(yù)期值相符.

M—標(biāo)準(zhǔn)DNA DL2000；1—PCR陰性對(duì)照；2～10—PCR擴(kuò)增產(chǎn)物.圖2 土木香內(nèi)生細(xì)菌16 rRNA基因的PCR擴(kuò)增Fig. 2 PCR Amplification of 16 rRNA Gene of Endophytic Bacteria from Inula Helenium

2.5 細(xì)菌16S rRNA基因的序列分析

16S rRNA基因的序列分析結(jié)果列于表1.由表1可知,10株具有抑菌活性的土木香內(nèi)生細(xì)菌16S rRNA序列與在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道相關(guān)菌株16S rRNA序列的相似度都在97%以上.

表1 土木香內(nèi)生細(xì)菌16S rRNA序列的相似性

2.6 細(xì)菌16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

結(jié)果如圖3～5所示.

圖3 土木香內(nèi)生細(xì)菌與參考菌株16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹1Fig. 3 Phylogenetic Tree-1 of Endophytic Bacteria from Inula Helenium L. and Reference Strain 16S rRNA Sequence

圖4 土木香內(nèi)生細(xì)菌與參考菌株16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹2Fig. 4 Phylogenetic Tree-2 of Endophytic Bacteria from Inula Helenium L. and Reference Strain 16S rRNA Sequence

圖5 土木香內(nèi)生細(xì)菌與參考菌株16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹3Fig. 5 Phylogenetic Tree-3 of Endophytic Bacteria from Inula Helenium L. and Reference Strain 16S rRNA Sequence

由圖3可知:菌株YIR-5與假單胞菌屬(Pseudomonus)的菌株G11和菌株RMP9系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最密切，但菌株YIGX-5不與這2株參考菌株中任何一個(gè)單獨(dú)相聚，形成了一個(gè)獨(dú)立亞分支，表明該菌株可能是一個(gè)潛在新種；菌株YIR-8和YIR-9與皺紋假單胞菌(Pseudomonascorrugata)155-HR9、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)LBUM770和BZ64H在同一個(gè)大分支，但菌株YIR-7，YIR-8，YIR-9不與4株參考菌株中任何一個(gè)單獨(dú)相聚，形成了一個(gè)單獨(dú)亞分支.因此，結(jié)合細(xì)菌生理生化特征，將菌株YIR-5，YIR-7，YIR-8，YIR-9鑒定為假單胞菌屬菌種，其中菌株YIR-5和YIR-7可能是一個(gè)潛在新種.

由圖4可知:菌株YIR-4與水生拉恩氏菌(Rahnellaaquatilis)KNOUC601聚在一個(gè)分支，菌株YIR-3與沙雷氏菌(Serratiaplymuthica)B131聚在一個(gè)分支，菌株YIR-6與沙雷氏菌(Serratiaplymuthica)BG18聚在一個(gè)大分支.因此，結(jié)合細(xì)菌生理生化特征，將菌株YIR-4鑒定為水生拉恩氏菌，菌株YIR-3和YIR-6鑒定為沙雷氏菌.

由圖5可知:菌株YIS-1與薄壁芽胞桿菌(Bacillushalotolerans)B聚在一個(gè)分支，菌株YIS-2與蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)S43聚在一個(gè)分支，菌株YIL-3與Bacillussubtilisstrain Y4和Bacillusamyloliquefaciensstrain TB6及Bacillussubtilisstrain 2C-62歸屬在同一個(gè)大分支，但菌株YIL-3不與3株參考菌株中任何一個(gè)單獨(dú)相聚，而形成了一個(gè)單獨(dú)亞分支.因此，結(jié)合細(xì)菌生理生化特性，將菌株YIS-1和YIS-2分別鑒定為薄壁芽胞桿菌和蠟樣芽胞桿菌，而菌株YIL-3可能是芽孢桿菌屬的一個(gè)潛在新種.

3 結(jié)論

抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，有10株土木香內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和禽巴氏桿菌有不同程度的抑菌作用，其中：2株內(nèi)生菌對(duì)3種指示菌具有較強(qiáng)的抑菌作用，7株內(nèi)生菌對(duì)2種指示菌具有一定的抑菌作用，1株內(nèi)生菌只對(duì)1種指示菌具有較強(qiáng)的抑菌作用；1株內(nèi)生菌只能抑制革蘭氏陰性菌大腸桿菌的增殖，1株內(nèi)生菌抑制革蘭氏陰性菌大腸桿菌和革蘭氏陽(yáng)性菌枯草芽孢桿菌的增殖，4株內(nèi)生菌能抑制革蘭氏陰性菌大腸桿菌和禽巴氏桿菌的增殖，2株內(nèi)生菌均能抑制革蘭氏陽(yáng)性菌枯草芽孢桿菌和革蘭氏陰性菌禽巴氏桿菌的增殖，2株菌均能抑制革蘭氏陽(yáng)性菌枯草芽孢桿菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌、禽巴氏桿菌的增殖. 10株土木香內(nèi)生細(xì)菌當(dāng)中YIS-1菌株對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和禽巴氏桿菌的抑菌活性最為明顯，具有重要的開發(fā)價(jià)值，可為尋找新的具有禽巴氏桿菌的活性代謝產(chǎn)物提供參考依據(jù).