唐佳月 林 勇

高通量RNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使得大量長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)基因被發(fā)現(xiàn)。既往認(rèn)知中，大多數(shù)lncRNA是沒(méi)有任何功能的隨機(jī)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；然而近年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)表明，lncRNA參與諸多病理生理過(guò)程，是細(xì)胞中重要的功能分子。以下對(duì)肝癌相關(guān)lncRNA的功能和分子機(jī)制進(jìn)行概述，探討lncRNA在肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中Wnt、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3)、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal tramsition，EMT)、NF-κB這4種細(xì)胞信號(hào)通路發(fā)揮的重要調(diào)控作用。了解lncRNA在肝癌發(fā)生中發(fā)揮作用的途徑，以期為肝癌的臨床診斷和治療提供幫助。

1 lncRNA功能概述

非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)以200個(gè)堿基為限分為短鏈非編碼RNA和lncRNA兩大類，兩者的共同特點(diǎn)為均無(wú)蛋白質(zhì)編碼能力[1]。與作為蛋白質(zhì)合成模板的mRNA相似，lncRNA的作用發(fā)揮需經(jīng)過(guò)剪接、5’帽子、聚腺苷酸化、RNA編輯等RNA加工步驟，在腫瘤和胚胎發(fā)育中具備差異調(diào)控的特點(diǎn)。不同細(xì)胞成分的lncRNA通常發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。細(xì)胞核中l(wèi)ncRNA可作為染色質(zhì)修飾復(fù)合體[2]或轉(zhuǎn)錄因子的向?qū)3]來(lái)發(fā)揮作用；細(xì)胞質(zhì)中的lncRNA則多在蛋白質(zhì)水平進(jìn)行調(diào)控，通過(guò)直接調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性[4]或作為競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)成為微RNA(micro RNA, miRNA)的海綿分子，吸附相關(guān)miRNA并調(diào)控其下游信號(hào)通路[5]。

已有研究[1]結(jié)果表明，lncRNA在HCC的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、侵襲過(guò)程中發(fā)揮重要作用。根據(jù)在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的生物學(xué)功能，以及正向或負(fù)向調(diào)控作用，lncRNA可分為致癌lncRNA和抑癌lncRNA，分別通過(guò)調(diào)控Wnt、STAT3、EMT等腫瘤相關(guān)信號(hào)通路發(fā)揮促癌或抑癌作用。

2 不同信號(hào)通路相關(guān)lncRNA

2.1 Wnt信號(hào)通路相關(guān)lncRNA Wnt信號(hào)通路是肝癌發(fā)生和發(fā)展中的關(guān)鍵信號(hào)通路之一。該通路在進(jìn)化上高度保守，在HCC發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中被激活并決定細(xì)胞命運(yùn)[6]。Wnt信號(hào)通路激活的過(guò)程由WNT5A等可溶性Wnt蛋白啟動(dòng)，上述蛋白質(zhì)與Frizzled家族的膜結(jié)合G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor, GPCR)結(jié)合后，導(dǎo)致由軸蛋白(AXIN)、結(jié)腸腺瘤性息肉病基因蛋白(APC)、蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)、糖原合成酶激酶3(glycogenkinase 3，GSK3)和酪蛋白激酶1α(casein kinase 1α，CK1α)組成的破壞復(fù)合體失活，對(duì)β-連環(huán)蛋白(β-catenin)靶向泛素化的作用消失，β-catenin降解減少，在細(xì)胞質(zhì)中沉積增多并轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，隨后作為轉(zhuǎn)錄因子T淋巴細(xì)胞因子(T-cell factor，TCF)/淋巴增強(qiáng)因子(lymphoid enhancer factor，LEF)的反式作用因子激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[7]。β-catenin由CTNNB1基因編碼，而CTNNB1、AXIN1、APC均是HCC中突變頻繁的蛋白質(zhì)編碼基因，CTNNB1基因突變最常發(fā)生于對(duì)β-catenin降解起重要作用的結(jié)構(gòu)域，可導(dǎo)致β-catenin的聚集；AXIN1基因突變可使AXIN1失活，破壞復(fù)合體的活性，從而導(dǎo)致β-catenin活性增高[8-9]。此外，GSK3和CK1α功能受到抑制也可引起細(xì)胞質(zhì)中β-catenin增多。

lncRNA可通過(guò)調(diào)控CTNNB1、APC、GSK3等多個(gè)Wnt通路重要靶點(diǎn)在HCC的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮作用(圖1)?？狗只痩ncRNA(lncRNA-DANCR)、泛素折疊修飾結(jié)合酶1相關(guān)lncRNA(lnc-UFC1)、β-catenin相關(guān)lncRNA(lnc-beta-catm)均在HCC細(xì)胞中高表達(dá)，提示預(yù)后不良[10-13]；它們的共同特點(diǎn)是均作用在β-catenin環(huán)節(jié)。在HCC細(xì)胞中過(guò)表達(dá)lncRNA-DANCR可提高成瘤能力，促進(jìn)其在小鼠肝臟和肺中定植；其促癌的作用主要通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA-214、miRNA-320a、miRNA-199a，阻斷上述miRNA對(duì)CTNNB1基因的沉默作用，導(dǎo)致CTNNB1蛋白質(zhì)水平升高，進(jìn)而激活Wnt信號(hào)通路[10]。lnc-UFC1對(duì)CTNNB1蛋白質(zhì)的調(diào)控作用則通過(guò)募集RNA結(jié)合蛋白(RNA binding protein，RBP)至CTNNB1 mRNA，防止其發(fā)生降解；此外，lnc-UFC1還可促進(jìn)CTNNB1蛋白質(zhì)由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核易位[11]。與前述兩個(gè)lncRNA不同，lnc-beta-catm在HCC中的作用機(jī)制是穩(wěn)定CTNNB1蛋白。lnc-beta-catm與組蛋白-賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶(enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit，EZH2)結(jié)合，將其募集至CTNNB1并甲基化CTNNB1蛋白的賴氨酸殘基，通過(guò)含E3泛素蛋白連接酶的β-轉(zhuǎn)導(dǎo)素重復(fù)序列(beta-transducin repeat containing E3 ubiquitin protein ligase,BTRC)抑制其泛素化，從而激活Wnt通路[12]。

圖1 HCC中l(wèi)ncRNA對(duì)Wnt信號(hào)通路的調(diào)控作用

Wnt信號(hào)途徑激活lncRNA(lnc-TCF7)和結(jié)腸腺瘤性息肉病基因相關(guān)lncRNA(lnc-APC)的作用靶點(diǎn)分別為T(mén)CF7和APC。lnc-TCF7是一種在肝腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell, CSC)中高表達(dá)的lncRNA。其與轉(zhuǎn)錄因子7(transcription factor 7，TCF7)啟動(dòng)子區(qū)域的DNA結(jié)合，招募染色質(zhì)重建復(fù)合體SWI/SNF(Yeast mating-type switching/sucrose non-fermenting)至TCF7啟動(dòng)子中，觸發(fā)TCF7表達(dá)，促進(jìn)Wnt通路下游基因活性[2]。lnc-APC在肝腫瘤起始細(xì)胞(TIC)中高表達(dá)、過(guò)表達(dá)或沉默lnc-APC可促進(jìn)或抑制TIC成瘤能力；其作用機(jī)制為招募EZH2至APC啟動(dòng)子，抑制APC的轉(zhuǎn)錄[10]。

GSK3也是lncRNA在Wnt信號(hào)通路的重要元件，lncRNA-核內(nèi)小RNA宿主基因5(lnc-SNHG5)、lncRNA-間充質(zhì)干細(xì)胞上調(diào)因子(lnc-MUF)均作用于該靶點(diǎn)。lnc-SNHG5在HCC中高表達(dá)，與HCC預(yù)后呈正相關(guān)，可判斷治療效果。上調(diào)SNHG5可抑制肝癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移；下調(diào)SNHG5可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，抑制肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。SNHG5的作用機(jī)制：作為ceRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA-26a-5p調(diào)控GSK 3β的表達(dá)，并激活Wnt信號(hào)通路，誘導(dǎo)EMT[14]。lnc-MUF可促進(jìn)肝癌細(xì)胞成瘤和侵襲能力。其作用機(jī)制：與Wnt通路上游元件膜聯(lián)蛋白A2(ANXA2)相互作用，阻礙GSK 3β/CTNNB1復(fù)合體形成，促進(jìn)CTNNB1蛋白質(zhì)蓄積。此外，lnc-MUF還可作為miRNA-34a的ceRNA，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子SNAIL1活性[15]。

2.2 STAT3信號(hào)通路相關(guān)lncRNA Janus激酶(JAK)-STAT信號(hào)通路與肝癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。該通路由IL-6家族細(xì)胞因子受體、GPCR或toll樣受體(TLR)等誘導(dǎo)。各種原因?qū)е翵AK2激活后，磷酸化STAT3形成功能活性二聚體，轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，可引起促生存基因、炎性反應(yīng)因子相關(guān)基因、EMT和CSC相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄增加[16]。在JAK-STAT通路中，STAT3相關(guān)ncRNA最多，與lncRNA相關(guān)性也最為密切[17]。STAT3可調(diào)控許多直接參與HCC進(jìn)展及其早期階段的基因[18-19]。

作用于STAT3信號(hào)通路的促癌lncRNA包括lncRNA-SRY盒轉(zhuǎn)錄因子4(lnc-Sox4)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β活化的lncRNA(lnc-ATB)、lncRNA-尿路上皮癌相關(guān)基因1(lnc-UCA1)等，抑癌lncRNA則包括肝腫瘤干細(xì)胞中下調(diào)的lncRNA(lncRNA-DILC)等。lnc-Sox4可直接與STAT3結(jié)合，將STAT3招募至SOX4的啟動(dòng)子區(qū)域，從而驅(qū)動(dòng)SOX4及其下游基因表達(dá)[3]。lnc-ATB通過(guò)RNA-雙鏈形成機(jī)制與IL-11 mRNA相結(jié)合，增加IL-11 mRNA的穩(wěn)定性，促進(jìn)IL-11自分泌，激活I(lǐng)L 11/STAT3信號(hào)通路，經(jīng)不依賴于EMT的途徑增強(qiáng)HCC的定植能力[4]。lnc-UCA1可激活NF-κB/STAT3信號(hào)，促進(jìn)肝腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和增強(qiáng)其增殖的能力[20]。而lncRNA-DILC是一種與HCC早期復(fù)發(fā)和生存時(shí)間縮短相關(guān)的抑癌lncRNA，抑制lncRNA-DILC顯著增強(qiáng)肝CSC的擴(kuò)增，促進(jìn)肝癌發(fā)生和發(fā)展；而外源表達(dá)DILC可顯著抑制該過(guò)程。lncRNA-DILC的抑癌作用是通過(guò)干擾NF-κB介導(dǎo)的IL-6表達(dá)，從而抑制IL-6/STAT3自分泌信號(hào)實(shí)現(xiàn)[21]。

2.3 調(diào)控EMT的lncRNA EMT是指在生理或病理情況下，上皮細(xì)胞失去極性，黏附能力降低，而遷移、侵襲能力增強(qiáng)，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程。其特征為Snail家族轉(zhuǎn)錄抑制因子1(SNAI1)、Twist和E盒結(jié)合鋅指蛋白(ZEB)1/2等轉(zhuǎn)錄因子活化，波形蛋白(vimentin, Vim)、N-鈣黏蛋白等間質(zhì)相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)上調(diào)，E-鈣黏蛋白等細(xì)胞間連接蛋白的蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)[22]。HCC細(xì)胞的侵襲性、移行性與EMT密切相關(guān)，是HCC轉(zhuǎn)移和侵襲發(fā)生的重要機(jī)制[23]。

lncRNA調(diào)控EMT信號(hào)通路主要是作為EMT關(guān)鍵元件相關(guān)miRNA的ceRNA或調(diào)控EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子活化實(shí)現(xiàn)。有研究[24]結(jié)果表明，缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF1α)與EMT直接相關(guān)，并通過(guò)腫瘤血管的形成間接參與腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程。通過(guò)作用于HIF1α調(diào)控EMT的lncRNA包括重編程調(diào)控lncRNA(lnc-ROR)、腫瘤低表達(dá)lncRNA(lnc-LET)、CPS1內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄本1(CPS1-IT)等。其中l(wèi)nc-ROR為促癌lncRNA，lnc-LET、CPS1-IT為抑癌lncRNA。lnc-ROR是一種應(yīng)激反應(yīng)性lncRNA，在HCC組織中的表達(dá)上調(diào)，尤其在缺氧條件下HCC來(lái)源的細(xì)胞外囊泡內(nèi)高度富集。下調(diào)lnc-ROR可升高miRNA-145表達(dá)水平，降低HIF1α表達(dá)水平，抑制EMT和腫瘤細(xì)胞活力[25]。lnc-LET在HCC組織中的表達(dá)明顯下調(diào)，與IL增強(qiáng)劑結(jié)合因子3(ILF3)/核因子90(NF90)結(jié)合并導(dǎo)致其降解，負(fù)向調(diào)控HIF1α信號(hào)，抑制HCC轉(zhuǎn)移[26]。CPS1-IT也是HCC組織中表達(dá)下調(diào)的lncRNA。其作用機(jī)制為影響熱休克蛋白90(heat shock protein, HSP90)和HIF1α復(fù)合物的形成，降低HIF1α活性，導(dǎo)致重要的間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Vim、SNAI1、TWIST表達(dá)下調(diào)，抑制EMT[27]。

肝癌高表達(dá)lncRNA(lnc-HULC)、lnc-ATB、lncRNA-?；撬嵘险{(diào)基因1(lnc-TUG1)、位于ZEB1反義鏈的lncRNA(lnc-ZEB1-AS1)在EMT通路中的作用靶點(diǎn)均為ZEB1。lnc-HULC和lnc-ATB可作為ZEB1上游miRNA-200a的ceRNA，lnc-TUG1可作為ZEB1上游miRNA-142-3p的ceRNA發(fā)揮作用；而lnc-ZEB1-AS1則直接影響ZEB1轉(zhuǎn)錄。lnc-HULC是較早在HCC中發(fā)現(xiàn)的一種促癌lncRNA，在HCC中高表達(dá)。lnc-HULC可競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miRNA-200a，激活miRNA-200a靶基因ZEB1，誘導(dǎo)EMT，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移；下調(diào)HCC細(xì)胞和組織中的lnc-HULC，可顯著增高miRNA-200a的表達(dá)水平，降低ZEB1 mRNA表達(dá)水平，抑制EMT進(jìn)程[28]。lnc-ATB在HCC和門(mén)靜脈癌栓(PVTT)中的表達(dá)上調(diào)；下調(diào)lnc-ATB后，可使miRNA-200a表達(dá)水平升高，ZEB1表達(dá)水平降低，抑制HCC發(fā)生轉(zhuǎn)移[12，29]。在HCC組織中，lnc-TUG1水平與miRNA-142-3p水平呈負(fù)相關(guān)，下調(diào)TUG1可顯著降低ZEB1和EMT相關(guān)蛋白的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[30]。lnc-ZEB1-AS1與HCC的轉(zhuǎn)移相關(guān)，在轉(zhuǎn)移性肝癌組織中l(wèi)nc-ZEB1-AS1高表達(dá)。該lncRNA與ZEB1共享一個(gè)雙向啟動(dòng)子，可正向調(diào)控ZEB1表達(dá)，促進(jìn)EMT和HCC轉(zhuǎn)移[31]。超級(jí)增強(qiáng)子相關(guān)lncRNA(lnc-HCCL5)是一種超級(jí)增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞質(zhì)lncRNA，在HCC組織中上調(diào)，可與ZEB1形成正反饋，促進(jìn)SNAI1、Slug和Twist1等間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)，加速HCC細(xì)胞的EMT進(jìn)程[32]。

2.4 NF-κB信號(hào)通路相關(guān)lncRNA NF-κB通路是一個(gè)以基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)為導(dǎo)向的生物學(xué)通路。在正常機(jī)體中，NF-κB與p50/p65形成二聚體并與NF-κB抑制蛋白(inhibitor proteins of NF-κB, IκB)相結(jié)合，以靜息狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)受到IL-6、IL-1、TNF-α等細(xì)胞因子的刺激時(shí)，通過(guò)IκB激酶的誘導(dǎo)，NF-κB二聚體被釋放并進(jìn)入細(xì)胞核，激活腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移等相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。

lncRNA人肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(lnc-MALAT1)在HCC的腫瘤組織中上調(diào)。在脂多糖(LPS)刺激下，MALAT1下調(diào)，抑制HCC細(xì)胞的增殖和侵襲；敲除MALAT1可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的促炎介質(zhì)IL-6和IL-8在HCC細(xì)胞中的表達(dá)，而過(guò)表達(dá)MALAT1可使其恢復(fù)。關(guān)于機(jī)制研究[33]的結(jié)果表明，MALAT1招募Brahma相關(guān)基因1(BRG1)至IL-6和IL-8啟動(dòng)子區(qū)，從而促進(jìn)NF-κB誘導(dǎo)炎性因子的表達(dá)。有研究[34]發(fā)現(xiàn)，MALAT可作為miRNA-195的ceRNA，進(jìn)而調(diào)控其下游磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinases,PI3K)/蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(protein-serine-threonine kinase,AKT)和JAK/STAT通路。上述結(jié)果提示，lncRNA可能通過(guò)多種途徑和功能調(diào)控HCC的發(fā)展進(jìn)程。lncRNA 00607在HCC組織中的表達(dá)水平下調(diào)，其低表達(dá)預(yù)示著HCC患者的預(yù)后較差。lncRNA 00607調(diào)控HCC的機(jī)制為結(jié)合p65啟動(dòng)子區(qū)域，抑制p65轉(zhuǎn)錄，從而升高p53水平。因此，靶向TNF-α/IL-6-lncRNA 00607-NF-κBp65/p53信號(hào)通路可能是HCC化學(xué)治療的新途徑[35]。

3 lncRNA在HCC診斷和治療中的價(jià)值

一項(xiàng)包含16篇研究共4 842例樣本的meta分析評(píng)估了lncRNA在HCC中的診斷價(jià)值。該研究[36]中，lncRNA診斷HCC的合并靈敏度、特異度分別為87.0%和82.9%，AUC為0.915；研究結(jié)果提示，一些異常表達(dá)的lncRNA，尤其是血清和血漿中的多種lncRNA可作為潛在的標(biāo)志物，在HCC中具有較高的診斷準(zhǔn)確性，而不同標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)可進(jìn)一步提高HCC的診斷準(zhǔn)確性。

大量研究結(jié)果表明，lncRNA在預(yù)測(cè)HCC腫瘤復(fù)發(fā)和患者生存期中發(fā)揮重要作用，生存分析顯示lncRNA-DANCR、lnc-UFC1、lnc-SNHG5、lncRNA-DILC的表達(dá)水平與復(fù)發(fā)時(shí)間和總生存期顯著相關(guān)，也是HCC患者復(fù)發(fā)和生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示lncRNA可能具有判斷HCC患者預(yù)后的潛能。

靶向特定lncRNA進(jìn)行針對(duì)性的增強(qiáng)或阻斷是HCC治療一個(gè)具有潛力的新領(lǐng)域，已受到人們的重視，目前有研究提示lncRNA可作為靶向藥物治療HCC，如HCC組織中l(wèi)nc-MALAT1的表達(dá)水平升高，沉默lnc-MALAT1可抑制HCC異種移植物的生長(zhǎng)，并相應(yīng)地抑制促炎因子在HCC組織中的表達(dá)，提示MALAT1靶向治療可能是HCC可探索的一種臨床治療方法[33]。然而，將lncRNA作為靶向藥物治療HCC尚不成熟，僅限于理論研究階段，仍需進(jìn)一步臨床試驗(yàn)證實(shí)lncRNA可作為HCC治療的靶點(diǎn)。耐藥是HCC臨床治療中最棘手的問(wèn)題之一，lncRNA可作為克服耐藥性的潛在靶點(diǎn)而在HCC治療中發(fā)揮作用。lncRNA 00607在HCC中表達(dá)下調(diào)，其過(guò)表達(dá)可降低體內(nèi)和體外HCC細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)細(xì)胞凋亡，提高對(duì)INF-α、5-氟尿嘧啶(5-FU)和阿霉素治療敏感性[35]。上述研究結(jié)果提示，lncRNA聯(lián)合化學(xué)治療可能是治療晚期HCC的有效策略。

4 小結(jié)和展望

lncRNA通過(guò)多種方式調(diào)控Wnt、STAT3和EMT相關(guān)信號(hào)通路，參與HCC的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和侵襲過(guò)程。隨著對(duì)lncRNA認(rèn)識(shí)的加深，更多l(xiāng)ncRNA調(diào)控HCC相關(guān)信號(hào)通路的研究將會(huì)促進(jìn)對(duì)腫瘤發(fā)生機(jī)制研究的深化，同時(shí)可能為腫瘤的防治提供新方法。