步 楠 范彥秋

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是臨床常見的炎癥性腸病。UC的發(fā)病機制目前仍未完全闡明，臨床上也缺乏根治UC的藥物。腸黏膜內(nèi)慢性非特異性炎性反應(yīng)的激活是UC的重要病理特征，細(xì)胞內(nèi)的多種炎性信號通路在UC的發(fā)病過程中呈過度激活狀態(tài)。NF-κB是Toll樣受體(TRL)下游的重要轉(zhuǎn)錄因子，激活后轉(zhuǎn)位進入細(xì)胞核并促進多種炎癥基因的表達和炎性反應(yīng)的激活；NOD樣受體蛋白3(NLRP3)是(NLRP3)炎性小體的重要組成部分，活化后能夠招募細(xì)胞內(nèi)的半胱天冬酶-1(caspase-1)并使無活性的促炎細(xì)胞因子前體向有活性的促炎細(xì)胞因子成熟體轉(zhuǎn)化，進而促進炎性反應(yīng)的激活?，F(xiàn)有的研究[1-3]結(jié)果表明，NF-κB通路和NLRP3炎性小體在UC腸黏膜中呈過度激活的狀態(tài)。因此，抑制NF-κB通路和NLRP3炎性小體也被認(rèn)為是治療UC的潛在靶點。

梔子苷是梔子的主要活性成分，屬于環(huán)烯醚萜苷類化合物，已經(jīng)在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、心肌梗死、腦梗死等動物模型中被證實能夠發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化等生物學(xué)作用[4-6]。本研究將梔子苷用于UC模型大鼠的治療，探討梔子苷治療UC的價值及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級Sprague-Dawley(SD)大鼠共60只，體重200～250 g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，許可證號SCXK(黑)2016-004，由佳木斯醫(yī)學(xué)院實驗動物中心飼養(yǎng)。

1.1.2 實驗試劑 梔子苷、三硝基苯磺酸(TNBS)、NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸銨(PDTC)、NLRP3炎性小體抑制劑VX765購自美國Sigma公司；ELISA試劑盒購自上海西唐公司，紫外線比色法試劑盒購自南京建成公司，超純RNA提取試劑盒、SuperRTcDNA第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture試劑購自北京康為世紀(jì)公司，閉鎖小帶蛋白-1(zonula occludens-1，ZO-1)、閉合蛋白(Occludin)、密封蛋白-1(Claudin-1)、NF-κB p65、NLRP3、caspase-1的單克隆抗體購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 分組、造模和給藥 按照隨機數(shù)字表將SD大鼠分為對照組、模型組、梔子苷組、PDTC組、VX765組，每組12只。模型組、梔子苷組、PDTC組、VX765組采用TNBS灌腸的方式建立UC模型：將無水乙醇與5%的TNBS按1∶1比例混合，把直徑2 mm的聚乙烯管經(jīng)大鼠肛門插入8 cm，按照TNBS 100 mg/kg的劑量將混合液經(jīng)聚乙烯管灌入；對照組給予等劑量0.9%氯化鈉溶液灌腸。灌腸后24 h，開始給藥。參照Xu等[7]研究的方法，梔子苷組予梔子苷(50 mg/kg)灌胃，1次/d；PDTC組給予PDTC (5 mg/kg)腹腔內(nèi)注射，1次/d；VX765組給予VX765 (50 mg/kg)腹腔內(nèi)注射，1次/d。

1.2.2 體重和攝食量的觀察 干預(yù)當(dāng)天至干預(yù)第14天，每天稱量大鼠的體重和食物質(zhì)量，計算攝食量。

1.2.3 腸黏膜組織病理學(xué)評分 處死大鼠后解剖結(jié)腸組織，用4%甲醛溶液固定后常規(guī)石蠟包埋，制作石蠟切片后進行H-E染色，置于高倍光學(xué)顯微鏡下觀察腸黏膜的組織形態(tài)并進行評分(0～5分，0分為無損傷，5分為重度糜爛、嚴(yán)重充血水腫。得分越高，病變越重)。

1.2.4 血清中二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸含量的測定 處死大鼠后留取外周血5 mL，靜置后離心分離血清，應(yīng)用紫外比色法試劑盒測定DAO含量，應(yīng)用ELISA試劑盒測定D-乳酸含量。

1.2.5 細(xì)胞因子含量的測定 處死大鼠后解剖結(jié)腸組織，加入磷酸鹽緩沖液后在液氮上研磨，研磨液以3 000×g離心后棄去沉淀、保留上清液，應(yīng)用ELISA試劑盒測定上清液中TNF-α、IL-1、IL-18含量。

1.2.6 細(xì)胞因子mRNA表達量的測定 處死大鼠后解剖結(jié)腸組織，應(yīng)用超純RNA提取試劑盒提取組織中的RNA，應(yīng)用SuperRTcDNA第一鏈合成試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；取cDNA 1 μL、UltraSYBR Mixture試劑10 μL、0.2 μmol/L的引物混合液0.8 μL、去離子水8.2 μL混合，在熒光定量PCR儀上進行反應(yīng)，得到反應(yīng)曲線和相應(yīng)的循環(huán)閾值(Ct)，參照公式2-△△Ct計算TNF-α、IL-1、IL-18的mRNA表達量。

1.2.7 Western印跡法檢測蛋白質(zhì)的表達量 處死大鼠后解剖結(jié)腸組織，用蛋白裂解液提取總蛋白質(zhì)后測定總蛋白質(zhì)含量，取50 μg總蛋白質(zhì)進行Western印跡法檢測，行SDS-PAGE和轉(zhuǎn)膜，將蛋白質(zhì)樣本轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜后用5%脫脂牛奶封閉NC膜2 h，加入1∶1 000稀釋的ZO-1、Occludin、Claudin-1、NF-κB p65、NLRP3、caspase-1單克隆抗體在4 ℃孵育過夜；第2天取出NC膜，用TBST緩沖液洗滌3次后孵育HRP第二抗體1 h，TBST緩沖液洗滌3次并加入顯影液，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光得到蛋白質(zhì)條帶，應(yīng)用Image-J軟件掃描蛋白質(zhì)條帶灰度值，計算ZO-1、Occludin、Claudin-1、NF-κB p65、NLRP3、caspase-1灰度值與β-actin灰度值的比值作為相應(yīng)分子的蛋白質(zhì)表達量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠的體重和攝食量 造模前各組大鼠的體重和攝食量的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)。造模后至實驗結(jié)束，對照組大鼠體重保持平穩(wěn)，略有增加；攝食量逐日增加。模型組、梔子苷組、PDTC組和VX765組大鼠體重下降，攝食量增加緩慢。第6、8、14天，模型組大鼠的體重、攝食量均明顯低于對照組(P值均<0.05)；第8、14天，梔子苷組、PDTC組、VX765組大鼠的體重和攝食量均明顯高于模型組(P值均<0.05)。見表1。

與對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05

2.2 各組大鼠腸黏膜的H-E染色和組織病理學(xué)評分 對照組、模型組、梔子苷組、PDTC組和VX765組大鼠的組織病理學(xué)評分分別為0.76±0.09、3.94±0.62、1.76±0.26、1.95±0.32、1.88±0.39，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=19.224，P<0.01)，進一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，模型組明顯高于對照組(P<0.05)；梔子苷組、PDTC組、VX765組大鼠的組織病理學(xué)評分均明顯低于模型組(P值均<0.05)。見圖1。

A 對照組 B 模型組 C 梔子苷組 D PDTC組 E VX765組圖1 各組大鼠腸黏膜H-E染色比較 ×100

2.3 各組大鼠腸黏膜內(nèi)炎性細(xì)胞因子的含量及其mRNA表達水平 模型組大鼠腸黏膜內(nèi)TNF-α、IL-1、IL-18的蛋白質(zhì)含量及其mRNA表達水平均明顯高于對照組(P值均<0.05)。梔子苷組、PDTC組大鼠腸黏膜內(nèi)TNF-α、IL-1、IL-18的蛋白質(zhì)含量及其mRNA表達水平均明顯低于模型組(P值均<0.05)；VX765組大鼠腸黏膜內(nèi)TNF-α、IL-1、IL-18的蛋白質(zhì)含量和TNF-α的mRNA表達水平均明顯低于模型組(P值均<0.05)，IL-1、IL-18的mRNA表達水平與模型組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)。見表2。

組別TNF-α蛋白質(zhì)(μg/L)mRNAIL-1蛋白質(zhì)(μg/L)mRNAIL-18蛋白質(zhì)(μg/L)mRNA對照2.55±0.451.00±0.14164.48±22.351.00±0.18121.37±23.411.00±0.17模型8.23±1.27①2.51±0.45①452.32±68.75①2.88±0.62①321.76±52.35①2.24±0.46①梔子苷3.88±0.62②1.67±0.27②249.95±52.23②1.78±0.28②204.56±32.4②1.50±0.24②PDTC4.13±0.59②1.52±0.19②228.74±47.51②1.61±0.22②212.52±27.58②1.46±0.19②VX7653.73±0.51②1.58±0.22②235.37±42.68②2.72±0.39201.36±32.19②2.15±0.38F16.8448.94813.74411.38218.1287.228P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

與對照組比較：①P<0.05。與模型組比較：②P<0.05

2.4 血清中DAO、D-乳酸的含量 模型組大鼠血清中DAO、D-乳酸的含量均明顯高于對照組(P值均<0.05)。梔子苷組、PDTC組、VX765組大鼠血清中DAO、D-乳酸的含量均明顯低于模型組(P值均<0.05)。見表3。

組別DAO(U/L)D-乳酸(mg/L)對照6.71±0.946.12±0.89模型8.94±1.25①27.62±4.42①梔子苷7.12±0.89②10.32±1.85②PDTC6.88±0.97②11.67±1.77②VX7656.96±0.87②10.16±1.46②F10.21017.169P<0.001<0.001

與對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05

2.5 腸黏膜內(nèi)連接蛋白的蛋白質(zhì)表達量 模型組大鼠腸黏膜內(nèi)ZO-1、Occludin、Claudin-1的蛋白質(zhì)表達量均明顯低于對照組(P值均<0.05)。梔子苷組、PDTC組、VX765組大鼠腸黏膜內(nèi)ZO-1、Occludin、Claudin-1的蛋白質(zhì)表達量均明顯高于模型組(P值均<0.05)。見圖2、表4。

2.6 腸黏膜內(nèi)NF-κB通路分子和NLRP3的蛋白質(zhì)表達量 模型組大鼠腸黏膜內(nèi)NF-κB p65、NLRP3、caspase-1的蛋白質(zhì)表達量均明顯高于對照組(P值均<0.05)。梔子苷組大鼠腸黏膜內(nèi)NF-κB p65、NLRP3、caspase-1的蛋白質(zhì)表達量均明顯低于模型組(P值均<0.05)；PDTC組腸黏膜內(nèi)NF-κB p65的蛋白質(zhì)表達量低于模型組(P<0.05)，NLRP3和Caspase-1的蛋白質(zhì)表達量與模型組的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)；VX765組腸黏膜內(nèi)NF-κB p65的蛋白表達量與模型組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05)， NLRP3和Caspase-1的蛋白質(zhì)表達量均明顯低于模型組(P值均>0.05)。見圖3、表5。

1 對照組 2 模型組 3 梔子苷組 4 PDTC組 5 VX765組 A ZO-1表達 B Occludin表達 C Claudin-1表達圖2 腸黏膜內(nèi)ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白質(zhì)表達情況

表4 各組大鼠腸黏膜內(nèi)ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白質(zhì)表達量的比較

與對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05

1 對照組 2 模型組 3 梔子苷組 4 PDTC組 5 VX765組 A NF-κB蛋白質(zhì)表達 B NLRP3蛋白質(zhì)表達 C caspase-1蛋白質(zhì)表達圖3 腸黏膜內(nèi)NF-κB p65、NLRP3、caspase-1蛋白質(zhì)表達情況

組別NF-κB p65NLRP3caspase-1對照1.00±0.241.00±0.251.00±0.28模型2.25±0.42①3.41±0.62①4.22±0.62①梔子苷1.56±0.25②2.58±0.52②2.11±0.32②PDTC1.42±0.25②3.32±0.523.89±0.62VX7652.31±0.452.77±0.46②2.26±0.52②F12.87518.92823.482P<0.001<0.001<0.001

與對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05

3 討 論

UC是與自身免疫應(yīng)答紊亂相關(guān)的非特異性炎癥性腸病，腸黏膜內(nèi)炎性反應(yīng)的持續(xù)激活是疾病主要的病理特征[8-9]。目前，臨床上仍缺乏根治UC的有效藥物，腸黏膜炎性反應(yīng)激活所引起的臨床癥狀會反復(fù)發(fā)生。梔子苷是從梔子中提取得到的環(huán)烯醚萜苷類化合物，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化等生物學(xué)作用。在自身免疫性疾病類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的動物模型中，梔子苷被證實能夠調(diào)節(jié)免疫功能，改善病情[10]。為了明確梔子苷治療UC的價值，本研究首先通過TNBS灌腸的方式建立了UC大鼠模型，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的腸黏膜發(fā)生了明顯損害，損傷程度和病變范圍均達到了3～4分，且模型組大鼠的體重和攝食量均明顯低于對照組，提示TNBS灌腸成功建立了UC大鼠模型。在TNBS造模的基礎(chǔ)上，予大鼠梔子苷灌胃干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，梔子苷組大鼠的組織病理學(xué)評分明顯低于模型組，體重和攝食量均明顯高于模型組；提示梔子苷治療能夠減輕UC模型大鼠的腸黏膜損害，改善UC模型大鼠的體重和攝食情況，在UC的治療中發(fā)揮了積極的作用。

腸黏膜內(nèi)慢性炎性反應(yīng)的持續(xù)激活是UC重要的病理表現(xiàn)，炎性細(xì)胞因子的高表達和大量釋放是炎性反應(yīng)激活的特征。TNF-α、IL-1、IL-18是具有強大促炎活性的細(xì)胞因子，由單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等分泌，能夠在腸黏膜內(nèi)介導(dǎo)炎性反應(yīng)的級聯(lián)放大并引起腸黏膜病理損害[11-12]。本研究結(jié)果顯示：模型組大鼠腸黏膜內(nèi)TNF-α、IL-1、IL-18的蛋白質(zhì)及其mRNA表達量均明顯高于對照組，梔子苷組大鼠腸黏膜內(nèi)TNF-α、IL-1、IL-18的蛋白質(zhì)及其mRNA表達量均明顯低于模型組。提示UC模型大鼠腸黏膜內(nèi)多種炎性細(xì)胞因子大量表達和分泌，梔子苷能有效抑制UC模型大鼠腸黏膜內(nèi)炎性細(xì)胞因子的表達和分泌，具有抑炎活性。慢性炎性反應(yīng)會直接造成腸黏膜屏障損傷，腸黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)的DAO大量釋放進入血液循環(huán)，腸道菌群也發(fā)生易位并產(chǎn)生大量D-乳酸進入血液循環(huán)[13]，參與腸黏膜上皮間緊密連接的蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1等表達受到抑制[14-15]。本研究對上述腸黏膜屏障功能相關(guān)指標(biāo)的分析顯示：模型組大鼠血清中DAO和D-乳酸的含量均明顯高于對照組，腸黏膜內(nèi)ZO-1、Occludin、Claudin-1的表達均明顯低于對照組；而梔子苷組大鼠血清中DAO和D-乳酸的含量明顯低于模型組，腸黏膜內(nèi)ZO-1、Occludin、Claudin-1的表達明顯高于模型組。這一結(jié)果表明UC模型大鼠的腸黏膜屏障受損，梔子苷能夠減輕UC模型大鼠腸黏膜的受損程度。

NF-κB通路和NLRP3炎性小體是細(xì)胞內(nèi)調(diào)控炎性反應(yīng)的重要機制。在生理條件下，NF-κB與相應(yīng)的抑制分子(IκB)結(jié)合并處于無活性狀態(tài)；在外界病理因素的刺激下，細(xì)胞外信號向細(xì)胞內(nèi)傳遞引起NF-κB與IκB解離并發(fā)生活化。活化的NF-κB向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移后能夠結(jié)合TNF-α、IL-1、IL-18基因的啟動子區(qū)域，進而通過基因表達產(chǎn)物來介導(dǎo)炎性反應(yīng)[16-17]。本研究對腸黏膜內(nèi)NF-κB表達的分析顯示：模型組大鼠腸黏膜內(nèi)NF-κB的表達水平明顯高于對照組，梔子苷組大鼠腸黏膜內(nèi)NF-κB的表達水平明顯低于模型組，提示腸黏膜內(nèi)NF-κB的表達在UC發(fā)病過程中明顯增多，梔子苷干預(yù)能夠通過抑制腸黏膜內(nèi)NF-κB的活化，到抑炎作用。為了進一步驗證NF-κB在UC發(fā)病及其在梔子苷治療中的作用，本研究使用NF-κB的抑制劑PDTC干預(yù)UC模型大鼠，觀察到PDTC組大鼠的組織病理學(xué)評分，腸黏膜內(nèi)TNF-α、IL-1、IL-18的蛋白質(zhì)及其mRNA表達量，血清中DAO、D-乳酸的含量均明顯低于模型組，體重，攝食量，腸黏膜內(nèi)ZO-1、Occludin、Claudin-1的蛋白質(zhì)表達水平均明顯高于模型組，而與梔子苷組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這一結(jié)果表明NF-κB抑制劑能夠減輕UC模型大鼠腸黏膜損傷，降低多種炎性細(xì)胞因子的表達和分泌。

NF-κB進入細(xì)胞核后調(diào)節(jié)TNF-α、IL-1、IL-18的表達，TNF-α基因的表達產(chǎn)物能夠直接發(fā)揮促炎作用，而IL-1、IL-18基因的表達產(chǎn)物為無活性前體，需要在NLRP3炎性小體的進一步介導(dǎo)下裂解為有活性的成熟體并發(fā)揮促炎作用。caspase-1亦是NLRP3炎性小體的重要組成部分，NLRP3表達的上調(diào)能夠活化caspase-1，活化的caspase-1將IL-1和IL-18的無活性前體裂解為有促炎活性的成熟體，進而介導(dǎo)炎性反應(yīng)[18-19]。本研究對NLRP3炎性小體表達的分析顯示：模型組大鼠腸黏膜內(nèi)NLRP3、caspase-1的表達水平均明顯高于對照組，梔子苷組大鼠腸黏膜內(nèi)NLRP3、caspase-1的表達水平均明顯低于模型組，提示腸黏膜內(nèi)NLRP3炎性小體的表達在UC發(fā)病過程中明顯增多，梔子苷能夠降低腸黏膜內(nèi)NLRP3炎性小體，發(fā)揮抑炎作用，提示梔子苷能夠通過抑制NLRP3炎性小體的表達來發(fā)揮對UC模型大鼠的治療作用。使用NLRP3炎性小體的抑制劑VX765干預(yù)后，VX765組大鼠的組織病理學(xué)評分，腸黏膜內(nèi)TNF-α的含量及其mRNA表達量，IL-1、IL-18的含量，血清中DAO、D-乳酸的含量均明顯低于模型組，體重，攝食量，腸黏膜內(nèi)ZO-1、Occludin、Claudin-1的蛋白質(zhì)表達量均明顯高于模型組，而IL-1、IL-18的mRNA表達量與模型組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這一結(jié)果表明，NLRP3炎性小體抑制劑夠減輕UC模型大鼠腸黏膜損傷，降低血清IL-1、IL-18水平，但不影響IL-1β、IL-18的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，說明該抑制劑有效抑制了IL-1β和IL-18前體裂解為IL-1β、IL-18的過程。證明了NLRP3炎性小體的生物學(xué)功能為調(diào)控IL-1、IL-18前體的裂解而非調(diào)控IL-1β、IL-18的基因編碼。

綜上所述，UC大鼠腸黏膜內(nèi)NF-κB通路和NLRP3炎性小體的過度激活介導(dǎo)了炎性反應(yīng)的激活，梔子苷能夠通過抑制NF-κB通路和NLRP3炎性小體所介導(dǎo)的炎性反應(yīng)來發(fā)揮治療UC的價值。盡管本實驗已經(jīng)明確了梔子苷用于UC治療的價值及其相關(guān)分子機制，但進一步需要解決的問題是梔子苷與傳統(tǒng)UC治療藥物柳氮磺胺吡啶是否存在協(xié)同作用。為此，本課題組計劃在下一步實驗中設(shè)計梔子苷聯(lián)合柳氮磺胺吡啶的干預(yù)組，分析聯(lián)合給藥與單獨給藥治療UC效果的差異，旨在為臨床推廣梔子苷治療提供更為確切的依據(jù)。