薛慧穎 喻兆陽★,

1．華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院藥學(xué)部 湖北武漢 430030 2．華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 湖北武漢 430030

牛樟芝Antrodia camphorata（同物異名：Taiwanofungus camphoratus; Antrodia cinnamome）是一種臺灣珍貴的藥用真菌，又名牛樟菇、樟菇。牛樟芝腐生于臺灣保育樹種牛樟樹的中空腐朽心材內(nèi)壁或倒伏樹干的表面上，具有強烈的樟樹香氣，屬于擔(dān)子菌門菌蔁綱無褶菌目多孔菌科薄孔菌屬的多年生蕈菌類[1]，具有保肝、抗氧化、抗發(fā)炎、抗酒精性肝炎、抗過敏、保護神經(jīng)及抗癌的活性[2]。

肝癌是最常見的惡性腫瘤，我國肝癌發(fā)病率致死率均高居第三[3]，實為國人健康的一大危害。肝癌的主要治療方法包括放射線療法、外科手術(shù)切除、肝臟移植等，但治療效果大多十分有限。再者，肝癌具有較強的浸潤及遷移能力，易導(dǎo)致預(yù)后不良，從而致使患者死亡。因此尋找高效低毒的活性化合物以對抗癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移已迫在眉睫。

近年來，納米技術(shù)廣泛應(yīng)用于用于中草藥的開發(fā)，研究指出中草藥納米化及藥物納米具有增加生物利用率及溶解度并且能減少藥物毒性、強化藥理活性等效果。多糖體及三萜類為牛樟芝的重要生理活性成分，其中主要成分多糖體及三萜類存在于牛樟芝的細(xì)胞壁中。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的乙醇萃取無法有效釋出牛樟芝三萜類與多糖體成分，影響其腫瘤治療效果。納米化牛樟芝子實體(以下簡稱納米牛樟芝，NACF)較牛樟芝乙醇提取物(以下簡稱牛樟芝醇提物，ACED)具有更好抗腫瘤活性，兩者對HepG2細(xì)胞IC50值分別為 225 μg·mL-1和348 μg·mL-1。但兩者抗腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的活性與機制還尚不明確。

因此，本研究以人類肝癌HepG2細(xì)胞為研究對象，觀察比較牛樟芝醇提物及NACF對HepG2細(xì)胞遷移、侵襲的影響差異，并探討其可能機制，為牛樟芝納米化研發(fā)提供進一步提供理論依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料與細(xì)胞

實驗所用新鮮牛樟芝由臺灣蘭芝生物科技有限公司提供，冷凍干燥至水分含量＜3%，應(yīng)用研磨機進行研磨，得到牛樟芝子實體納米粉末。經(jīng)本實驗室動態(tài)散射光分析得NACF平均粒徑為22.8±2.0 nm。并將其重懸于PBS中配置成溶液，4℃保存待用。

按文獻[4，5]所述，取適量牛樟芝以10倍質(zhì)量的乙醇提取2次后，合并濃縮產(chǎn)物，以二氯甲烷/水(1∶1)分配萃取3次，所得的二氯甲烷層即牛樟芝醇提物，再用二甲基亞砜溶解，配制成相當(dāng)于原藥材質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1溶液保存待用。

本實驗所使用的肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞株由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院藥理實驗室饋贈。

1.2 儀器

370型CO2培養(yǎng)箱（美國Termo Scientific公司），Western blot及轉(zhuǎn)膜設(shè)備（美國Bio-Rad公司）；多功能顯影機（Synoptics）；Synergy2多功能酶標(biāo)儀（Bio-Tek）；UVP凝膠成像系統(tǒng)（Upland公司），；Axio observer A1熒光倒置顯微鏡（德國Zeiss公司）

1.3 試劑

DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國HyClone公司）；Martrigel膠（美國BD公司），BCA定量試劑盒（美國Thermo Fisher公司）；E-cadherin、VEGF、β-actin抗體（美國Upstate公司）；HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（美國GE Healthcare公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 腫瘤細(xì)胞劃痕實驗劃痕實驗檢測細(xì)胞的遷移能力

收集生長至對數(shù)期的HepG2細(xì)胞接種于24孔板中，每孔密度約為5×105個細(xì)胞，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育過夜至細(xì)胞鋪滿皿底，用200μL移液管尖劃過孔底造成垂直劃痕。隨后，用PBS盡量洗去劃痕處細(xì)胞，分別加入含原藥材濃度為200 μg·mL-1 牛樟芝醇提物與NACF的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，分別在0、6h、24h于顯微鏡下拍照觀察，試驗重復(fù)3次。對每組中的劃痕距離進行測量，q取平均值計算各組細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=（初始劃痕平均距離-測量時劃痕平均距離）/ 初始劃痕平均距離×100%

1.4.2 Transwell 實驗檢測細(xì)胞的侵襲能力

用無血清DMEM培養(yǎng)液將Matrigel膠以1∶6的比例稀釋，取100μL的稀釋液包被Transwell（直徑6.5 mm，孔徑8μm，美國康寧公司）上室。將100μL 5×104的HepG2細(xì)胞接種于含有200 μg·mL-1 牛樟芝醇提物、NACF的上層無血清培養(yǎng)基上層小室中。下室加入600μL含10%血清和相同濃度藥物的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后，用棉簽去除上房中的非侵襲細(xì)胞，transwell下室侵襲中細(xì)胞用4% 多聚甲醛固定15min，然后用1%結(jié)晶紫溶液染色20 min。接著，使用蒸餾水洗去多余染料，自然風(fēng)干后顯微鏡下各組隨機選取3視野觀察拍照并計數(shù)取平均值，實驗重復(fù)3次。

1.4.3 Western blot檢測蛋白的表達

將細(xì)胞以濃度5×105 cells /1 mL培養(yǎng)于6孔板中，待細(xì)胞細(xì)胞至80%～90%鋪滿狀態(tài)后，更換為終濃度為200 μg·mL-1的牛樟芝醇提物溶液及NACF溶液37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后收取細(xì)胞。向細(xì)胞加入適量細(xì)胞裂解液，放置冰上30min。4℃、18000×g離心10 min，收集到的上清液即為細(xì)胞蛋白質(zhì)溶液，保存于-80℃冰箱待用。以BCA法測定蛋白濃度，將得到的細(xì)胞蛋白質(zhì)溶液以100V，90 min條件下用10%丙烯酰胺凝膠電泳分離，之后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST溶液封閉1 h。再用TBST洗滌3次，每次10 min。加入相應(yīng)一抗并于4℃冰箱孵育過夜，然后將膜在含有0.1%吐溫20 PBST中洗滌3次，再加入二抗結(jié)合1 h，最后將膜清洗3次后使用ECL進行曝光顯影，以β-actin作為內(nèi)參。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)用均標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析采用Graphpad Prism 5.0軟件進行，本研究中的各項實驗均獨立重復(fù) 3 次。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間數(shù)據(jù)用雙側(cè)t檢驗，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 牛樟芝醇提物與納米牛樟芝對 HepG2 細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實驗結(jié)果顯示，空白對照組、牛樟芝醇提物組、納米牛樟芝組6 h后細(xì)胞遷移率分別為(39.9±8.0)%、(3.6±1.4)%、(5.1±1.8)%，24 h后細(xì)胞遷移率分別為(47.8±7.0)、(17.0±5.4)、(23.9±8.0)%。與對照組相比，牛樟芝醇提物與納米牛樟芝能顯著降低HepG2細(xì)胞遷移率(P ＜0.001)，且隨時間延長，細(xì)胞遷移率增加。結(jié)果表明，牛樟芝醇提物及納米牛樟芝可明顯抑制肝癌HepG2細(xì)胞的遷移能力。（圖1）

圖 1 牛樟芝醇提物與納米牛樟芝對HepG2細(xì)胞遷移的影響

2.2 牛樟芝醇提物與納米牛樟芝對HepG2細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell 侵襲實驗結(jié)果顯示(圖2B)，牛樟芝醇提物、納米牛樟芝處理后，越過Matrigel 膠侵襲至下室的HepG2細(xì)胞數(shù)明顯減少，與空白對照組[(76.8±5.8)%]相比， 牛樟芝醇提物 [(34.8±4.3)%]顯著降低HepG2細(xì)胞侵襲率，而納米牛樟芝[(34.8±4.3)%]可使HepG2細(xì)胞侵襲能力進一步降低。表明牛樟芝能夠降低肝癌細(xì)胞的侵襲能力，牛樟芝納米化后抑制效果進一步顯著增強。（圖 3）

圖 2 牛樟芝醇提物與納米牛樟芝對HepG2細(xì)胞侵襲的影響

2.3 牛樟芝醇提物與納米牛樟芝對HepG2細(xì)胞中遷移侵襲相關(guān)蛋白表達的影響侵襲能力的影響

Western blot實驗結(jié)果表明，在HepG2細(xì)胞中，牛樟芝醇提物、納米牛樟芝較空白對照組相比促進了E-cadherin的表達，且納米牛樟芝組表達高于牛樟芝醇提物組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而血管內(nèi)皮生長因子VEGF的表達，三組無明顯差異，這表明牛樟芝可通過活化E-cadherin 表達從而抑制HepG2細(xì)胞增殖和侵襲，且其不依賴于VEGF信號通路。

圖 3 牛樟芝醇提物與納米牛樟芝對細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白表達的影響

3 討論

肝癌是一種惡性程度極高消化系統(tǒng)腫瘤，嚴(yán)重威脅我國人民的生命健康。肝癌的治療效果目前極其有限，其預(yù)后不良往往是由于肝臟腫瘤的侵襲、肝內(nèi)擴散及肝外轉(zhuǎn)移所造成。

而中草藥具有豐富活性成分，可通過多種靶點作用于腫瘤細(xì)胞，具有較好的抗腫瘤活性。牛樟芝為我國臺灣特有真菌，含有多種的生理活性成分，作為一種地道藥材，其治療肝臟疾病已有兩百多年的歷史。牛樟芝對人肝癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等細(xì)胞均有顯著抗腫瘤活性[6-11]。

但這些機制多以牛樟芝萃取物或其部分純化三萜類或多糖體為藥物進行的，尚缺乏納米化牛樟芝相關(guān)研究，因此本課題組致力于納米化牛樟芝抗腫瘤相關(guān)研究。課題組前期研究表明牛樟芝醇提物、納米牛樟芝具有很好抑制肝癌細(xì)胞增殖與誘導(dǎo)其凋亡的活性。在臨床上，肝臟腫瘤的侵襲、肝內(nèi)擴散及肝外轉(zhuǎn)移造成患者術(shù)后復(fù)發(fā)甚至死亡。

于是我們進一步研究牛樟芝對抗腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用，之前研究MTT實驗發(fā)現(xiàn)牛樟芝醇提物、納米牛樟芝對HepG2細(xì)胞IC50值分別為225 μg·mL-1和348 μg·mL-1，故本實驗選擇200 μg·mL-1為給藥濃度，使用細(xì)胞劃痕及 Transwell 小室侵襲試驗檢測牛樟芝醇提物與納米牛樟芝對肝癌HepG2轉(zhuǎn)移能力的影響。

細(xì)胞劃痕試驗結(jié)果表明，牛樟芝醇提物及納米牛樟芝處理HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞遷移率顯著降低， 可明顯抑制肝癌HepG2細(xì)胞的遷移能力。劃痕后6 h，牛樟芝醇提物組與納米牛樟芝組細(xì)胞遷移率無明顯差異，當(dāng)時間延長至24h后，觀察到納米牛樟芝組較牛樟芝醇提物組相比，前者細(xì)胞遷移率高于后者，提示隨時間延長納米牛樟芝較牛樟芝醇提物相比有更好的抗腫瘤遷移活性。

Transwell侵襲實驗中，將細(xì)胞置于不含血清培養(yǎng)液中處理以避免細(xì)胞增殖對侵襲實驗結(jié)果的影響。使用與細(xì)胞基質(zhì)類似的Martrigel基質(zhì)膠在鋪于Transwell小室底部以模仿腫瘤體內(nèi)微環(huán)境。本文研究發(fā)現(xiàn)牛樟芝醇提物組及納米牛樟芝組穿過 Martrigel 基質(zhì)膠細(xì)胞數(shù)均顯著減少。并且納米牛樟芝組細(xì)胞數(shù)少于牛樟芝醇提物組，這也提示納米牛樟芝抗腫瘤侵襲活性優(yōu)于牛樟芝醇提物。

進一步使用蛋白免疫印跡法對兩者抑制肝癌細(xì)胞的機制進行研究。研究發(fā)現(xiàn)， 牛樟芝醇提物、納米牛樟芝可上調(diào)E-cadherin的表達，但對VEGF的表達無明顯調(diào)節(jié)作用。

由此我們認(rèn)為在HepG2細(xì)胞中，牛樟芝醇提物及納米牛樟芝可能主要通過上調(diào)E-cadherin的表達水平來發(fā)揮抑制細(xì)胞遷移及侵襲作用，但具體的調(diào)控機制仍不清楚，有待進一步研究。今后我們也將探究通過動物實驗繼續(xù)研究牛樟芝醇提物及納米牛樟芝對體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移能力的影響。

綜上所述，本研究證明牛樟芝產(chǎn)物納米牛樟芝及牛樟芝醇提物均可抑制肝癌細(xì)胞侵襲和遷移，且納米牛樟芝較牛樟芝醇提物相比能顯著增加對E-cadherin的表達，具有更好抗肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性。相對于傳統(tǒng)萃取方式，我們認(rèn)為本實驗牛樟芝樣品納米牛樟芝較牛樟芝醇提物而言完整保留了牛樟芝全部生理活性成分，且納米化后可提高樣品的溶解度、表面積以及生物可用率，促進腫瘤細(xì)胞吸收從而增加了其對癌細(xì)胞抗腫瘤活性。牛樟芝可作為肝癌治療良好的潛在藥物，本文為中藥納米化研發(fā)提供新的依據(jù)。