趙圣明，趙巖巖，馬漢軍，潘潤(rùn)淑

（1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南省畜禽產(chǎn)品精深加工與質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，河南 新鄉(xiāng) 453003）

益生菌被定義為“寄生于宿主體內(nèi)活的微生物，當(dāng)其生長(zhǎng)達(dá)到一定數(shù)量后能夠?qū)λ拗鞯慕】涤幸妗钡囊活?lèi)微生物。益生菌可通過(guò)改善免疫應(yīng)答，促進(jìn)有害物質(zhì)的代謝以及產(chǎn)生抗菌物質(zhì)和益生物質(zhì)（如維生素、多糖等）等來(lái)發(fā)揮其益生作用[1]。目前研究較多的益生菌基本為乳桿菌屬和雙歧桿菌屬，尤其是乳桿菌屬作為人體腸道及口腔內(nèi)部最常見(jiàn)的共生菌群，因是人體小腸內(nèi)的最主要菌群，能夠顯著地抑制腸道內(nèi)有害菌的生長(zhǎng)，已被確定為是非常具有應(yīng)用價(jià)值的益生菌[2-3]。使用乳酸菌發(fā)酵食物和飲料已經(jīng)有數(shù)千年的歷史，表明其是安全的食品級(jí)微生物[4-5]。乳酸菌可以通過(guò)產(chǎn)生一些抗菌物質(zhì)（如乳酸和細(xì)菌素等）抑制致病菌的生長(zhǎng)，這是篩選益生菌的一個(gè)主要因素。然而，篩選具有應(yīng)用前景的益生菌還需要考慮一些其他因素[1]。例如菌株對(duì)胃腸道低酸和膽鹽等不良環(huán)境的耐受性能力也是其在人體內(nèi)發(fā)揮益生作用的前提條件，如果益生菌不能夠順利地進(jìn)入到小腸內(nèi)進(jìn)行定殖，就無(wú)法發(fā)揮其益生作用。而研究益生菌的體內(nèi)活性成本高且費(fèi)時(shí)，因此一般采取體外實(shí)驗(yàn)對(duì)其益生活性進(jìn)行研究。此外，每一個(gè)菌株都必須進(jìn)行相關(guān)特性的體外評(píng)價(jià)，因?yàn)椴煌囊嫔曛g存在著高度的特異性[6]。

發(fā)酵食品是獲得益生菌的一個(gè)良好來(lái)源，尤其是中國(guó)一些傳統(tǒng)的發(fā)酵食品如藏靈菇[7]、酸菜[8]等均可以分離獲得具有應(yīng)用潛力的益生菌。盧海強(qiáng)等[8]從東北酸菜中篩選得到具有益生特性的屎腸球菌HS38，具有較好的亞硝酸鹽降解能力和抗氧化能力等。Yu Zhihui等[9]從發(fā)酵酸菜中篩選到的植物乳桿菌S2-5和S4-1具有較好的體外益生活性，且能有效降低小鼠體內(nèi)膽固醇含量。陳明等[10]從青藏高原牦牛酸奶中篩選得到對(duì)大鼠體內(nèi)具有較好益生特性的植物乳桿菌XM5，可使衰老性大鼠肝臟中的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和血清中的總超氧化物歧化酶的活力顯著提高。本研究前期從東北農(nóng)家酸菜中分離獲得49 株對(duì)食品中常見(jiàn)的腐敗性及致病性芽孢桿菌（枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和嗜熱脂肪地芽孢桿菌等）具有較好抑菌作用的乳酸菌菌株，現(xiàn)對(duì)分離得到的乳酸菌菌株的益生活性進(jìn)行研究，分析其體外的耐酸能力、耐膽鹽能力、疏水能力、黏附能力等，旨在從中篩選得到具有潛在益生特性的菌株，為其在發(fā)酵食品中的應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種由河南科技學(xué)院食品學(xué)院食品微生物實(shí)驗(yàn)室保藏。

商業(yè)酸奶發(fā)酵劑 北京川秀國(guó)際貿(mào)易有限公司；牛膽鹽、胰酶 北京索萊寶科技有限公司；改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco's modification of Eagle's medium，DMEM） 美國(guó)Gibco公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒 美國(guó)Omega公司；DNA凝膠回收試劑盒、柱式質(zhì)粒提取試劑盒 大連TaKaRa生物公司；pMD19-T連接試劑盒、Taq Mix 南京諾唯贊生物公司；DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量Marker 南京金斯瑞公司；乳酸菌培養(yǎng)基（MRS培養(yǎng)基）、哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Sartious電子精密天平 北京賽多利斯天平有限公司；SW-CJ-IBU超凈工作臺(tái) 蘇州蘇凈集團(tuán)；5418高速離心機(jī) 芬蘭Eppendorf公司；Orion 3 STAR pH計(jì)美國(guó)Thermo公司；GXZ-9240 MBE鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；Eclipse 80i光學(xué)顯微鏡 日本Nikon公司；HYL-A多功能搖床 太倉(cāng)強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；PTC100TM聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)基因擴(kuò)增（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)MJ Research公司；PowPacTMHC164-5052高電流電泳儀 美國(guó)Bio-Rad生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品公司；JS-380C全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析儀 上海培清科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株酸耐受性測(cè)定

以前期獲得的對(duì)食品中常見(jiàn)腐敗性及致病性芽孢桿菌具有較好抑菌活性的49 株菌進(jìn)行酸耐受性實(shí)驗(yàn)。將供試菌以1%的接種量接種于液體MRS培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)16 h，菌濃度約為5.4×108CFU/mL。然后4 ℃、5 000×g離心10 min后收集菌體，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌兩次后重懸于PBS中。再用2 mol/L的HCl溶液將乳酸菌菌懸液pH值分別調(diào)至2.5。分別在0、1、2、3 h取樣吸取1 mL的菌懸液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)x取合適的稀釋度進(jìn)行平板涂布菌落計(jì)數(shù)。

1.3.2 菌株膽鹽耐受性測(cè)定

將供試菌株以1%的接種量接種于液體MRS培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)16 h，菌濃度約為6.3×108CFU/mL。然后4 ℃、5 000×g離心10 min后收集菌體，用PBS洗滌2 次后重懸于PBS中。將乳酸菌菌懸液分別置于含0.3%、0.5%和1%牛膽鹽的液體MRS培養(yǎng)基中。分別孵育3 h后取樣，吸取1 mL的菌懸液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)x取合適的稀釋度進(jìn)行平板涂布菌落計(jì)數(shù)。

1.3.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定

將目標(biāo)菌株以1%的接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，經(jīng)37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)12 h后，取5 mL菌液經(jīng)9 000×g離心2 min后棄上清液得菌體，采用TE緩沖液離心洗滌2 次，最后采用OMEGA公司的細(xì)菌基因組提取試劑盒提取基因組。采用原核生物16S rRNA擴(kuò)增的通用引物[11]（由生工生物工程（上海）股份有限公司合成），正向引物fD1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物rP1：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴(kuò)增得到的目的片段經(jīng)連接到T載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，然后挑取轉(zhuǎn)化子送去南京金斯瑞生物公司測(cè)序，將所得到的16S rRNA基因序列，在www.ncbi.nlm.nlh.gov網(wǎng)站中使用BLASTN2.211[MAY-05-2005]在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB基因庫(kù)中進(jìn)行同源性搜索比對(duì)。

1.3.4 菌株黏附能力測(cè)定

將供試菌株以1%的接種量經(jīng)MRS液體培養(yǎng)基37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，經(jīng)傳代活化后培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，然后4 ℃、5 000×g離心10 min后收集菌體，用PBS洗滌兩次后重懸于DMEM培養(yǎng)液中，將菌體的使用濃度調(diào)整到約為6.2×108CFU/mL。將Caco-2細(xì)胞采用含有10%熱滅活胎牛血清、青霉素100 μg/mL和鏈霉素100 μg/mL的DMEM培養(yǎng)液置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天更換一次培養(yǎng)液。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)為單層后，用0.25%的胰蛋白酶消化后重懸于DMEM培養(yǎng)液中，將細(xì)胞濃度調(diào)整約為4.5×105個(gè)/mL。將制備好的細(xì)胞懸液置于24 孔的細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)長(zhǎng)成單層細(xì)胞。然后將100 μL 5×108CFU/mL的乳酸菌菌懸液和900 μL的DMEN培養(yǎng)液加進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)90 min后，采用PBS清洗細(xì)胞數(shù)次，除去未黏附于細(xì)胞表面的菌體。然后加入1 mL Triton 100（體積分?jǐn)?shù)1%）使黏附的菌體與細(xì)胞分離，將培養(yǎng)液經(jīng)適當(dāng)稀釋后涂布于MRS平板上進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。每組實(shí)驗(yàn)做3 個(gè)平行，通過(guò)式（1）計(jì)算乳酸菌對(duì)細(xì)胞的黏附率：

1.3.5 菌株疏水性測(cè)定

將供試菌株培養(yǎng)到穩(wěn)定期后經(jīng)5 000×g離心10 min后收集菌體，用PBS洗滌兩次后重懸于0.1mol/L的KNO3（pH 6.2）溶液中，將菌體的使用濃度調(diào)整到5.6×108CFU/mL，在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定菌懸液的吸光度（A0）。然后分別取1 mL的二甲苯、乙酸乙酯和氯仿與3 mL的菌懸液混合后室溫放置10 min混勻，再靜止放置20 min后于600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A1）。通過(guò)式（2）計(jì)算乳酸菌黏附有機(jī)溶劑的百分比，以計(jì)算結(jié)果表示乳酸菌的疏水性：

1.3.6 菌株自凝聚測(cè)定

將供試菌株菌懸液的濃度調(diào)整為在600 nm波長(zhǎng)處OD值約為1.0，分別取4 mL置于10 mL的試管中，在室溫條件下靜止放置待其分層，分別靜置1、3、5 h后吸取1 mL上層懸液測(cè)OD600nm值，分別記作OD1、OD3、OD5，每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3 個(gè)平行。細(xì)菌自凝聚率按式（3）計(jì)算：

式中：OD0和ODt分別代表自凝聚前、后上層懸液在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)量所得的OD值。

1.3.7 菌株溶血活性測(cè)定

將供試菌株以1%的接種量經(jīng)MRS液體培養(yǎng)基37 ℃靜置培養(yǎng)12 h后，穿刺接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)16 h后觀察是否有溶血圈出現(xiàn)，判斷供試菌株是否具有溶血活性。

1.3.8 菌株在發(fā)酵乳中產(chǎn)酸能力測(cè)定

將待測(cè)菌株以3%的添加量接種于脫脂乳中，經(jīng)42 ℃培養(yǎng)6 h后測(cè)定發(fā)酵乳的pH值。

1.3.9 發(fā)酵乳中乳酸菌活菌數(shù)的測(cè)定

將商業(yè)發(fā)酵劑和待測(cè)菌株分別以0.1%和5%的添加量對(duì)滅菌牛奶進(jìn)行發(fā)酵，待其發(fā)酵pH值降低到4.5時(shí)停止發(fā)酵，放入4 ℃冰箱冷藏。分別在發(fā)酵乳發(fā)酵后的第0、1、3、5、7天時(shí)，采用平板計(jì)數(shù)法對(duì)發(fā)酵乳中的乳酸菌活菌數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.10 發(fā)酵乳pH值和滴定酸度的測(cè)定

采用數(shù)顯pH計(jì)測(cè)定發(fā)酵乳的pH值。滴定酸度的測(cè)定：取發(fā)酵乳樣品10 g，加入20 mL蒸餾水混合均勻后，放入0.5 mL 0.5%酚酞作為指示劑，采用0.1 mol/L的NaOH溶液進(jìn)行滴定。消耗0.1 mL 0.1 mol/L NaOH溶液相當(dāng)于1 °T。

1.3.11 發(fā)酵乳持水性的測(cè)定

持水性測(cè)定：30 mL發(fā)酵乳置于50 mL離心管中，4 ℃、4 500×g條件下離心18 min，每個(gè)樣品平行做3 次。以式（4）用于計(jì)算發(fā)酵液的持水性：

式中：M1為離心之后乳清的質(zhì)量/g；M2為所有發(fā)酵乳的質(zhì)量/g。

1.3.12 發(fā)酵乳黏度的測(cè)定

將發(fā)酵乳置于室溫（25 ℃）一段時(shí)間后，采用數(shù)顯黏度測(cè)定儀測(cè)定發(fā)酵乳的黏度，參數(shù)設(shè)定為25 ℃，0#轉(zhuǎn)子進(jìn)行測(cè)定，其中轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速15 r/min、扭矩10%～100%、測(cè)定時(shí)間30 s，每個(gè)樣品平行做3 次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以 ±s表示，顯著性分析采用Duncan檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試乳酸菌菌株酸耐受性篩選結(jié)果

益生乳酸菌進(jìn)入體內(nèi)能否通過(guò)胃酸的消化作用進(jìn)入腸道是其發(fā)揮益生作用的重要影響因素。在pH 3.0環(huán)境中消化1.5～3 h后菌株的存活被認(rèn)為是衡量菌株耐酸性的標(biāo)準(zhǔn)之一[12-13]。胃的排空時(shí)間一般也在3 h以內(nèi)，因此本實(shí)驗(yàn)為能更好模擬真實(shí)的胃酸情況，選取略低的pH 2.5對(duì)菌株進(jìn)行耐酸性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。測(cè)試的49 株乳酸菌均可以在pH 2.5的條件下存活。但是不同菌株經(jīng)過(guò)不同時(shí)間處理后的活菌數(shù)差別較大。在pH 2.5條件下處理1 h后38 株菌的活菌數(shù)基本保持不變，活菌數(shù)仍可以維持在約7～8（lg（CFU/mL）），11 株菌的活菌數(shù)發(fā)生下降，活菌數(shù)約為6～7（lg（CFU/mL））。在pH 2.5的條件下經(jīng)過(guò)2 h的處理后，16 株菌的活菌數(shù)降到5（lg（CFU/mL））以下，20 株菌的活菌數(shù)降低到約6～7（lg（CFU/mL）），4 株菌的活菌數(shù)降低到5～6（lg（CFU/mL）），有9 株菌的活菌數(shù)基本保持不變。在pH 2.5的條件下經(jīng)過(guò)3 h處理后，24 株菌的活菌數(shù)降低到5（lg（CFU/mL））以下，13 株菌的活菌數(shù)降低到5～6（lg（CFU/mL）），9 株菌的活菌數(shù)降低到6～7（lg（CFU/mL）），3 株菌的活菌數(shù)基本保持不變。

表1 不同的乳酸菌株對(duì)低酸和膽鹽的耐受性結(jié)果Table 1 Tolerance to low acid and bile salt of different strains of lactic acid bacteria

2.2 供試乳酸菌菌株膽鹽耐受性篩選結(jié)果

如表1所示，測(cè)試的49 株乳酸菌中，在0.3%膽鹽處理3 h的條件下7 株菌完全不能存活，14 株菌的活菌數(shù)基本保持不變，活菌數(shù)仍可以維持在7～8（lg（CFU/mL）），9 株菌的活菌數(shù)明顯下降，活菌數(shù)降低到5（lg（CFU/mL））以下。經(jīng)過(guò)0.5%膽鹽處理3 h后，28 株菌完全不能存活，2 株菌的活菌數(shù)基本保持不變，活菌數(shù)仍可以維持在7～8（lg（CFU/mL）），7 株菌的活菌數(shù)降低到6～7（lg（CFU/mL）），12 株菌的活菌數(shù)降低到5（lg（CFU/mL））以下。經(jīng)過(guò)1%膽鹽處理3 h后，39 株菌完全不能存活，1 株菌的活菌數(shù)降低到6～7（lg（CFU/mL）），9 株菌的活菌數(shù)降低到5（lg（CFU/mL））以下。

根據(jù)對(duì)49 株乳酸菌菌株的低酸和膽鹽耐受性篩選，本研究最終篩選獲得6 株（A16、A44、B51、B54、B72和C53）進(jìn)一步分析其益生特性。

2.3 乳酸菌菌株的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

經(jīng)16S rRNA測(cè)序的方法獲得6 株乳酸菌的16S rRNA基因，分別為A16（1 522 bp）、A44（1 482 bp）、B51（1 578 bp）、B54（1 566 bp）、B72（1 494 bp）、C53（1 547 bp）。選取GenBank中相似性較高菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析。最終確定菌株A16和B72為戊糖乳桿菌，A44、B51、B54和C53為植物乳桿菌。

2.4 菌株疏水性

圖1 乳酸菌菌株的疏水性Fig. 1 Hydrophobicity of different strains of lactic acid bacteria

疏水性較高的菌株，可能會(huì)對(duì)小腸組織具有較高的黏附能力，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了6 株乳酸菌對(duì)二甲苯、乙酸乙酯和氯仿的疏水能力。由圖1可以看出，所有菌株均表現(xiàn)出一定的疏水性，不同菌株的疏水性差異較大。二甲苯是一種非極性溶劑，除了菌株B72，其余5 株菌均表現(xiàn)出對(duì)二甲苯較高的疏水性（＞50%），說(shuō)明這些菌株都具有疏水的細(xì)胞表面。氯仿是酸性溶劑，屬于電子受體，而乙酸乙酯是單堿性溶劑，屬于電子供體。供試的6 株乳酸菌對(duì)氯仿的疏水性都明顯高于對(duì)乙酸乙酯的疏水性，尤其是菌株A16和A44對(duì)氯仿的疏水性均大于80%，說(shuō)明這幾株菌都是電子供體。

2.5 菌株黏附能力

益生菌對(duì)腸道細(xì)胞的黏附能力是篩選益生菌的一個(gè)重要參考因素。Caco-2細(xì)胞系是分離自人結(jié)腸癌細(xì)胞的一株細(xì)胞，以表皮吸附的方式生長(zhǎng)，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下，可以表現(xiàn)出成熟腸道所具有的特征。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Caco-2細(xì)胞系作為體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯? 株菌對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附特性，結(jié)果見(jiàn)圖2。6 株菌的黏附能力存在比較明顯的菌株特異性（P＜0.05）。其中菌株A44有13.57%的菌體可以黏附到細(xì)胞上，黏附能力最強(qiáng)。菌株A16和B54的黏附率分別為11.24%和10.84%。菌株B51、B72和C53黏附能力相對(duì)較差，黏附率分別為5.76%、7.62%和9.32%。

圖2 乳酸菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附率Fig. 2 Adhesion of different strains of lactic acid bacteria to Caco-2 cells

2.6 菌株自凝聚能力

圖3 乳酸菌菌株的自凝聚率Fig. 3 Auto-aggregation ability of different strains of lactic acid bacteria

如圖3所示，菌株懸液的自凝聚率隨著靜置時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大，且不同的菌株間自凝聚率具有明顯的差異。其中菌株A44和B54在靜置3 h后較其他菌株表現(xiàn)出更好的自凝聚能力，5 h后菌株A44和B54的自凝聚率超過(guò)了60%，而A16和C53也表現(xiàn)出較好的自凝聚率，自凝聚率均超過(guò)40%。

2.7 菌株溶血活性

溶血活性是篩選益生菌的重要因素，不具有溶血活性才能將其認(rèn)為是安全的益生菌。圖4結(jié)果表明，6 株供試菌株在哥倫比亞血平板上生長(zhǎng)均未形成溶血圈。說(shuō)明這6 株乳酸菌均不具有溶血活性。

2.8 植物乳桿菌A44產(chǎn)酸能力測(cè)定結(jié)果

綜合以上功能特性的研究結(jié)果表明植物乳桿菌A44具有最好的功能活性，因此本實(shí)驗(yàn)選取菌株植物乳桿菌A44用于下一步發(fā)酵乳的研究。脫脂乳經(jīng)植物乳桿菌A44發(fā)酵6 h后測(cè)得發(fā)酵pH值為5.97，表明植物乳桿菌A44在乳中的產(chǎn)酸能力較差，不適合單獨(dú)作為發(fā)酵劑制作發(fā)酵乳，但是可以作為輔助發(fā)酵劑與商業(yè)發(fā)酵劑進(jìn)行復(fù)配使用提高發(fā)酵乳的益生功能。

2.9 發(fā)酵乳中乳酸菌活菌數(shù)的測(cè)定結(jié)果

表2 冷藏期間活菌數(shù)變化Table 2 Change in viable bacterial count during storage

如表2所示，經(jīng)4 ℃冷藏7 d后，添加植物乳桿菌A44混合發(fā)酵的樣品活菌數(shù)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），表明植物乳桿菌A44對(duì)商業(yè)發(fā)酵劑中的菌株生長(zhǎng)無(wú)影響，并能提高發(fā)酵乳的活菌數(shù)。發(fā)酵乳冷藏的7 d內(nèi)，活菌數(shù)沒(méi)有發(fā)生明顯的變化，說(shuō)明植物乳桿菌A44在冷藏過(guò)程中可以保持較好的存活能力，因此具有作為輔助發(fā)酵劑生產(chǎn)益生發(fā)酵乳的潛力。

2.10 發(fā)酵乳pH值和滴定酸度測(cè)定結(jié)果

圖5 發(fā)酵乳冷藏期間pH值和滴定酸度變化情況Fig. 5 Changes in pH and titrable acidity of yogurts during storage

由圖5可知，在4 ℃冷藏7 d期間，兩個(gè)發(fā)酵乳樣品的pH值均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈緩慢下降趨勢(shì)，而滴定酸度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)。添加植物乳桿菌A44與商業(yè)發(fā)酵劑復(fù)合發(fā)酵的處理組pH值和滴定酸度與單獨(dú)用商業(yè)發(fā)酵劑發(fā)酵的對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05），這可能是因?yàn)橹参锶闂U菌A44在乳中生長(zhǎng)的產(chǎn)酸能力較差，表明將植物乳桿菌A44以輔助發(fā)酵劑添加到發(fā)酵乳中對(duì)產(chǎn)品冷藏期間pH值和滴定酸度基本不產(chǎn)生影響。

2.11 發(fā)酵乳持水性測(cè)定結(jié)果

發(fā)酵乳的持水性越好，發(fā)酵乳的凝膠結(jié)構(gòu)中束縛的水分越多，使發(fā)酵乳能夠保持較好的口感[14]。由圖6可知，在4 ℃冷藏7 d期間，2 個(gè)發(fā)酵乳樣品隨著時(shí)間的延長(zhǎng)都保持著較好的持水能力，且將植物乳桿菌A44以輔助發(fā)酵劑添加到發(fā)酵乳中對(duì)產(chǎn)品冷藏期間持水性無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

圖6 發(fā)酵乳冷藏期間持水性變化情況Fig. 6 Changes in water-holding capacity of yogurts during storage

2.12 發(fā)酵乳黏度測(cè)定結(jié)果

圖7 發(fā)酵乳冷藏期間黏度變化情況Fig. 7 Changes in viscosity of yogurts during storage

由圖7可知，4 ℃冷藏7 d期間，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)兩組發(fā)酵乳的黏度都呈上升趨勢(shì)，主要是因?yàn)槔洳剡^(guò)程中，部分游離的凝乳微粒重新聚集到凝乳微粒的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，從而提高發(fā)酵乳的黏度。本實(shí)驗(yàn)中，在冷藏7 d內(nèi)復(fù)合發(fā)酵處理組的黏度都高于對(duì)照組的黏度，這可能是由于植物乳桿菌A44在發(fā)酵過(guò)程中可以產(chǎn)生胞外多糖從而提高了發(fā)酵乳的黏度[15]。

3 討 論

益生菌經(jīng)攝食進(jìn)入人體后，可以通過(guò)改善腸道菌群[16]、提高人體免疫活性[17]以及降低膽固醇[18]等對(duì)人體的健康起到有效的促進(jìn)作用。因此，目前關(guān)于功能性益生菌的研究受到了越來(lái)越多的關(guān)注，尤其是從傳統(tǒng)的發(fā)酵食品中篩選安全的功能益生菌已經(jīng)成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。本研究前期從東北傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜中分離得到49 株對(duì)食品中常見(jiàn)的腐敗性及致病性芽孢桿菌具有較好抑菌活性的乳酸菌菌株，本實(shí)驗(yàn)采用體外篩選的方法從這49 株中篩選得到6 株對(duì)酸及膽鹽具有較好耐受性的乳酸菌，體外研究其益生活性，期望其在功能性乳品中得到開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。

益生乳酸菌經(jīng)口服進(jìn)入人體后，必須能夠抵抗胃酸和腸道的高膽鹽環(huán)境，以及具有良好的腸道黏附性能才能夠最終定殖于腸道發(fā)揮其益生作用。因此益生乳酸菌的篩選必須要具有耐低酸及高膽鹽環(huán)境的能力，這樣才能保證其在人體內(nèi)發(fā)揮益生作用。Caggia等[1]研究了一些分離自奶酪中的乳桿菌對(duì)低pH值和高膽鹽具有極好的耐受能力。陳明等[10]報(bào)道從牦牛酸奶中篩選得到的植物乳桿菌XM5具有較強(qiáng)的耐酸和耐膽鹽能力。Karasu等[19]也發(fā)現(xiàn)分離自發(fā)酵蔬菜中植物乳桿菌能夠耐受低酸和高膽鹽環(huán)境。本研究從49 株具有對(duì)芽孢桿菌具有較好抑菌活性菌株的耐酸及耐膽鹽活性進(jìn)行篩選，結(jié)果有6 株菌能夠耐受pH 2.5的酸度及1%膽鹽添加量，說(shuō)明這幾株菌具有較強(qiáng)的低酸及高膽鹽耐受性。目前已經(jīng)有研究報(bào)道稱乳酸菌在代謝過(guò)程中產(chǎn)生細(xì)菌素可能會(huì)提高菌株對(duì)膽鹽和酸的耐受性，因?yàn)榧?xì)菌素對(duì)菌株在腸道內(nèi)定殖及與腸道內(nèi)其他菌株競(jìng)爭(zhēng)有優(yōu)勢(shì)[20-21]，且Bove等[22]也在基因表達(dá)的研究方面進(jìn)一步證實(shí)了這種說(shuō)法。Yu Zhihui等[23]從中國(guó)東北的發(fā)酵酸菜中分離獲得了具有較好耐低酸和高膽鹽的植物乳桿菌菌株，本研究結(jié)果與其相一致，說(shuō)明發(fā)酵酸菜中可以分離獲得對(duì)低酸和高膽鹽耐受性好的乳酸菌菌株。

疏水性是細(xì)菌與腸道表皮細(xì)胞相互吸附的重要指標(biāo)之一，有研究表明，乳酸桿菌對(duì)宿主腸道細(xì)胞的黏附能力是呈正相關(guān)的。因此，本研究應(yīng)用乙酸乙酯研究了乳酸菌菌株表面的對(duì)電子的接受能力以及應(yīng)用氯仿研究菌株表面的電子供給能力。結(jié)果表明所有待測(cè)菌株都具有較強(qiáng)的電子供給能力，說(shuō)明菌株都具有較強(qiáng)的疏水能力。通常研究認(rèn)為疏水性高的菌株對(duì)細(xì)胞的黏附性也高，一般可以通過(guò)細(xì)菌表面疏水性測(cè)定來(lái)初步篩選高黏附活性的菌株，Caggia[1]和Xu[24]等關(guān)于乳酸菌益生活性的研究都證實(shí)了這一結(jié)果。但也有報(bào)道稱1 株疏水性僅為2%的嗜酸乳桿菌對(duì)HT29MTX細(xì)胞的黏附率為40%[25]。因此，疏水性可能會(huì)對(duì)黏附作用具有促進(jìn)作用，但是疏水性好不能一定保證其對(duì)細(xì)胞具有強(qiáng)的黏附能力。

對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附能力被認(rèn)為是評(píng)價(jià)益生菌的一個(gè)重要因素，已經(jīng)有很多研究表明不同分離來(lái)源的乳桿菌都對(duì)腸上皮具有較強(qiáng)的黏附能力，如L. rhamnosus GG、L. casei ssp. shirota和L. casei ssp. imunitass[26-27]。本研究結(jié)果表明不同的乳酸菌菌株對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附能力表現(xiàn)出明顯的差異，其中植物乳桿菌A44的活性最好，黏附率為13.57%，與文獻(xiàn)報(bào)道的高黏附性菌株相比，其黏附率不是特別好，例如具有優(yōu)良益生活性的鼠李糖乳桿菌LGG的黏附率最高可以達(dá)到30%。但是體外黏附率高也不能完全代表菌株在人體內(nèi)的黏附能力，有很多具有良好益生特性并已經(jīng)成功應(yīng)用于商業(yè)化的乳酸菌的體外黏附率也不高，例如干酪乳桿菌Shirota和嗜酸乳桿菌NCFB1748等[28-29]。Laprra等[30]研究表明采用Caco-2單層細(xì)胞測(cè)定黏附能力更接近體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。研究認(rèn)為，菌株體外實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞黏附率高，可能在體內(nèi)黏附能力也會(huì)更好，但是體外對(duì)Caco-2細(xì)胞黏附能力不能完全用來(lái)評(píng)價(jià)菌株在體內(nèi)的黏附特性，還要綜合更多的因素進(jìn)行考慮。

本研究發(fā)現(xiàn)疏水率高、自凝聚率高的菌株對(duì)細(xì)胞黏附能力就越強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明菌株與細(xì)胞的黏附能力和其對(duì)有機(jī)溶劑的疏水性和自凝聚率呈正相關(guān)，這和以前Pithva等[31]的研究結(jié)果相一致。同時(shí)前人的研究也證明自凝聚力較強(qiáng)的菌株能夠在腸道細(xì)胞表面形成一層天然的屏障防止食源性致病菌定殖于腸道表面[32]。溶血活性是體外測(cè)定益生菌安全性的一個(gè)重要指標(biāo)之一，具有溶血活性的細(xì)菌對(duì)人具有較強(qiáng)的致病能力。目前的研究發(fā)現(xiàn)，大部分乳酸菌均不具有溶血活性。也有研究報(bào)道稱部分乳酸菌菌株具有溶血活性，Argyri等[33]對(duì)73 株乳桿菌的溶血實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)其中4 株菌具有溶血活性，而具有溶血活性的乳桿菌較為罕見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)的5 株益生菌均沒(méi)有溶血活性，說(shuō)明其可以安全地應(yīng)用于食品加工中。

4 結(jié) 論

本研究從分離自東北酸菜具有抑制食品中常見(jiàn)腐敗性及致病性芽孢桿菌活性的49 株乳酸菌中，篩選出6 株具有低酸和高膽鹽耐受性的菌株，通過(guò)16S rRNA分子生物學(xué)鑒定確定6 株乳酸菌中A16和B72為戊糖乳桿菌，A44、B51、B54和C53為植物乳桿菌。益生實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明植物乳桿菌A44具有較好的疏水性、黏附性及自聚率。研究確定本實(shí)驗(yàn)篩選得到的益生菌株對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附能力與其對(duì)有機(jī)溶劑的疏水性和自聚率呈一定的相關(guān)性。在4 ℃冷藏7 d期間，植物乳桿菌A44作為輔助發(fā)酵劑添加后對(duì)商業(yè)發(fā)酵劑發(fā)酵酸乳的pH值、滴定酸度和持水性等無(wú)顯著影響，但是可顯著提高發(fā)酵乳的活菌數(shù)和黏度（P＜0.05）。本研究結(jié)果為植物乳桿菌A44作為益生性發(fā)酵菌株的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論參考。