吳丹麗，李高磊，王明月，陳曉涵，李余動*

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018）

中國黃酒是世界上最古老的谷物酒之一，它是以稻米、黍米、小米等為主要原料，通過浸漬、蒸煮、加曲、發(fā)酵、壓榨、煎酒、貯存、勾兌而成的低度釀造酒。黃酒營養(yǎng)價(jià)值超過了有“液體面包”之稱的啤酒和營養(yǎng)豐富的葡萄酒，被譽(yù)為“液體蛋糕”[1]。據(jù)檢測，黃酒中的主要成分除乙醇和水之外，還有豐富的氨基酸、多糖、維生素以及20多種人體所必需的微量元素等[2]。然而，隨著人民生活水平的提高以及酒類產(chǎn)品出口的需要，黃酒中較為突出的氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）含量超標(biāo)[3]問題一直困擾著黃酒發(fā)酵工業(yè)。EC是發(fā)酵食品和酒飲料的伴隨產(chǎn)物，具有遺傳毒性和致癌性。經(jīng)酒類飲品攝入的EC對健康構(gòu)成潛在風(fēng)險(xiǎn)，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)已經(jīng)將EC列為人類可能致癌物質(zhì)（2A類）[4]。黃酒中90%的EC由尿素和乙醇反應(yīng)生成[5]，而尿素主要由精氨酸經(jīng)酵母細(xì)胞內(nèi)的精氨酸-尿酶路徑分解產(chǎn)生[6]。因此，菌株的產(chǎn)尿素能力可以作為低EC含量黃酒發(fā)酵的重要指標(biāo)之一。另一方面，高級醇作為黃酒的重要風(fēng)味物質(zhì)之一，能夠賦予黃酒酒體特殊的香氣[7]，若黃酒中高級醇含量偏少，則會使酒味淡薄且酒體不豐滿，但是黃酒中高級醇含量過高時(shí)，會造成“上頭”作用[8]，對人體產(chǎn)生一定的危害，并隨其分子質(zhì)量的增加，毒性也相應(yīng)的增加。因此，控制黃酒中高級醇的含量也尤為重要。

本研究利用菌株的低產(chǎn)尿素及高級醇能力來篩選菌株，通過生理生化與分子手段鑒定菌株的分類地位，并在黃酒發(fā)酵模擬條件下比較菌株的發(fā)酵性能及黃酒成分，從而篩選出低產(chǎn)尿素和低產(chǎn)高級醇的優(yōu)良菌株。本研究所篩選菌株的工業(yè)化應(yīng)用有助于減少黃酒中EC和高級醇的含量，提高黃酒的品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母菌株AW001、D2、IJ、J-16-2、N85，由浙江工商大學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

YPD培養(yǎng)基：酵母提取物1%、葡萄糖2%、蛋白胨2%、水100 mL，115 ℃高壓滅菌20 min；精氨酸利用檢測培養(yǎng)基：葡萄糖2%，精氨酸10 mmol/L，無氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基0.17 g/L，115 ℃高壓滅菌20 min；尿素利用檢測培養(yǎng)基：葡萄糖2%，尿素10 mmol/L，無氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基0.17 g/L，115 ℃高壓滅菌20 min；其他生理生化鑒定用培養(yǎng)基根據(jù)文獻(xiàn)[9]的方法制備。

酵母基因組提取試劑盒 美國BioTek公司。

1.2 儀器與設(shè)備

721型可見分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；核酸電泳儀 美國Bio-Rad公司；高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；Biometra型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 北京東方安諾生化科技有限公司；JS-680B型電泳圖像分析儀 上海培青科技有限公司；LightCycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀美國羅氏公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱 浙江省嘉興市新勝電器廠。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)尿素能力測定[10]

用滅菌的竹簽從甘油管中挑取少許接種到已滅菌的YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)過夜，取200 μL菌液接種至另一瓶YPD液體培養(yǎng)基中二次活化，然后進(jìn)行平板劃線，挑取單菌落劃試管斜面待用。從4 ℃冰箱中保存的試管斜面上挑取適量菌體接種于YPD液體培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)，菌液供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

量取配制好的精氨酸利用檢測培養(yǎng)基以及尿素利用檢測培養(yǎng)基100 mL分裝至250 mL三角瓶中，滅菌。待冷卻后，分別接入活化酵母（接種量為1×107cell/mL），30 ℃、200 r/min進(jìn)行培養(yǎng)。每隔4 h取樣，持續(xù)48 h，共取樣12 次。所取樣品均進(jìn)行OD600nm的測定，48 h的終發(fā)酵液進(jìn)行尿素含量的測定，每隔12 h在精氨酸利用培養(yǎng)基中取樣，送至江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)平臺測定其中精氨酸的含量變化。

1.3.2 黃酒發(fā)酵模擬及理化指標(biāo)測定[11]

黃酒發(fā)酵過程：取100 g大米，在室溫中浸漬2～3 d，經(jīng)常壓蒸煮冷卻后，分裝至1 L的三角瓶中，添加10%的麥曲、170 g水，并將經(jīng)活化后的酵母菌按1×107cell/mL的接種量接種至熟米飯中，前酵于30 ℃靜置發(fā)酵5 d，隨后將搖瓶置于15 ℃繼續(xù)靜置發(fā)酵，15 d后結(jié)束后酵，取發(fā)酵液檢測理化指標(biāo)。

理化指標(biāo)測定：按照GB/T 13662—2008《黃酒》中方法進(jìn)行測定；酵母計(jì)數(shù)：采用血球計(jì)數(shù)板；揮發(fā)性成分的測定：參照參考文獻(xiàn)[12]進(jìn)行；尿素氮含量的測定：采用血尿素氮試劑盒測定。

1.3.3 酵母菌的分子鑒定與定量PCR

1.3.3.1 酵母菌的常規(guī)鑒定及基因組提取

酵母菌的生理生化特征性實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)的方法進(jìn)行[13]。采用酵母菌基因組提取試劑盒提取基因組，放置于-20 ℃保存，待下一步分子鑒定。

1.3.3.2 PCR擴(kuò)增[14-15]

以提取的酵母菌基因組D N A作為模版，r D N A-I T S序列擴(kuò)增所采用的通用引物為I T S 1（5′- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。反應(yīng)體系（50 μL）為：RNase-Free Water 22 μL，2×Es Taq MasterMix 25 μL，F(xiàn)orward Primer（20 μmol/L）1.0 μL，Reverse Primer（20 μmol/L）1.0 μL，Template DNA 1 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火30 s，循環(huán)30 次，72 ℃延伸2 min，72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，DL2000 DNA Marker作為參照標(biāo)準(zhǔn)，凝膠成像儀觀察記錄結(jié)果。

1.3.3.3 菌株系統(tǒng)進(jìn)化分析

將測序所得結(jié)果進(jìn)行BLAST同源序列，得到與此序列相近的已知酵母菌株。隨后采用MEGA 6.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹[16]。

1.3.3.4 相對定量PCR驗(yàn)證[17-18]

采用TakaRa公司的產(chǎn)品SYBR?Premix ExTaq?染料法對目的基因進(jìn)行相對定量實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)用到的內(nèi)參基因?yàn)?8S rRNA基因，對照組為實(shí)驗(yàn)室已有的BY4741菌株。利用NCBI網(wǎng)站查找CAR2的核酸序列，然后繼續(xù)用該網(wǎng)站的Primer BLAST設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR引物，后利用Primer Premier 5軟件對設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行評分，得到評分較高的引物送公司合成。引物合成后，先用普通PCR實(shí)驗(yàn)來初步驗(yàn)證引物的特異性，再按照SYBR染料試劑說明和所使用儀器LightCycler 480 System設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR體系和參數(shù)（表1）。

表1 LightCycler 480 System儀器參數(shù)設(shè)置和實(shí)時(shí)定量PCR體系Table 1 LightCycler 480 System parameter setting and qPCR system

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

一般實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行3 次測定，不同培養(yǎng)條件下菌株的生長差異分析（t-test）及結(jié)果作圖都由Origain Pro 9.0完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌株產(chǎn)尿素能力比較

2.1.1 精氨酸利用檢測培養(yǎng)基

黃酒中的尿素主要是由精氨酸代謝產(chǎn)生，因此本研究首先通過精氨酸為唯一氮源的培養(yǎng)基比較不同酵母菌株的產(chǎn)尿素能力[19]。由圖1A可以看出，在添加精氨酸的培養(yǎng)基中菌株的生長速率由快至慢依次為IJ、D2、N85、J-16-2、AW001。當(dāng)?shù)竭_(dá)48 h時(shí)，各菌株的OD600nm值基本處于一致。約30 h時(shí)，IJ、D2、N85三株菌的對數(shù)生長期基本結(jié)束，菌株的生長開始進(jìn)入穩(wěn)定期，而此時(shí)菌株J-16-2、AW001兩株菌的生長依然處于對數(shù)生長期，因48 h時(shí)5 株菌的OD600nm值基本相同，所以大致可以推測48 h后J-16-2、AW001該兩株菌的最終OD600nm值較IJ、D2、N85高，即J-16-2、AW001在精氨酸利用培養(yǎng)基中生長狀況比IJ、D2、N85良好。

從圖1B可看出，菌株IJ發(fā)酵產(chǎn)生的尿素最多，而菌株AW001的最終發(fā)酵液中尿素含量在該5 株菌中最低。菌株在生長繁殖以及進(jìn)行乙醇發(fā)酵的過程中，合成的大量尿素除了滿足自身需要之外，多余的尿素被分泌到體外，從而使酒樣中的尿素含量增加。酵母菌細(xì)胞內(nèi)的精氨酸酶活力也會隨之提高[17]，通過精氨酸酶-尿酶途徑分解精氨酸，進(jìn)一步加速了尿素的生成，影響黃酒的品質(zhì)。

圖1C為精氨酸培養(yǎng)基中不同黃酒酵母對精氨酸的利用量測定。在0～12 h中，各菌株對精氨酸的利用量基本一致且均非常少；在12～24 h中，菌株對精氨酸的利用量開始增加，發(fā)酵液中精氨酸的含量開始減少，其中以菌株IJ的利用量最大；在24～36 h中，菌株D2、IJ、N85發(fā)酵液中的精氨酸含量開始大幅度降低，但是菌株AW001、J-16-2發(fā)酵液中精氨酸含量降低程度相對較少；在36 h時(shí)，各菌株發(fā)酵液中精氨酸的含量呈現(xiàn)較大的差異性，其中以J-16-2發(fā)酵液中的含量最高，菌株IJ發(fā)酵液中的含量最低；在36～48 h中，菌株J-16-2的發(fā)酵液中精氨酸的含量大幅度降低，在48 h時(shí)，各菌株發(fā)酵液中精氨酸的含量差異較為明顯，精氨酸含量由多至少依次為AW001、J-16-2、N85、D2、IJ，與尿素含量正好相反，此結(jié)果與尿素測定結(jié)果相一致。

圖1 酵母菌株在精氨酸利用培養(yǎng)基中的生長狀況（A）、產(chǎn)尿素含量（B）以及精氨酸利用情況（C）Fig. 1 Growth curves of yeast strains (A), urea production (B) and arginine utilization (C) on medium containing arginine as sole nitrogen source

2.1.2 尿素利用檢測培養(yǎng)基

為考察酵母菌株對尿素的利用能力，通過以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基檢測酵母菌的生長情況。從圖2A可以看出，在添加尿素的培養(yǎng)基中菌株的生長速率由快至慢依次為IJ、D2、J-16-2、AW001、N85，當(dāng)?shù)竭_(dá)48 h時(shí)，菌株IJ、D2、J-16-2、AW001的OD600nm值基本處于一致，而N85的OD600nm值相對較低，說明菌株N85在尿素培養(yǎng)基中生長狀況略差于菌株IJ、D2、J-16-2、AW001。從圖2B可以看出，菌株J-16-2最終發(fā)酵液中尿素含量最高，表明其對尿素的利用能力最差，隨后依次是N85、D2、AW001、IJ，但5 個菌株間差異不顯著。酵母生長狀況與尿素利用情況無明顯關(guān)聯(lián)，也說明黃酒發(fā)酵液中的尿素含量主要受黃酒酵母菌株對精氨酸代謝的影響。

圖2 酵母菌株在尿素利用培養(yǎng)基中的生長狀況（A）以及產(chǎn)尿素含量（B）Fig. 2 Growth curves of yeast strains (A) and urea production (B) on medium containing urea as sole nitrogen source

2.2 精氨酸代謝基因CAR2拷貝數(shù)分析

圖3 酵母菌株在精氨酸利用培養(yǎng)基中的對數(shù)期生長速率（A）與CAR2基因相對拷貝數(shù)（B）Fig. 3 Relative growth rates of yeast strains in the logarithmic phase on medium containing arginine as sole nitrogen source (A) and copy number of CAR2 gene (B)

精氨酸的代謝與CAR2基因拷貝數(shù)有關(guān)，CAR2基因編輯L-鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶，參與精氨酸分解代謝的第2步酶促反應(yīng)過程。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[20]，在精氨酸利用培養(yǎng)基中，酵母菌的相對生長速率與CAR2基因的拷貝數(shù)有一定的關(guān)系，即CAR2基因的拷貝數(shù)越多其生長速率越快。以BY4741菌為對照，利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對這5 株菌做了CAR2基因拷貝數(shù)驗(yàn)證。圖3A為5 株菌在對數(shù)期的生長速率，可以看到AW001在對數(shù)期生長速度最快，其次是IJ、D2、N85、J-16-2。圖3B為不同菌株中CAR2基因的拷貝數(shù)結(jié)果，其中AW001的CAR2基因拷貝數(shù)最多，而其在精氨酸培養(yǎng)基中的生長速率也最快，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致，CAR2基因拷貝數(shù)越多對精氨酸利用能力越強(qiáng)。因此CAR2基因的拷貝數(shù)分析結(jié)果進(jìn)一步說明AW001對精氨酸的利用能力較強(qiáng)。

2.3 黃酒發(fā)酵高級醇含量分析

表2 不同酵母菌株發(fā)酵產(chǎn)物中的主要揮發(fā)性成分含量Table 2 Concentrations of main volatile fl avor compounds in rice wines fermented with yeast strains μg/L

黃酒中的主要成分是水、乙醇和糖分，三者約占總量的96%～97%，其他微量組分僅占3%～4%，但是這些微量組分卻決定了黃酒的風(fēng)味特征及品質(zhì)的差異[12,21]，其中包括醇類、醛類、酯類等。黃酒中的高級醇是重要的風(fēng)味物質(zhì)，能賦予酒體醇香味，襯托酯香。但是當(dāng)其含量過高時(shí)致醉性增強(qiáng)，會使人頭痛、惡心（俗稱“上頭”），對人體有毒害的作用，還會產(chǎn)生不和諧的味道，影響酒體品質(zhì)。因此有必要控制黃酒中高級醇的含量[22]。如表2所示，本研究測定的醇類物質(zhì)主要包括：3-甲基丁醇、2-甲基丁醇、正丁醇（刺激臭，帶有澀味）、苯乙醇（似玫瑰香，持久性強(qiáng)，微帶苦味），它們在黃酒中含量遠(yuǎn)高于其他揮發(fā)性醇類。通過比較不同酵母菌株發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性醇類總量，菌株AW001及J-16-2發(fā)酵的黃酒樣品中高級醇含量遠(yuǎn)低于其他的菌株，因此菌株AW001和J-16-2在此方面的發(fā)酵性能更優(yōu)良。

2.4 黃酒發(fā)酵理化指標(biāo)分析

如表3所示，菌株AW001以及J-16-2所發(fā)酵黃酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)比其他3 株菌均高，且此兩株菌最終的總糖含量也較高，表明該兩株菌的乙醇發(fā)酵能力更強(qiáng)，對糖類物質(zhì)的利用率遠(yuǎn)大于其他3 株菌。GB/T 13662—2008中對各種類型黃酒中總酸的要求基本都在2.5～8.0 g/L之間，適量的酸對于黃酒的品質(zhì)有積極的促進(jìn)作用，由表3可知，5 株菌發(fā)酵的黃酒樣品中總酸的含量均達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)[23]。酵母菌能夠利用氨基酸態(tài)氮進(jìn)一步代謝生成高級醇，此外，還可以與糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，增加黃酒的色澤，菌株AW001及J-16-2中氨基酸態(tài)氮的含量高于其他菌株。此外，黃酒的風(fēng)味、品質(zhì)還受到揮發(fā)性醇類、酯類、醛類等的影響，其含量測定結(jié)果如表2所示。綜上所述，菌株AW001以及J-16-2完全符合黃酒相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)要求，且在乙醇、氨基酸態(tài)氮等方面有明顯的優(yōu)勢[24]。

表3 酵母菌株發(fā)酵產(chǎn)物的理化指標(biāo)Table 3 Physicochemical indexes of rice wines fermented with yeast strains

2.5 酵母菌株鑒定

2.5.1 生理生化實(shí)驗(yàn)

對酵母菌進(jìn)行生理生化鑒定[25]，如表4所示，在糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，5 株酵母菌均能利用葡萄糖、麥芽糖以及蔗糖進(jìn)行發(fā)酵，然而均不能利用乳糖與可溶性淀粉。在碳源同化實(shí)驗(yàn)中，D-葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、D-半乳糖以及棉籽糖均能被5 株菌所利用，但是乳糖、菊糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、鼠李糖、D-纖維二糖、山梨糖、淀粉、肌醇及檸檬酸均不能被5 株菌所利用。氮源同化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示硫酸銨與硝酸銨均能被5 株菌所利用，檸檬酸鈉只能被菌株AW001所同化，卻不能被其他4 株所利用，硝酸鉀與醋酸鈉均不能被5 株菌使用。5 株菌的生長過程均不能產(chǎn)類淀粉類化合物以及脂類物質(zhì)。在無維生素培養(yǎng)基上，該5 株菌均能生長。

表4 菌株的生理生化鑒定結(jié)果Table 4 Physiological and biochemical identification of yeast strains

2.5.2 分子鑒定

酵母的ITS序列位于26S和5.8S及5.8S和18S rDNA基因之間，屬于高度可變的區(qū)域，適用于親緣關(guān)系較近的菌株間的分類研究[26]。因此，本實(shí)驗(yàn)將所提取的酵母菌株的基因組，利用ITS1以及ITS4作為引物對菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以DL2000的DNA Marker作為標(biāo)準(zhǔn)，通過圖4可以看出，所有菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶遷移均一，所擴(kuò)增的片段大小約為800 bp，與ITS目標(biāo)序列長度一致。

圖4 酵母菌基因組ITS 區(qū)段PCR擴(kuò)增圖譜Fig. 4 Electrophotogram of PCR-amplified ITS from yeast

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序后，得到菌株的rDNA ITS片段序列，并將獲得的序列進(jìn)行BLAST分析獲得與其同源的其他酵母菌株的ITS序列。通過多序列比對，利用MEGA軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。從圖5可以看出，菌株AW001、J-16-2以及N85與酵母屬中的Saccharomyces bayanus進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，而與Saccharomyces cerevisiae的遺傳距離較近。菌株AW001與S. cerevisiae YJM1304聚集在同一分支上，其堿基差異率為0.003，在ITS水平上可以鑒定為S. cerevisiae；菌株N85與S. cerevisiae CBS405聚集在同一分支上，堿基差異率為0.001，在ITS水平上同樣也可以鑒定為S. cerevisiae；而菌株J-16-2與S. cerevisiae YJM271聚集在同一分支上，堿基差異率為0.021。因此在ITS水平上可將這3 株酵母菌鑒定為釀酒酵母（S. cerevisiae）。

圖5 基于rDNA ITS序列的進(jìn)化樹Fig. 5 Phylogenetic tree based on rDNA ITS sequence alignment

3 結(jié) 論

釀酒酵母菌株性能的優(yōu)劣對于發(fā)酵酒的品質(zhì)起到關(guān)鍵性作用[27]。本研究對實(shí)驗(yàn)室已分離的5 株酵母菌株進(jìn)行低產(chǎn)尿素以及高級醇篩選，隨后進(jìn)行菌株的鑒定及模擬黃酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。在低產(chǎn)尿素實(shí)驗(yàn)中，菌株AW001和J-16-2利用精氨酸產(chǎn)生尿素的能力弱于菌株D2、IJ以及N85，因此能夠有助于控制黃酒中EC的含量。另通過測定黃酒發(fā)酵樣品中醇類物質(zhì)的含量篩選出產(chǎn)高級醇較少的菌株AW001和J-16-2，有助于解決高級醇“上頭”問題。綜合實(shí)驗(yàn)室模擬黃酒發(fā)酵的各個指標(biāo)數(shù)據(jù)，菌株AW001和J-16-2除產(chǎn)生的乙醇高于其他3 株菌外，其他指標(biāo)也均符合國標(biāo)要求。因此本研究篩選出性能較好的酵母菌株AW001和J-16-2將有進(jìn)一步開發(fā)利用的價(jià)值。