扎木蘇，楊華青，王 鑫，孫寶國，王成濤,*，盧 松

（1.北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京工商大學，北京 100048；2.阜豐集團內(nèi)蒙古阜豐生物科技有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030）

揮發(fā)性硫醇類化合物是多種食品（肉制品、水果、蔬菜、茶、咖啡及酒精飲料等）的重要風味成分[1-4]，由于其極低香氣閾值和獨特香氣特征[5-6]，使其在食品風味形成中扮演著重要角色，成為一類應用廣泛的食用香料[7-8]?？妨虼?、3-甲硫基丙醇等硫醇類化合物在中國白酒風味中發(fā)揮著特殊作用[9-11]，具有強烈的蔥香、肉香、烤香和芝麻香等香氣特征，被認為是中國芝麻香型白酒的重要香氣成分[12-13]。

近年研究發(fā)現(xiàn)，微生物來源的β-裂解酶參與硫醇類物質(zhì)的合成，大部分的細菌具有β-裂解酶活力，可以催化裂解醛-半胱氨酸加合物合成硫醇[14-15]。Tominaga等[16]首次發(fā)現(xiàn)細菌和植物來源的C—S β-裂解酶可以催化裂解半胱氨酸加合物生成3-巰基-1-己醇（3-mercapto-1-hexanol，3MH）和4-甲基-4-巰基-2-戊酮（4-mercapto-4-methylpentan-2-one，4MMP）。Swiegers等[17]研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌中tnaA基因所編碼的色氨酸激酶具有強C—S β-裂解酶活力，該基因超表達的工程菌可有效提升其葡萄酒中硫醇類物質(zhì)含量。雖然多種細菌具有C—S β-裂解酶活力，但這些細菌通常不是食品級微生物，只有少數(shù)食品級微生物具有C—S β-裂解酶活力，如S. cerevisiae含有胱硫醚β-裂解酶（cystathionine β-lyase，Str3p），可裂解胱硫醚中的C—S鍵。Huynh等[18]研究面包酵母在生物轉(zhuǎn)化制備硫醇中的應用。Thibon等[19]報道葡萄酒中酵母菌可催化半胱氨酸加合物生成硫醇類物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，有些酵母來源的基因參與硫醇類物質(zhì)合成，但這些基因及其編碼酶在硫醇類物質(zhì)合成中的作用仍不明晰。本課題組前期研究中，從芝麻香型白酒大曲中篩選獲得1 株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）G20，發(fā)現(xiàn)菌株可利用半胱氨酸糠醛加合物合成糠硫醇，通過基因超表達和敲除發(fā)現(xiàn)Str3基因是糠硫醇合成關鍵基因[11,20]，但其功能還未明晰。

本實驗將來源于S. cerevisiae G20的Str3基因重組轉(zhuǎn)化到E. coli BL21中進行超表達，正交設計試驗優(yōu)化重組蛋白Str3p誘導表達條件以提高其表達量，親和層析純化后研究Str3p催化生成糠硫醇的能力，該方面研究將為糠硫醇生物轉(zhuǎn)化、發(fā)酵食品特征風味形成提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

釀酒酵母（S. cerevisiae）G20由本實驗室保存；pEASY-E1、大腸桿菌（Escherichia coli）Trans-T1感受態(tài)北京全式金生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌BL21（DE3）北京天根生化科技有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

LB液體培養(yǎng)基：酵母提取物5.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，pH 7.0；LB固體培養(yǎng)基：酵母提取物5.0 g/L，胰蛋白胨10.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，瓊脂15.0 g/L，pH 7.0。

糠硫醇、L-胱硫醚 美國Sigma公司；半胱氨酸、糠醛、磷酸吡哆醛、咪唑、異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl thiogalactoside，IPTG）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA） 北京半夏生物科技有限公司；PrimeSTAR Max Premix（2×）寶生物工程（大連）有限公司；酵母基因組提取試劑盒、高純質(zhì)粒小量制備試劑盒、多功能DNA純化回收試劑盒 北京天根生化科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

PowerPac Basic電泳儀、C1000-Touch聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；小型高速離心機 美國Sigma公司；SPX-150B生化培養(yǎng)箱 上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；BioSpectrum凝膠成像儀 美國UVP公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 釀酒酵母Str3基因的克隆及重組菌E. coli BL21（pEASY-E1-Str3）的構(gòu)建

以糠硫醇合成菌株S. c e r e v i s i a e G 2 0的全基因組為模板，設計引物S t r 3-f（ATGCCGATCAAGAGATTAGATACAG）和Str3-r（CTTACAATTTCGAACTCTT）克隆Str3基因，PCR條件：95 ℃變性5 min；95 ℃、30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃、8 s，循環(huán)30 次；72 ℃延伸10 min。參考pEASY-E1使用說明，將純化回收的目的片段與質(zhì)粒pEASY-E1連接，電擊轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)，菌液涂布于200 μg/mL氨芐青霉素LB抗性平板上。37 ℃培養(yǎng)12 h后挑取單菌落、培養(yǎng)，提取質(zhì)粒經(jīng)PCR（T7 Prmoter Primer和Str3-r驗證陽性克?。┖蜏y序驗證，獲取表達載體pEASY-E1-Str3。表達載體經(jīng)熱激轉(zhuǎn)化至宿主菌E. coliBL21（DE3），于200 μg/mL氨芐青霉素LB抗性平板上篩選獲得陽性重組子E. coliBL21（pEASY-E1-Str3）。

1.3.2 重組E. coliBL21（pEASY-E1-Str3）的Str3p表達

將培養(yǎng)過夜的重組大腸桿菌E. coliBL21（pEASYE1-Str3）按體積分數(shù)1%接種到200 mL LB液體培養(yǎng)基（含200 μg/mL氨芐青霉素）中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600nm值為0.4～0.6，加入終濃度為0.3 mmol/L的IPTG于16 ℃、150 r/min誘導9 h，菌液于4 ℃、6 000 r/min離心10 min，菌體經(jīng)懸浮、洗滌（0.1 mol/L磷酸緩沖液，pH 7.4）后備用。

1.3.3 Str3p的純化

1.3.3.1 粗酶液提取[20]

將1.3.2節(jié)離心收獲的菌體重懸于破壁緩沖溶液（含50 mmol/L Tris，pH 8.0，100 mmol/L KCl，10%甘油，0.25 mmol/L Triton X-100，10 mmol/L咪唑，100 μmol/L磷酸吡哆醛）中，冰水浴超聲（225 W，超聲6 s，間隔3 s）處理10 min，細胞破碎液在4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集的上清液即為粗酶液。

1.3.3.2 HisSep Ni-NTA純化Str3p[20]

層析柱經(jīng)平衡緩沖溶液（20 mmol/L Tris，pH 7.0，250 mmol/L KCl，100 μmol/L磷酸吡哆醛和20 mmol/L咪唑）預平衡，設置流速1 mL/min，將上清液加入層析柱，并用30 mL平衡緩沖液（1 mL/min）進行沖洗，隨后用洗脫緩沖液（20 mmol/L Tris，pH 7.0，250 mmol/L KCl，100 μmol/L磷酸吡哆醛，200 mmol/L咪唑）進行洗脫，收集洗脫液并于4 ℃保藏備用。

1.3.4 酶活力測定

參考曹珊珊等[21]的方法，并進行一定修改。設置反應體系為100 μL，在5 mmol/L的L-胱硫醚底物溶液（0.1 mol/L K2HPO4溶液配制，pH 7.4）中加入適量酶液（20 μg/mL），37 ℃水浴保溫20 min，然后煮沸2 min終止反應，在反應液中加入100 μL 1 mmol/L的2,4-二硝基苯肼和1 mL 0.4 mol/L的NaOH溶液，室溫靜置30 min。于520 nm波長測定吸光度，以不加酶液的反應液為對照。以不同濃度的丙酮酸鈉標準溶液和2,4-二硝基苯肼反應，繪制丙酮酸鈉濃度和吸光度之間的標準曲線。

酶活力定義[21]：1 個酶活力單位（1 U）為37 ℃、pH 7.4、1 h能催化產(chǎn)生1 μmol/L丙酮酸的酶量。

1.3.5 蛋白含量測定

采用Bradford法[20-21]測定蛋白質(zhì)含量并繪制牛血清白蛋白標準曲線。

1.3.6 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

細胞破碎上清液和洗脫液經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析目的蛋白純化結(jié)果，使用考馬斯亮藍R-250染色。

1.3.7 誘導條件對Str3p表達量的影響

將培養(yǎng)過夜的重組菌E. coliBL21（pEASY-E1-Str3）按體積分數(shù)1%接種到200 mL含有200 μg/mL氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600nm值為0.4～0.6，誘導條件選取IPTG誘導濃度、誘導時間和溫度作為影響蛋白表達量的主要因素，研究以上誘導條件對Str3p表達量的影響，同時采用正交設計試驗法優(yōu)化Str3p的表達量。

1.3.7.1 單因素試驗

在1.3.7節(jié)的培養(yǎng)液中添加IPTG終濃度為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mmol/L，于16 ℃、150 r/min誘導9 h，收集粗酶液測定酶活力；在培養(yǎng)液中加入終濃度0.5 mmol/L IPTG，控制溫度16、20、25、30、37 ℃，150 r/min誘導9 h，收集粗酶液測定酶活力；在培養(yǎng)液中加入終濃度0.5 mmol/L IPTG，于20 ℃、150 r/min分別誘導5、7、9、11、13、15 h，收集粗酶液測定酶活力。

1.3.7.2 正交設計試驗優(yōu)化Str3p酶活力

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取影響Str3p表達量各因素中有意義的水平，以IPTG濃度、誘導溫度和時間為3 個考察因素（表1），選取3 個水平并采用L9（33）正交表進行正交試驗設計，確定最適誘導條件并驗證。

表1 IPTG誘導條件優(yōu)化L9（33）正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in L9 (33) orthogonal array design for optimization of IPTG induction conditions

1.3.8 Str3p催化裂解半胱氨酸-糠醛加合物

半胱氨酸-糠醛加合物制備參考Huynh等[18]的方法。催化反應體系500 μL為：50 μg/mL Str3p、50 mmol/L磷酸緩沖液、pH 5.0～8.0、20 μmol/L磷酸吡哆醛、1 mmol/L EDTA、10 mmol/L半胱氨酸-糠醛加合物，30 ℃水浴保溫1 h，以添加滅活蛋白的反應液為空白，檢測糠硫醇產(chǎn)量。

糠硫醇的檢測參考扎木蘇等[20]的方法并稍作修改，取500 μL反應液，分別用0.5 mL二氯甲烷萃取2 次，合并萃取液后4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取有機層（下層）液體，經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾裝入小瓶密封冷藏，待分析。

氣相色譜-質(zhì)譜條件：T G-5 M S毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃，載氣He（99.999 5%），流速1.5 mL/min；不分流進樣，進樣量1.0 μL；升溫程序：初始溫度35 ℃持續(xù)2 min，以10 ℃/min升至280 ℃，恒溫15 min；質(zhì)譜條件：電子電離源，質(zhì)譜傳輸線溫度230 ℃，離子源溫度230 ℃，溶劑延遲3 min，選擇離子對監(jiān)測，糠醛（m/z96→95）、糠硫醇（m/z81→53）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗中每個處理平行重復3 次，采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)的處理和分析，采用Origin 8.5進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母Str3基因克隆及重組質(zhì)粒pEASY-E1-Str3的構(gòu)建結(jié)果

圖1 PCR克隆重組質(zhì)粒pEASY-E1-Str3凝膠電泳圖Fig. 1 Electrophoresis of PCR-amplified pEASY-E1-Str3

由圖1可知，PCR產(chǎn)物條帶約1 400 bp，與預期大小相符。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR驗證和測序分析，確認其大小及測序結(jié)果與GenBank中已報道的釀酒酵母Str3基因一致。由圖2可知，重組質(zhì)粒雙酶切驗證，分別呈現(xiàn)5 700 bp和1 400 bp兩條條帶，分別與質(zhì)粒pEASY-E1和Str3基因大小一致；重組質(zhì)粒條帶約7 100 bp，與預期大小相符，說明重組質(zhì)粒pEASY-E1-Str3構(gòu)建成功。

圖2 重組質(zhì)粒pEASY-E1-Str3及其酶切凝膠電泳圖Fig. 2 Electrophoresis of pEASY-E1-Str3 and restriction enzyme digestion product

2.2 Str3p異源表達工程菌構(gòu)建

Str3p經(jīng)E. coliBL21表達，并在其輔因子（磷酸吡哆醛）存在的情況下，利用鎳柱純化，最終獲取目的蛋白。如圖3所示，目的蛋白分子質(zhì)量約為52 kDa，這與釀酒酵母Str3p分子質(zhì)量的理論計算值（52.7 kDa）一致。重組菌在低溫條件下誘導，Str3p表達量較高，其質(zhì)量濃度約為0.89 mg/mL。Holt等[20]同樣表達純化釀酒酵母VIN 13的Str3p，其分子質(zhì)量約為52 kDa，與本實驗結(jié)果一致。

圖3 SDS-PAGE分析Str3p純化結(jié)果Fig. 3 SDS-PAGE analysis of nickel affinity-purified Str3p

2.3 誘導條件對工程菌E. coli BL21（pEASY-E1-Str3）的Str3p表達量的影響

2.3.1 IPTG濃度對Str3p表達量的影響

圖4 IPTG濃度對Str3p酶活力的影響Fig. 4 Effect of IPTG concentration on the activity of Str3p

如圖4所示，IPTG濃度對Str3p酶活力變化有顯著影響（P＜0.05），隨其濃度的增加，Str3p酶活力呈現(xiàn)先增后降的趨勢，其中最適IPTG誘導濃度為0.5 mmol/L，當IPTG濃度過高時，可能會影響菌株生長和蛋白的表達，進而導致Str3p酶活力降低。

2.3.2 誘導溫度對Str3p表達量的影響

由圖5可知，誘導溫度對Str3p表達量的影響極顯著（P＜0.01），Str3p最適誘導溫度為20 ℃，隨著溫度的升高，酶活力逐漸下降。通常溫度的升高往往會使蛋白錯誤折疊形成包涵體，從而失去活力，但過低的溫度也會導致菌體生長受到抑制，使蛋白表達量下降。因此，適宜的溫度條件下誘導，有利于Str3p的表達。

圖5 誘導溫度對Str3p酶活力的影響Fig. 5 Effect of induction temperature on the activity of Str3p

2.3.3 誘導時間對Str3p表達量的影響

圖6 誘導時間對Str3p酶活力的影響Fig. 6 Effect of induction time on the activity of Str3p

如圖6所示，誘導時間對Str3p表達量有顯著影響（P＜0.05），隨誘導時間的延長，Str3p酶活力不斷上升，當誘導時間大于13 h時，Str3p酶活力急劇下降，因此認為13 h為適宜的IPTG誘導時間。通常誘導時間短，菌體生長仍處于適應期，蛋白表達量較低，以致酶活力降低。隨誘導時間的延長，蛋白表達量增加，但同時可能導致目的蛋白降解及菌體老化，使其得率下降，導致酶活力降低。

2.4 正交設計試驗優(yōu)化Str3p酶活力結(jié)果

表2 最適誘導條件優(yōu)化正交試驗設計與結(jié)果Table 2 Design matrix and experimental data for optimization of ITPG-induced expression of Str3p

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇對E. coliBL21（pEASYE1-Str3）蛋白表達量影響較大的3 個因素，IPTG濃度（A）、誘導溫度（B）和誘導時間（C），采用L9（33）正交表進行正交設計試驗，其結(jié)果見表2。

由表2可知，3 個因素條件對Str3p表達量的影響大小依次為IPTG濃度＞誘導溫度＞誘導時間，最優(yōu)誘導條件為A2B2C3，即IPTG濃度0.5 mmol/L、誘導溫度20 ℃、誘導時間13 h。按照優(yōu)化誘導條件進行3 次平行驗證實驗，Str3p最高表達量為1.26 mg/mL，與未優(yōu)化時的表達量（0.89 mg/mL）相比，正交試驗優(yōu)化使得Str3p表達量提高41.7%，且在該條件下酶活力較優(yōu)化前提高38.6%，明顯提高Str3p的表達量及其酶活力，滿足后續(xù)催化實驗需求。

2.5 反應液揮發(fā)性成分分析

圖7 糠醛（A，5.29 min）和糠硫醇（B，6.52 min）氣相色譜-質(zhì)譜全掃描質(zhì)譜圖[11]Fig. 7 Full-scan MS spectra recorded at 5.29 min for furfural (A) and at 6.52 min for 2-furfurylthiol (B)

如圖7所示，GC-MS分析發(fā)現(xiàn)一個保留時間為5.29 min的目標化合物，其離子流圖顯示特征離子為m/z95和96，另一個化合物在保留時間為6.52 min處顯示的特征離子為m/z53、81和114，這與NIST譜庫中糠醛和糠硫醇的特征離子m/z相匹配。

圖8 糠醛和糠硫醇選擇離子掃描EIC圖Fig. 8 Comparison of GC-MS/MS chromatograms recorded for furfural and 2-furfurylthiol

通過考察標準品的出峰情況，同樣在相同的保留時間檢出上述特征離子，說明反應液中存在這2 種物質(zhì)。從圖8A可以看出，7.4 mmol/L糠醛和49.5 μmol/L糠硫醇的特征離子對分別在5.29 min和6.52 min出峰，圖8B是Str3p催化反應液的出峰情況，其定性離子對與標準品出峰保留時間一致，一方面說明定性結(jié)果準確可靠，另一方面證實催化反應生成糠硫醇。

2.6 Str3p催化裂解半胱氨酸-糠醛加合物

前期研究工作確認釀酒酵母中Str3基因是糠硫醇合成中的關鍵基因[12]，但還需進一步驗證其功能。通過異源表達所得的重組蛋白Str3p，其催化生成糠硫醇情況如圖9所示，Str3p酶活力受pH值影響較大（P＜0.05），隨著pH值的升高，催化效率逐漸增加，當pH 8.0時，催化效率達到最大，在底物濃度10 mmol/L、50 μg/mL的Str3p 1 h能催化產(chǎn)生47 μmol/L的糠硫醇。有學者發(fā)現(xiàn)細菌來源的C—Sβ裂解酶能催化合成硫醇類物質(zhì)[16,22-24]，其轉(zhuǎn)化率普遍較低。Holt等[20]報道葡萄酒釀造過程中釀酒酵母V13來源的Str3p能夠催化裂解半胱氨酸加合物（Cys-3MH，Cys-4MMP），生成12.3 μmol/L 4MMP和2.1 μmol/L 3MH，該酶在pH7.0時，4MMP的產(chǎn)量為pH 7.5時的47%。本研究中重組Str3p的糠硫醇產(chǎn)量在pH 8.0時較pH 7.0提高了近2.7 倍，說明偏堿性條件有利于催化反應的進行。

圖9 不同pH值條件下糠硫醇產(chǎn)量Fig. 9 Production of 2-furfurylthiol at different pH levels

野生釀酒酵母G20中胱硫醚β-裂解酶經(jīng)異源表達純化，能夠催化裂解半胱氨酸-糠醛加合物生成糠硫醇，進一步明確Str3基因在糠硫醇合成代謝中的作用。多項研究認為，由半胱氨酸加合物（Cys-3MH和Cys-4MMP）生物轉(zhuǎn)化生成3MH和4MMP的量很低（0.1%～10%）[2,19,25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)在實驗室模擬條件下硫醇類物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化率（低于1%）明顯低于真實發(fā)酵環(huán)境（最高達11%）。由于較低轉(zhuǎn)化率和酵母菌對Cys-thiol的間接催化作用，很可能促使大量的前體物質(zhì)被分解，并作為氮源、碳源或硫源等被機體所利用，這也與前期所發(fā)現(xiàn)的結(jié)論基本一致，在發(fā)酵或體外催化實驗中，有大量糠醛、糠醇（糠醛被還原，僅在發(fā)酵體系下檢測到）生成[12]。因此，對于糠硫醇生物合成分子機制，需要繼續(xù)挖掘具有高效轉(zhuǎn)化功能的酵母菌株，加強開發(fā)體系中這些未被利用的前體物質(zhì)，以提升白酒及相關發(fā)酵食品特征風味。

3 結(jié) 論

通過基因工程技術(shù)構(gòu)建高效表達Str3p的工程菌E. coli BL21（pEASY-E1-Str3），正交設計試驗優(yōu)化其蛋白誘導條件，并以半胱氨酸-糠醛加合物為底物，驗證Str3p的催化作用。研究發(fā)現(xiàn)在誘導劑IPTG濃度0.5 mmol/L、誘導溫度20 ℃、誘導時間13 h時，重組Str3p質(zhì)量濃度為1.26 mg/mL，蛋白表達量和酶活力較優(yōu)化前分別提高41.7%和38.6%；純化后Str3p受反應pH值條件影響較大，在pH 8.0時，能夠催化裂解半胱氨酸-糠醛加合物（10 mmol/L）生成47 μmol/L糠硫醇。該研究結(jié)果將為天然硫醇類香料綠色制造、發(fā)酵食品特征風味形成提供理論支持和技術(shù)指導。