(陜西學前師范學院生命科學與食品工程學院,陜西西安 710100)

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)是杜仲科杜仲屬多年生落葉喬木,為我國特有的珍貴二類保護物種[1],種植范圍廣泛,主要分布在湖南、廣西、貴州、四川、陜西等地[2],具有清肝明目、壯陽補腎、調整血壓、抗疲勞、提高免疫力、延緩衰老等功效,作為一種中藥上品在中國已有2000多年歷史[3-4]。然而,目前對杜仲的開發(fā)利用并不全面,多只局限于杜仲皮和杜仲膠,其中,杜仲皮從古至今一直在中醫(yī)領域發(fā)揮著重要作用,杜仲膠也因其具有優(yōu)異的橡塑二重性,作為一種天然橡膠被廣泛應用于各個行業(yè)領域[5-7],在國內外擁有極大的產(chǎn)業(yè)覆蓋面[8-9],而相比于這兩者,資源更為豐富的杜仲樹葉卻一直缺乏有效的加工利用。研究表明,杜仲葉與皮有相似的化學成分和藥理作用[10-11],但在杜仲不同部位中的總黃酮含量有很大差別,以杜仲葉(尤其是老葉)中的總黃酮含量最高,若對其進行提取利用,不僅可以彌補傳統(tǒng)藥源的不足[12-14],還可以把天然的杜仲葉黃酮應用到各個領域,尤其是食品加工領域。利用杜仲葉及其黃酮提取物多種突出的生物活性,將其作為一種良好的保健品原料和添加劑,開發(fā)出營養(yǎng)與保健價值較高的功能性產(chǎn)品,這對食品行業(yè)的發(fā)展將起到積極的推動作用。本文對目前國內杜仲葉黃酮的提取方法以及近年來杜仲葉黃酮生物活性和機理所做的相關研究進行綜述,以期為杜仲葉資源的深度綜合開發(fā)利用奠定一定的理論基礎。

1 杜仲葉黃酮的提取方法

目前,黃酮類的提取方法主要有水提法、溶劑法、超聲波提取法、微波提取法、超臨界CO2萃取法、酶解法和半仿生提取法。

1.1 水提法

水提法是將杜仲葉粉碎后,按一定的料液比浸入水中,在適宜的溫度下浸提一定時間,從而得到含有杜仲葉有效成分浸提液的一種方法。何德飛[15]發(fā)現(xiàn),水提法所選用的料液比和提取時間對杜仲葉中的有效成分提取有顯著影響,當料液比為1∶16、提取時間24 h時,杜仲葉中的有效成分含量最高。董興葉等[16]以杜仲葉為原料,采用亞臨界水萃取杜仲葉黃酮類化合物,通過單因素實驗及正交試驗確定最優(yōu)工藝條件,結果表明,亞臨界水萃取的最優(yōu)條件為:提取溫度120 ℃、提取時間30 min、料水比1∶25 (g/mL)、壓力1.0 MPa,此條件下黃酮類化合物得率可達3.09%±0.06%。亞臨界水萃取法是在一定的壓力下,將水加熱到100～374 ℃(水仍然保持液體狀態(tài))對黃酮進行提取,該方法相較于傳統(tǒng)水提法,能夠大幅度縮短提取時間,并提高黃酮類化合物的得率,更適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

1.2 溶劑法

杜仲葉黃酮不但易溶于水,還易溶于乙醇、甲醇、乙醚等有機溶劑。董娟娥等[17]對提高杜仲葉中主要活性物質的提取率進行了研究,發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物的最佳提取條件為:以60%乙醇-水混合溶劑在80 ℃下提取3次,每次30 min。葉文峰等[18]通過單因素實驗及正交試驗探討了乙醇為溶劑提取杜仲葉總黃酮的最佳提取工藝條件,發(fā)現(xiàn)用70%乙醇、料液比為1∶10條件下提取3次,每次回流1.5 h,杜仲葉總黃酮的提取效果最好,回收率可達103.1%。趙文紅等[19]分別探究了乙醇濃度、提取溫度、提取時間等因素在杜仲葉總黃酮提取中的影響趨勢,并以正交實驗確定了以12倍量的50%乙醇,在80 ℃條件下回流提取60 min為最佳提取條件,總黃酮得率達3.08%,占固體提取物的31.9%。劉軍海等[20]以丙酮-水為溶劑對杜仲葉黃酮的提取工藝進行了研究,結果表明,提取溫度65 ℃、丙酮濃度50%、料液比1∶16、提取時間2 h、浸提2次時,總黃酮提取物得率為17.01%,黃酮含量10.96%。綜合這些研究結果可以看出,用溶劑法提取杜仲葉黃酮對于提取溫度要求較低,提取時間較短,但由于要大量使用有機溶劑,因此該方法更適合小規(guī)模提取。

1.3 超聲提取法

超聲提取法是在溶劑提取的基礎上,利用超聲作用使原料的細胞壁加速破裂,有效成分更快溶解進入溶劑的方法。郭孝武[21]探討了超聲提取杜仲葉黃酮的最佳工藝,發(fā)現(xiàn)采用體積比為40%、料液比1∶60的乙醇水溶液浸泡24 h,再用超聲提取45 min,杜仲葉中總黃酮類物質的提出率可達25.43%。路博瓊等[22]發(fā)現(xiàn),在50%乙醇作為溶劑時,料液比1∶10 (g/mL),60 ℃下超聲提取50 min,杜仲葉黃酮提取物含量較高。羅飛華等[23]通過單因素和正交試驗得出了杜仲葉總黃酮的最佳提取工藝條件為:料液比1∶14 (g/mL)、乙醇體積分數(shù)50%、超聲時間20 min。許先猛等[24]發(fā)現(xiàn),超聲功率600 W、時間30 min、乙醇濃度60%、料液比1∶15(g/mL)的條件下黃酮得率最高能達到2.04%。陶亮亮等[25]發(fā)現(xiàn),提取杜仲葉黃酮的最佳工藝條件是乙醇濃度65%、料液比為1∶25、超聲時間和溫度分別為35 min和65 ℃,黃酮含量可達2.28%。超聲輔助提取法對提取液不斷的振蕩對于有效成分的擴散和溶出有極大的促進作用,能大幅縮短單純用溶劑提取的時間,降低提取溫度,提高黃酮的提取率,具有節(jié)能、省時、操作簡便等優(yōu)點。但是由于超聲波在傳播過程中會發(fā)生衰減,作用區(qū)域有限,因而對提取罐的直徑大小有限制,對于振子和罐體的配合度要求也較高,因此目前在工業(yè)化生產(chǎn)應用當中,該方法還存在一定的局限性。

1.4 微波提取法

微波提取法是利用微波的能量加快原料分子的熱運動,從而加速破壞細胞壁使有效成分更快提取出來的方法。目前,微波提取法在植物黃酮類物質的提取領域有比較廣泛的應用。呂強等[26]對杜仲葉用不同方式進行干燥處理后提取,結果表明,經(jīng)微波處理后的葉片中總黃酮的質量分數(shù)為7.005%,是曬干處理的1.52倍,并且微波殺青后50 ℃烘干處理杜仲葉能夠有效減少活性成分的損失。李旭等[27]用響應面曲線法對杜仲葉黃酮的微波提取工藝進行了優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)在杜仲葉粉碎顆粒度100目,料液比1∶60 (mL/g),乙醇濃度67%(v/v),微波功率757 W下提取5.3 min,黃酮的得率最高。劉桂萍等[28]發(fā)現(xiàn),微波輔助水提取杜仲葉總黃酮的最佳工藝條件為料液比1∶25 (g/mL),微波功率320 W,提取時間2.5 min,總黃酮提取率可達8.7%。該方法作為一種新型提取工藝,其最大的特點就是能選擇性的促使極性分子加速溶出,控制方便、升溫速度快,能大幅縮短提取時間,在杜仲葉黃酮工業(yè)化提取中有明顯優(yōu)勢,生產(chǎn)線組成簡單,溶劑選擇方面要求較低,具有無污染、低投資的優(yōu)點,然而該方法對于一些非極性物質的提取效果并不理想。

1.5 超臨界CO2萃取法

雖然溶劑提取法提取杜仲葉黃酮的得率較高,被廣泛應用,但其存在回收溶劑、對提取溫度要求較高等缺陷,相比而言,超臨界CO2萃取法以高于臨界壓力和溫度狀態(tài)下的溶劑,對有效成分進行提取,使細胞壁破碎后釋放溶解出更多的有效成分,具有提取效率高、溫度要求低、溶劑無殘留并能循環(huán)利用的優(yōu)點[29]。李加興等[30]采用單因素實驗和正交試驗對杜仲葉黃酮類化合物的最佳萃取工藝條件進行優(yōu)化,結果表明,添加濃度為80%(v/v)的乙醇水溶液3.5 mL/g 作夾帶劑時,最佳萃取條件為:萃取溫度40 ℃、萃取壓力25 MPa、萃取時間2.5 h、CO2流速200 kg/h,然后將萃取物加1∶3 (v∶v)的乙醚分離出黃酮類化合物,得率可達2.032%(w/w)。李秋紅等[31]確定了超臨界CO2萃取杜仲葉總黃酮的最佳工藝條件為:溫度為45 ℃、時間為2.5 h、壓力為30 MPa、夾帶劑用量為3.5 mL/g,該條件下黃酮提取率為73.26%,產(chǎn)品純度為19.82%。王華芳等[32-33]發(fā)現(xiàn),提取工藝條件為溫度50 ℃,壓強30 MPa,時間120 min時,杜仲葉黃酮的提取率可達10.55%,此外,采用響應面優(yōu)化法進一步對杜仲葉黃酮的提取工藝進行探究,發(fā)現(xiàn)溫度51 ℃,壓強31.15 MPa,時間90 min,所得總黃酮的含量為45.82 mg/g。綜上可知,超臨界CO2萃取法在低溫條件下進行,能夠有效防止沸點低、易揮發(fā)的物質在提取過程中的損失,不但操作條件溫和,而且提取率較高。由于CO2性質穩(wěn)定、無毒、對環(huán)境無污染,因此超臨界CO2萃取法非常適合用于食品行業(yè)大規(guī)模有效成分的提取和純化,在工業(yè)化生產(chǎn)中萃取壓力、溫度、萃取顆粒大小、CO2流量、夾帶劑的合理選擇問題,都是決定提取效果的關鍵因素。

1.6 酶解法

酶解法提取是一種使用適合的酶處理原材料,使組成細胞的纖維素、半纖維素、果膠等物質結構破除,便于后續(xù)提取中有效成分在更短時間內溶出的方法[34]。羅季陽等[35]通過試驗確定了纖維素酶是提取杜仲葉活性成分的一種有效酶,在pH4.5,溫度55 ℃,加酶量0.01%的條件下提取2.5 h時,杜仲葉活性成分的提取率較高。酶解法提取具有選擇性高、反應條件溫和的特點,提取效率高,節(jié)約能耗的同時,能夠使有效成分快速溶解,在成分復雜的中藥材提取方面具有重大的應用意義[36]。

1.7 半仿生提取法

半仿生提取法是將原料提取液制成藥物制劑,在選定的pH下,模擬藥物在胃腸道內的消化轉運吸收過程,根據(jù)生物藥劑學角度而設計出的提取工藝[37]。陳曉娟等[38]以杜仲葉為原料,以磷酸氫二鈉-檸檬酸的緩沖溶液作為提取液,用果膠酶酶解2 h后,升溫回流提取,黃酮得率達0.043%。鄧佑林等[39]研究了半仿生法及超聲輔助半仿生法提取杜仲葉黃酮的條件,結果表明,半仿生法在提取時間1.5 h,提取溫度60 ℃,料液比1∶20 (g/mL)時,黃酮提取率高達325.0 mg/g;超聲波輔助法提取的最佳條件為時間50 min,溫度65 ℃,料液比1∶40 (g/mL),黃酮提取率為264.4 mg/g。超聲波輔助提取能使提取時間大為縮短,但黃酮的提取率卻比半仿生法低。半仿生提取法的特點是提取過程符合口服藥物在胃腸道的轉運特點,最大限度地將有效成分提取出來并且活性損失較少,尤其是結合酶的作用,不僅能使混合物充分發(fā)揮其綜合作用,又能利用單體成分控制質量,因此,該方法在中藥的有效成分提取和配方研究中有良好優(yōu)勢和廣泛的應用前景[40],只是目前在該領域中,半仿生提取法仍沿襲傳統(tǒng)的高溫煎煮方式,容易破壞藥效,有效成分損失較多。

2 杜仲葉黃酮的生物活性

2.1 抗氧化活性

抗氧化是黃酮類化合物的一大特性,關于杜仲葉黃酮是否具有較強的抗氧化活性,有學者進行了以下的研究。李旭等[41]利用微波輔助提取工藝從杜仲葉中提取出總黃酮,探究其對DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除作用,發(fā)現(xiàn)清除自由基能力明顯高于VC,表明杜仲葉黃酮具有較強的體外抗氧化活性。羅飛華等[42]研究發(fā)現(xiàn),杜仲葉黃酮提取物具有較好的還原能力,同時對超氧陰離子有較強的清除作用,且隨著黃酮添加量的增大活性增強。此外,賈征等[43-44]對杜仲葉黃酮進行提取并測定了體外抗氧化能力,研究表明,杜仲葉黃酮對羥自由基、超氧陰離子均有較強的清除作用,對紅細胞溶血和脂質過氧化有明顯的抑制作用,而且隨著黃酮添加量的增大而增大,是一種天然有效的抗氧化劑。Lin等[45]對其抗氧化活性的分子機制做了深入研究,發(fā)現(xiàn)對大鼠成骨細胞MC3T3-E1細胞的存活率和凋亡率有劑量依賴性地提高,使Caspase-3/6/7/9的蛋白表達量顯著降低。以上研究表明,杜仲葉黃酮抗氧化作用的機理在于清除自由基,對MDA、SOD和GSH-PX等酶在大鼠體內的作用產(chǎn)生影響,減緩脂質過氧化反應程度,并通過多種細胞保護作用發(fā)揮抗氧化活性。

2.2 抗疲勞活性

2.3 降血糖活性

由于杜仲葉的次生代謝產(chǎn)物能夠阻礙和延緩葡萄糖的吸收,因此杜仲葉具有良好的降血糖功效。Xin等[50]用大鼠建立糖尿病模型,發(fā)現(xiàn)杜仲葉提取物能對高血糖大鼠體內的胰島素發(fā)揮長效的積極作用。刑冬杰等[51]研究了杜仲葉黃酮對糖尿病大鼠血糖控制及胰島細胞的保護作用,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,杜仲葉黃酮處理組能明顯降低糖尿病大鼠胰腺組織中MDA水平、提高SOD及GSH-Px水平,并能降低大鼠的FBG,改善糖耐量,提高FINS水平,胰島面積增加,細胞數(shù)明顯增多。Lee等[52]發(fā)現(xiàn),杜仲葉提取物降血糖的同時,能增加血漿中胰島素和C肽的表達,使糖尿病大鼠胰腺β細胞的功能增強。以上結果表明,杜仲葉黃酮可顯著降低血糖,改善糖耐量,其機制之一是能增加FINS水平,降低氧化應激反應,對胰島細胞具有保護作用。

2.4 降血脂活性

中醫(yī)認為,杜仲葉不但能護肝保腎,還能降低血脂、減少中性脂肪形成,對于發(fā)揮降血脂作用的主要功效成分和相關分子機制,相關學者已經(jīng)進行了研究。劉靜等[53]對杜仲葉黃酮的降血脂作用進行了研究,發(fā)現(xiàn)杜仲葉黃酮能降低營養(yǎng)性高脂血癥小鼠的血脂,還具有抗氧化作用。雷燕妮等[54]采用微波法提取杜仲葉黃酮,并用其在高血脂動物模型上進行試驗,發(fā)現(xiàn)杜仲葉黃酮具有良好的降血脂作用。兩項研究中,杜仲葉總黃酮都能使高血脂大鼠血清中的總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的含量顯著降低,顯著升高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的含量,從而有良好的降血脂活性,Choi等[55]探究了杜仲葉提取物對高血脂癥金黃地鼠的降脂作用及機制,發(fā)現(xiàn)其能顯著降低TG、TC、LDL-C和游離脂肪酸的含量,反之提高HDL-C的比例和載脂蛋白A-I的水平,血漿中總膽固醇濃度與肝內HMG-CoA還原酶緊密相關,杜仲葉總黃酮參與調控膽固醇代謝通路是其分子機制之一。

3 杜仲葉應用現(xiàn)狀及前景展望

2011年4月,國家發(fā)改委發(fā)布的“產(chǎn)業(yè)結構調整目錄”中首次將“杜仲種植生產(chǎn)”列入鼓勵類目錄中,并啟動了杜仲綜合利用示范基地的培育工作。作為陜西省秦巴山區(qū)豐富的優(yōu)勢資源,杜仲也被列入了陜南循環(huán)經(jīng)濟產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃(2009～2020年)需推廣規(guī)范化種植的藥材藥源中,亟待全面開發(fā)。

目前杜仲皮、杜仲膠的加工技術已經(jīng)趨于成熟,而大量的杜仲樹葉卻未得到合理開發(fā)利用。長期以來杜仲葉用途單一,主要用來給家禽家畜做功能飼料[56],造成了資源浪費。筆者認為,對于杜仲葉資源的深度開發(fā),未來有兩個方向的趨勢。第一,將杜仲葉中的有效活性成分進行提取分離后,再把樹葉殘渣做成動物飼料等進行二次利用。以本文綜述的杜仲葉黃酮為例,杜仲葉中黃酮含量高,提取方法多樣,并且具有良好的生物活性,可作為一種很好的天然植物黃酮來源。以此類推,從杜仲葉中可提取利用的還有諸如咖啡酸、綠原酸、桃葉珊瑚甙等多種活性物質,這樣既發(fā)揮了杜仲葉所含有的這些功能性成分的優(yōu)勢,又對葉子進行了充分利用,是未來杜仲葉開發(fā)的一大趨勢。第二,將杜仲葉作為原料研發(fā)成具有保健功能的產(chǎn)品,例如杜仲茶,杜仲固、液體飲料等。在大健康產(chǎn)業(yè)發(fā)展空間日益擴大的今天,純天然的植物保健產(chǎn)品將會面臨無限的機遇和挑戰(zhàn),對于杜仲這種還不被人們熟知的資源,若能利用其良好的功效性,成功研發(fā)出一款產(chǎn)品,將會對人類的健康產(chǎn)生莫大的裨益,對大健康產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起到一定的推動作用,相信這會是杜仲葉開發(fā)的又一大趨勢。

同時,杜仲葉資源的開發(fā),還將有效促進杜仲林的種植與保護,保護環(huán)境的同時提高自然資源利用率,有利于當?shù)剞r民增收致富,帶動種植運輸?shù)刃袠I(yè)發(fā)展,產(chǎn)生顯著的環(huán)境效益、社會效益和經(jīng)濟效益。