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(北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心,北京 100041)

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露,與自身分泌物混合后,經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)[1]。蜂蜜富含多種營養(yǎng)物質(zhì),具有很好的保健效果及藥用價(jià)值[2]。國家標(biāo)準(zhǔn)中明確規(guī)定蜂蜜是天然物質(zhì),不允許人為加入任何物質(zhì),如防腐劑、甜味劑等。但在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下,蜂蜜摻假的問題由來已久,從最初的蔗糖、淀粉、飴糖摻假到后來玉米糖漿、高果糖玉米糖漿、轉(zhuǎn)化糖漿和大米糖漿摻假[3-4],摻雜物越來越隱形、越來越難以辨別。此外,在高品質(zhì)蜂蜜中加入其它低品質(zhì)的蜂蜜,以次充好的現(xiàn)象也屢禁不止[5]。目前,蜂蜜品質(zhì)的國標(biāo)檢測方法包括感官鑒別、理化鑒別[1]、薄層色譜法(TLC)[6]、穩(wěn)定性碳同位素比率法[7]、高效液相色譜法(HPLC)[8]等。此外,光譜分析技術(shù)、差示掃描量熱分析、顯微鏡檢測技術(shù)等[9-11]現(xiàn)代分析技術(shù)也被應(yīng)用于蜂蜜的摻假鑒別的問題中,這些方法都存在各自的缺點(diǎn),且適用范圍有限[12]。蜂蜜成分復(fù)雜,其成分組成受植物源、產(chǎn)地、成熟程度等多方面因素的影響,僅依靠單一或是幾種化學(xué)成分的被動(dòng)檢測,難以解決蜂蜜摻假和品質(zhì)鑒定的問題,需采用非靶向的分析方法和整體的研究思路。

核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)是鑒定有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)極為重要的手段,具有前處理簡單、重現(xiàn)性好、操作簡便、結(jié)構(gòu)信息豐富等優(yōu)點(diǎn),非常適合對(duì)蜂蜜等食品復(fù)雜體系的整體分析[13-15]。NMR結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法,不僅能從模式識(shí)別的角度對(duì)食品品質(zhì)進(jìn)行分類分析,還能進(jìn)一步尋找出引起品質(zhì)差別的化學(xué)物質(zhì),從根本上打擊摻假行為[16]。Spiteri等[17]采用1H-NMR結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法,對(duì)麥盧卡蜂蜜和產(chǎn)地同為大洋洲的其他種類的蜂蜜進(jìn)行了區(qū)分,并尋找到麥盧卡蜂蜜的標(biāo)志性成分;Boffo等[18]采用多種NMR方法對(duì)巴西蜂蜜的成分進(jìn)行了分析,并結(jié)合1H-NMR和化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法對(duì)不同種類的蜂蜜進(jìn)行了分類鑒別研究,并找出相應(yīng)種類蜂蜜的標(biāo)志性成分。陳雷等[19]也采用NMR結(jié)合正交偏最小二乘的方法對(duì)油菜蜜中果葡糖漿摻假進(jìn)行了辨別研究;劉蕓等[20]采用NMR結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法建立了OPLS-DA模型用于蜂蜜的摻假鑒別,并初步尋找出區(qū)分摻假蜂蜜有顯著作用的標(biāo)志信號(hào),但并未對(duì)此類信號(hào)進(jìn)行定性分析。

本研究采用1H-NMR及多種2D-NMR技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析的代謝組學(xué)方法對(duì)質(zhì)監(jiān)部門提供的國內(nèi)不同產(chǎn)地、不同蜜源的真假蜂蜜真實(shí)樣品進(jìn)行了全面分析。對(duì)蜂蜜1H-NMR圖譜中多種小分子有機(jī)物信號(hào)進(jìn)行了歸屬,特別是對(duì)信號(hào)眾多、化學(xué)位移相近的糖類化合物。本研究采用J-分辨結(jié)合CSSF-TOCSY的方法,對(duì)多種糖類化合物進(jìn)行信號(hào)歸屬。在鑒別摻假蜂蜜的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步通過相關(guān)系數(shù)負(fù)載圖法尋找真蜂蜜和摻假蜂蜜樣品的差異物質(zhì),對(duì)未來蜂蜜市場上蜂蜜的質(zhì)量控制,規(guī)范蜂蜜的市場秩序具有重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

47個(gè)真蜂蜜樣品(品種包括:洋槐蜜、椴樹蜜、枇杷蜜、荊條蜜、混合花蜜、紫云英蜜、棗花蜜)和49 個(gè)摻假蜂蜜 經(jīng)國內(nèi)四家實(shí)驗(yàn)室檢測判定其真?zhèn)?國家質(zhì)檢總局蜂蜜摻假專項(xiàng);重水(氘代度:99.8%,D2O) 美國CIL公司;3-(三甲基硅基)氘代丙酸鈉(純度、氘代度:98.00%,TMSP) 美國CIL公司;5 mm核磁管 美國Norell公司;松二糖、蔗糖等標(biāo)準(zhǔn)品(純度98.00%) 美國SIGMA公司。

Bruker AVANCE 600MHZ超導(dǎo)傅立葉變換核磁共振儀(配有CPBBO探頭,Topspin 3.2處理軟件及60 位自動(dòng)進(jìn)樣器) 瑞士Bruker公司;BT PH調(diào)節(jié)器 瑞士Bruker公司;XS204電子天平 瑞士Mettler Toledo公司;Centrifuge 5424R離心機(jī) 德國Eppendorf公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品溶液的制備 稱取待測蜂蜜樣品1.0 g于離心管中,加入純凈水5 mL,渦旋2 min,超聲(20 kHz)10 min后,10000 r/min離心10 min。取900 μL離心上清液于2 mL EP管中,加入100 μL D2O(含有1 mol/L KH2PO4和0.1%TMSP),混勻后用NaOH(或HCl)調(diào)節(jié)溶液pH=3.10。取調(diào)節(jié)好pH的液體600 μL于5 mm核磁管中,配制好的樣品放置于4 ℃冰箱內(nèi)保存,測試時(shí)室溫25 ℃平衡30 min后上機(jī)檢測。

1.2.2 樣品測定及圖譜處理 儀器條件:NMR儀1H載波頻率為600.13 MHz,采用Bruker標(biāo)準(zhǔn)脈沖noesypr1d,檢測溫度為298 K,1H的90 °脈沖寬度為11.90 μs,譜寬為9014.42 Hz,中心頻率為2820.01 Hz,脈沖延遲時(shí)間為4 s,掃描次數(shù)為64,空掃次數(shù)為4[9]。測得的1H-NMR譜使用Bruker Topspin3.2軟件處理,變換點(diǎn)數(shù)為64 K,線寬因子1.00 Hz,用指數(shù)窗函數(shù)處理,基線和相位校正均采用手動(dòng)方式進(jìn)行,TMSP為內(nèi)標(biāo)信號(hào)(0.00)[9,17]。

1.2.3 蜂蜜1H-NMR圖譜信號(hào)歸屬實(shí)驗(yàn) 隨機(jī)抽取47種真蜂蜜中洋槐的一種按照1.2.2步驟進(jìn)行樣品制備,按照1.2.1上機(jī)。經(jīng)過調(diào)整儀器參數(shù)、調(diào)諧、控溫、勻場、采樣及傅里葉變換,得到1H-NMR全圖譜。采用1H-NMR、J-分辨、HMBC(Heteronuclear Multiple Bond Correlation)、HSQC(Heteronuclear Singular Quantum Correlation)、CSSF-TOCSY(Chemical-Shift-Selective Filter-Total Correlation Spectroscopy)等技術(shù),結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品及文獻(xiàn)報(bào)道[21-23],對(duì)蜂蜜樣品中成分的1H-NMR信號(hào)進(jìn)行歸屬。

1.2.4 NMR定量 以TMSP為定量內(nèi)標(biāo),采用核磁定量內(nèi)標(biāo)法對(duì)47個(gè)真蜂蜜和49個(gè)假蜂蜜樣本進(jìn)行定量測定[13]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化:處理后的圖譜用MestReNova 6.0.1(Spain)軟件,以δ 0.005積分段對(duì)化學(xué)位移區(qū)間δ 0.40～11.00進(jìn)行分段積分并進(jìn)行面積歸一化處理,處理后數(shù)據(jù)存為Excel形式。

化學(xué)計(jì)量學(xué)分析:將上述所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-p 11.0(Umetrics,umea,Sweden)軟件進(jìn)行主成分分析(principal componentanalysis,PCA)和正交偏最小二乘法-判別分析(orthogonal partial leastsquares-discriminate analysis,OPLS-DA)。OPLS-DA模型采用交叉驗(yàn)證Q2值、排列檢驗(yàn)對(duì)判別分析所建立的模型進(jìn)行評(píng)判。

差異物質(zhì)分析:對(duì)于成立的OPLS-DA模型,在對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回溯轉(zhuǎn)換后用Matlab(V7.0.4,Mathworks Inc.,U S A.)軟件進(jìn)一步繪制針對(duì)每個(gè)變量的皮爾森相關(guān)系數(shù)負(fù)載圖找出組間有顯著性差異的化學(xué)成分,通過查閱相關(guān)系數(shù)表,確定相關(guān)系數(shù)│r│大于0.28作為臨界值(p<0.05),小于此系數(shù)忽略不計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂蜜1H-NMR圖譜指認(rèn)

如圖1所示,真洋槐蜂蜜中存在7 個(gè)有機(jī)酸(乳酸、丙氨酸、脯氨酸、檸檬酸、酪氨酸、苯基丙氨酸、甲酸),15個(gè)糖類(果糖、葡萄糖、異麥芽糖、異麥芽三塘、棉子糖、蜜二糖、麥芽酮糖、松二糖、黑曲霉二糖、麥芽三糖、潘糖、吡喃葡萄糖基蔗糖、1-蔗果三糖、曲二糖、松三糖)和2個(gè)其他類物質(zhì)(乙醇、5-羥甲基糠醛)。

圖1 真蜂蜜(洋槐蜜)的1H-NMR圖譜Fig.1 1H-NMR spectra of the Acaci honey

糖類物質(zhì)的鑒定一直是代謝物歸屬的難點(diǎn),因?yàn)槠湫盘?hào)眾多、化學(xué)位移相近,并且與其它代謝物譜峰部分重疊[23]。為了能對(duì)這些糖類物質(zhì)的特征信號(hào)進(jìn)行準(zhǔn)確歸屬,本研究采用J-分辨結(jié)合CSSF-TOCSY的方法[13,16],并對(duì)信號(hào)進(jìn)行了確認(rèn)和歸屬,結(jié)果見表1。糖類為蜂蜜的主要成分,占蜂蜜干物質(zhì)含量的95%左右,主要包括單糖、二糖和三糖[16]。由于這些糖類的結(jié)構(gòu)相似,在水溶液中存在多種構(gòu)型,所以導(dǎo)致其在1H-NMR圖譜中的信號(hào)復(fù)雜,并且重疊嚴(yán)重。

表1 洋槐蜂蜜樣品1H-NMR圖譜信號(hào)歸屬(pH=3.10)Table 1 Characteristics of 1H-NMR observable signals in honey samples(pH=3.10)

2.2 真蜂蜜與摻假蜂蜜差異成分分析

2.2.1 PCA分析結(jié)果 圖2為真實(shí)蜂蜜和摻假蜂蜜1H-NMR圖譜的PCA分析圖。結(jié)果顯示,大部分樣品都在95%置信區(qū)間內(nèi),真實(shí)蜂蜜和摻假蜂蜜有一定的分離趨勢(shì),進(jìn)一步采用有監(jiān)督的模式識(shí)別對(duì)樣本進(jìn)行分析,找出可能的差異物質(zhì)。

2.2.2 OPLS-DA分析結(jié)果 OPLS-DA是有監(jiān)督的模式識(shí)別方法,它將PLS-DA與正交信號(hào)校正分析方法結(jié)合起來,過濾掉與分析矩陣中不相關(guān)的“噪音”變量,從而最大化的顯現(xiàn)不同組別的差異性。對(duì)真實(shí)蜂蜜和摻假蜂蜜的NMR圖譜進(jìn)行OPLS-DA數(shù)據(jù)分析,模型前兩個(gè)主成分的交叉驗(yàn)證Q2為78.7%。在此之后,通過排列實(shí)驗(yàn)隨機(jī)多次(n=200)改變分類變量Y的排列順序得到相應(yīng)不同的隨機(jī)Q2和R2值對(duì)模型有效性做進(jìn)一步的檢驗(yàn),如圖3所示。排列實(shí)驗(yàn)作為一種外部模型驗(yàn)證方法,主要用于驗(yàn)證模型的擬合度。通過隨機(jī)變化改變Y變量的順序,觀察在多次隨機(jī)排列Y變量的模型與原始模型Y變量模型之間的差異。

然后對(duì)隨機(jī)化產(chǎn)生的Q2和R2與原始積累的Q2和R2值之間做回歸曲線,所做回歸曲線的斜率越大,與縱軸的截距越小,提示模型的預(yù)測能力越好。以模型可預(yù)測指標(biāo)Q2并結(jié)合排列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果共同提示,真實(shí)蜂蜜組與摻假蜂蜜組所建模型成立,說明組間出現(xiàn)了顯著性差異。

圖4為真實(shí)蜂蜜與摻假蜂蜜的OPLS-DA模型得分圖,結(jié)果顯示,真實(shí)蜂蜜在第一主成分得分均小于0,而摻假蜂蜜的得分都大于0,在模型中真實(shí)蜂蜜與摻假蜂蜜能夠得到很好的區(qū)分。圖4中的R2X和R2Y表示的是模型中X和Y變量的平方和對(duì)數(shù)據(jù)的解釋程度,Q2表示的是模型的預(yù)測能力。模型中的R2X和R2Y分別為79.6%和84.8%,Q2值為78.7%,表明模型的解釋能力和預(yù)測能力均較好。通過回溯轉(zhuǎn)換得到表示模型中組間差別的相關(guān)系數(shù)負(fù)載圖,結(jié)果見圖5。通過相關(guān)系數(shù)負(fù)載圖顯示出的具有顯著性差異的信號(hào),進(jìn)一步通過多種NMR技術(shù)對(duì)真實(shí)蜂蜜和摻假蜂蜜的差異物質(zhì)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)解析,共解析出11個(gè)差異性成分,并對(duì)差異成分進(jìn)行了定量分析,結(jié)果見表2。

表2 真蜂蜜與摻假蜂蜜OPLS-DA組間差異化合物及其相關(guān)系數(shù)Table 2 Compounds with significant contributions to the discrimination between pure honey and adulterated honey

圖4 真實(shí)蜂蜜與摻假蜂蜜的OPLS-DA模型得分圖Fig.4 OPLS-DA score plots of pure honey and adulterated honey

圖5和表2顯示:真實(shí)蜂蜜組中的蘇氨酸、脯氨酸、松二糖、曲二糖、松三糖和苯基丙氨酸含量顯著高于摻假蜂蜜組,而2,3-丁二醇、乙偶姻、甘露糖、5-羥甲基糠醛和甲酸的含量顯著低于摻假蜂蜜組,表明這兩組蜂蜜比較具有顯著性差異(r>0.28,n=47,p<0.05)。同時(shí),真實(shí)蜂蜜和摻假蜂蜜樣品中的11種化合物含量測定結(jié)果也與相關(guān)系數(shù)的載荷圖結(jié)論一致。因此,可以看出上述11 種物質(zhì)的含量差異,影響著本研究中真實(shí)蜂蜜和摻假蜂蜜樣本核磁代謝組學(xué)的分類。

圖5 真蜂蜜與摻假蜂蜜的相關(guān)系數(shù)的載荷圖Fig.5 Loading plots of correlation coefficients for pure honey and adulterated honey注:1:2,3-丁二醇;2:蘇氨酸;3:乙偶姻;4:脯氨酸;5:松二糖;6:甘露糖; 7:曲二糖;8:松三糖;9:5-羥甲基糠醛;10:苯基丙氨酸;11:甲酸。

3 結(jié)論與討論

本研究在對(duì)蜂蜜的1H-NMR圖譜中24個(gè)物質(zhì)的質(zhì)子信號(hào)進(jìn)行了歸屬的基礎(chǔ)上,通過多元統(tǒng)計(jì)分析及相關(guān)系數(shù)負(fù)載圖法比較了真蜂蜜和摻假蜂蜜樣品的差異成分,并對(duì)差異性物質(zhì)進(jìn)行了定量測定。

結(jié)果表明,真蜂蜜組中的蘇氨酸、脯氨酸、松二糖、曲二糖、松三糖和苯基丙氨酸含量高于摻假蜂蜜組,而2,3-丁二醇、乙偶姻、甘露糖、5-羥甲基糠醛和甲酸的含量低于摻假蜂蜜組,并且都具有顯著性差異。

鑒別蜂蜜摻假的根本原理就是基于天然蜂蜜與摻假蜂蜜的差異,那么如何挖掘并放大天然蜂蜜與摻假蜂蜜之間的差異對(duì)于指導(dǎo)蜂蜜摻假鑒別具有重要的意義[4]。蜂蜜中氨基酸的主要來源是蜜源植物的花粉、花蜜及蜜蜂自身的分泌物,其種類和含量受蜜源植物影響,也與地理環(huán)境、氣候等有關(guān)。研究表明,脯氨酸是大多數(shù)蜂蜜中含量最高的氨基酸,但部分蜂蜜中苯丙氨酸是主要氨基酸,其含量要高于脯氨酸,除此之外,蘇氨酸在某些蜂蜜中的含量也較高[24]。松二糖、曲二糖、松三糖是蜂蜜中普遍存在的寡糖,由花蜜釀造的蜂蜜中松二糖較多,而由蜜露釀造的蜂蜜寡糖中松三糖含量更高。果葡糖漿等摻假糖漿是工業(yè)產(chǎn)物,其中一般不含有氨基酸及上述三種寡糖成分[25],因此,在糖漿摻假的蜂蜜中氨基酸、三種寡糖的含量應(yīng)呈現(xiàn)下降趨勢(shì),這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

甘露糖是一種單糖,有研究表明,部分新鮮天然蜂蜜中含有甘露糖,但含量較低,商品蜂蜜中較少含有甘露糖[26]。但果葡糖漿在生產(chǎn)過程中由于葡萄糖異構(gòu)酶和堿性環(huán)境的存在會(huì)導(dǎo)致甘露糖的產(chǎn)生,所占比例0.2%～1.5%。果葡糖漿摻假的蜂蜜中的甘露糖會(huì)因?yàn)樘菨{的加入,使甘露糖呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),這與代謝組學(xué)研究結(jié)果相符。目前,5-羥甲基糠醛可作為判斷蜂蜜摻假和新鮮程度的一個(gè)指標(biāo),我國供銷合作行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)要求蜂蜜中5-羥甲基糠醛含量不得高于40 mg/kg[27]。5-羥甲基糠醛是糖在高溫下脫去水分子而形成的,在制造糖漿的過程中,高溫使蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖、果糖,同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生羥甲基糠醛,因此糖漿中會(huì)含有5-羥甲基糠醛。一般情況下,新鮮蜂蜜中是不含有5-羥甲基糠醛的,但在儲(chǔ)存和加工過程中蜂蜜中的還原糖和含氮化合物發(fā)生美拉德反應(yīng),也會(huì)生成5-羥甲基糠醛。因此,不能單純通過測定羥甲基糠醛的含量來鑒定蜂蜜的真?zhèn)?。本研究結(jié)果中的定量數(shù)據(jù)也顯示,部分真實(shí)蜂蜜的羥甲基糠醛含量要高于部分摻假蜂蜜樣品。2,3-丁二醇、乙偶姻、甲酸均是蜂蜜中存在的揮發(fā)性小分子物質(zhì),其含量受蜂蜜的品種、產(chǎn)地、加工方式等多種因素的影響[28]。同時(shí),糖漿在微生物的作用下也會(huì)產(chǎn)生上述三種物質(zhì)[29]。本研究結(jié)果顯示,摻假蜂蜜組的2,3-丁二醇、乙偶姻、甲酸含量高于真實(shí)蜂蜜組。

目前,國內(nèi)研究者對(duì)蜂蜜1H-NMR圖譜中糖類成分的指認(rèn),主要集中在對(duì)果糖和葡萄糖的信號(hào)全歸屬。果糖和葡萄糖是蜂蜜中的主要糖類物質(zhì),占蜂蜜總糖份的85%～95%。早期的摻假方式是以蔗糖、飴糖、淀粉摻假,這種摻假會(huì)使蜂蜜中果糖和葡萄糖的含量發(fā)生改變。但現(xiàn)在多是以高果糖漿、果葡糖漿等摻入蜂蜜中,由于這些糖漿中果糖和葡萄糖的比例與蜂蜜中非常相似,用它們配制出的行業(yè)內(nèi)所謂的“指標(biāo)蜜”的果糖和葡萄糖的比例也與真實(shí)蜂蜜相差無幾。但糖漿和蜂蜜中的寡糖存在很大的區(qū)別,因此,在本研究中,采用J-分辨結(jié)合CSSF-TOCSY的方法對(duì)蜂蜜1H-NMR圖譜的多種寡糖類成分信號(hào)進(jìn)行了指認(rèn)歸屬,為尋找真?zhèn)畏涿鄄町愋猿煞值於▓?jiān)實(shí)基礎(chǔ),同時(shí)也為其他研究者在今后的蜂蜜真?zhèn)窝芯恐刑峁┛煽康臄?shù)據(jù)信息。