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(北京工商大學(xué)食品學(xué)院,北京 100048)

木聚糖是半纖維素中主要的碳水化合物,也是植物細(xì)胞壁最主要的多糖成分,它的結(jié)構(gòu)復(fù)雜多變,主鏈由多個(gè)木糖經(jīng)β-1,4-糖苷鍵連接而成,同時(shí)還含有多種不同取代基形成的支鏈[1]。因此,木聚糖的降解需要多種酶的協(xié)同作用,其中最核心的就是β-1,4-木聚糖酶,用于隨機(jī)性切斷木聚糖的主鏈。目前,β-1,4-木聚糖酶在食品、飼料、造紙及生物轉(zhuǎn)化等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用。隨著β-1,4-木聚糖酶研究的不斷深入,人們對(duì)一些更具獨(dú)特性能的β-1,4-木聚糖酶的需求也日益增多。

β-1,4-木聚糖酶廣泛分布于自然界,而其主要來源是細(xì)菌、放線菌及真菌等[2-3]微生物。其中,絲狀真菌憑借胞外酶分泌比例高、耐酸性能好等優(yōu)勢(shì)逐漸成為該酶工業(yè)化生產(chǎn)的首選菌種。曲霉一直是酶制劑工業(yè)化生產(chǎn)的主要菌種,也是β-1,4-木聚糖酶的重要生產(chǎn)菌種之一。至今,包括黑曲霉、煙曲霉、土曲霉、米曲霉和硫色曲霉等[1-2,4-5]多種曲霉均被發(fā)現(xiàn)具有產(chǎn)β-1,4-木聚糖酶的能力,但有關(guān)黃曲霉產(chǎn)β-1,4-木聚糖酶的報(bào)道還很少。黃曲霉作為酶制劑生產(chǎn)的重要菌種之一,具有獨(dú)特產(chǎn)酶特性,它能高效分泌纖維素酶、內(nèi)切葡聚糖酶、α-淀粉酶和β-葡萄糖苷酶等[6-8]。目前,關(guān)于黃曲霉β-1,4-木聚糖酶的報(bào)道主要集中于產(chǎn)酶能力的優(yōu)化及酶的分離純化[9-12]。在黃曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶工藝研究方面,更多的是采用固態(tài)發(fā)酵的方式來優(yōu)化菌株的產(chǎn)酶水平,而有關(guān)液態(tài)深層次發(fā)酵產(chǎn)酶的報(bào)道較少。國(guó)內(nèi),僅發(fā)現(xiàn)李科等[13]曾報(bào)道過黃曲霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)β-1,4-木聚糖酶的研究;國(guó)際上,Bharat等[14]及Pal等[15]都曾研究過黃曲霉液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)β-1,4-木聚糖酶,但其產(chǎn)酶水平均低于40.0 U/mL,產(chǎn)量偏低?？梢?目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于黃曲霉液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)β-1,4-木聚糖酶的能力提升等相關(guān)研究仍存在諸多不足,非常值得深入探討,這對(duì)于挖掘β-1,4-木聚糖酶的新資源具有重要意義。

本研究即以黃曲霉為出發(fā)菌株,旨在研究其液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)β-1,4-木聚糖酶的能力以及該酶的酶學(xué)特性，以期為黃曲霉發(fā)酵生產(chǎn)β-1,4-木聚糖酶及其應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

櫸木木聚糖(純度為95%) 英國(guó)Apollo Scientific公司;大麥葡聚糖、脫枝阿拉伯聚糖 愛爾蘭Megzyme公司;羧甲基微晶纖維素鈉(CMC) 中國(guó)Macklin公司;對(duì)硝基苯-β-D-吡喃木糖苷、鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷 美國(guó)Sigma公司;酵母提取物、胰蛋白胨 英國(guó)Oxoid公司;燕麥粉、大麥粉 北京永輝超市;玉米芯、小麥麩皮、玉米苞皮、稻殼、白酒酒糟、花生殼等 北京官園花鳥市場(chǎng);吐溫、曲拉通、SDS和其余試劑 中國(guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;黃曲霉(CICC. 2476,不產(chǎn)黃曲霉毒素) 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。

MJPS-150型霉菌培養(yǎng)箱 上海精宏有限公司;ZWF-100型搖床 上海智誠(chéng)分析有限公司;HH.S11-4型電熱恒溫水浴鍋 上海博訊醫(yī)療有限公司;TGL-20BR型高速冷凍臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;TU-1810PC型紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器設(shè)備有限責(zé)任公司;SDS-PAGE電泳儀 美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵產(chǎn)β-1,4-木聚糖酶 將黃曲霉劃線接種于PDA平板上,置于30 ℃下培養(yǎng)3～5 d,再將大小為1 cm2黃曲霉菌塊接種到含50 mL初始發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)4 d,然后在4 ℃條件下離心10 min(轉(zhuǎn)速為10000 r/min)取上清,測(cè)定上清液的β-1,4-木聚糖酶酶活力。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基為:2%玉米芯,1%胰蛋白胨,1%酵母提取物,0.5% NaCl,0.05% MgSO4·7H2O和0.075% KH2PO4,自然pH。

1.2.2 發(fā)酵產(chǎn)β-1,4-木聚糖酶條件的優(yōu)化 以β-1,4-木聚糖酶的酶活力為考察指標(biāo),采用單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化黃曲霉的產(chǎn)酶條件,其他固定因素水平均與1.2.1相同。首先考察碳源對(duì)黃曲霉產(chǎn)β-1,4-木聚糖酶的影響,包括碳源種類(玉米芯、麩皮、燕麥粉、大麥粉、稻草、玉米苞皮、白酒酒糟、花生殼、葡萄糖、木糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉和葡聚糖,添加量均為2.0%)和麩皮添加量(0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%和5.0%);接著考察氮源種類(胰蛋白胨、酵母提取物、蛋白胨、牛肉膏、大豆蛋白胨、豆粕粉、硫酸銨和磷酸氫二銨,添加量均為1.0%)及磷酸氫二銨添加量(0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%和5.0%)對(duì)產(chǎn)β-1,4-木聚糖酶的影響;之后考察表面活性劑種類(吐溫-20、吐溫-40、吐溫-60、吐溫-80、曲拉通-110、曲拉通-114和SDS,添加量均為0.5%)及吐溫-60添加量(0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%)對(duì)產(chǎn)β-1,4-木聚糖酶的影響。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵溫度(25～45 ℃,每隔5 ℃)和發(fā)酵時(shí)間(0、1、2、3、4、5、6和7 d)對(duì)產(chǎn)β-1,4-木聚糖酶水平的影響。

1.2.3β-1,4-木聚糖酶酶活力及蛋白含量的測(cè)定β-1,4-木聚糖酶活力測(cè)定參照Liu等[16]的方法:180 μL櫸木木聚糖(濃度為1.0%)底物在45 ℃下預(yù)熱3 min,加入20 μL適當(dāng)稀釋的β-1,4-木聚糖酶液并于45 ℃下反應(yīng)10 min,再加入200 μL的3,5-二硝基水楊酸(DNS)溶液后煮沸15 min顯色,最后加入200 μL飽和酒石酸鉀鈉溶液(濃度為40%),待冷卻后測(cè)定A540 nm值,以木糖為標(biāo)準(zhǔn)。β-1,4-木聚糖酶酶活力單位(U)定義為:在上述條件下每分鐘水解櫸木木聚糖生成1 μmol木糖所需的β-1,4-木聚糖酶量。

1.2.4 黃曲霉胞外β-1,4-木聚糖酶的鹽析分級(jí) 收集黃曲霉分泌的胞外β-1,4-木聚糖酶發(fā)酵液,在4 ℃條件下以10000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，收集發(fā)酵上清液。使用研缽將硫酸銨研碎成粉末,放置于105 ℃烘箱中烘干4 h以上待用。將裝有發(fā)酵上清液的燒杯放置于冰水浴中并保持低速旋轉(zhuǎn)(250 r/min),持續(xù)、緩慢地向其中添加預(yù)冷的硫酸銨粉末(確保上清液無泡沫、燒杯底部無沉積出現(xiàn))至硫酸銨的飽和度為20%,然后在4 ℃條件下,10000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min,分離上清液和沉淀,收集沉淀并保存于4 ℃待用。分離后的上清液繼續(xù)重復(fù)上述鹽析分級(jí)步驟并分別收集飽和度達(dá)到0～20%、20%～40%、40%～60%和60%～80%時(shí)所沉淀出的蛋白。最后用磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L,pH8.0)重懸保存的沉淀并轉(zhuǎn)移至透析袋中透析過夜(透析液與重懸液相同),在4 ℃條件下以10000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，收集上清液待用。

1.2.5 SDS-PAGE及β-1,4-木聚糖酶酶譜分析 SDS-PAGE參照Laemmli等[17]的方法:分離膠為12.5%,濃縮膠為4.5%,考馬斯亮藍(lán)R-250顯色。

酶譜分析方法:SDS-PAGE后(電泳膠中含有0.2%的櫸木木聚糖),將電泳膠取出用異丙醇(濃度為25%)溶液浸泡三次(10 min/次)復(fù)性蛋白,然后用緩沖液浸泡三次(10 min/次)洗去異丙醇溶液,最后將電泳膠置于37 ℃條件下保溫20 min,加入剛果紅(濃度為0.15%)溶液染色30 min,再用NaCl(濃度為1 mol/L)溶液脫色直至顯現(xiàn)透明帶,最終以乙酸(濃度為0.5%)溶液浸泡1 min顯色,出現(xiàn)的透明條帶即是β-1,4-木聚糖酶。

1.2.6 黃曲霉β-1,4-木聚糖酶的酶學(xué)特性研究

1.2.6.1 最適pH測(cè)定 在50 ℃條件下,分別測(cè)定不同pH及不同緩沖體系下(MES,pH5.0～6.5;MOPS,pH6.5～8.0;Tris-HCl,pH7.5～9.0;Glycine-NaOH,pH9.0～10.5)β-1,4-木聚糖酶的酶活力,以酶活力最高點(diǎn)作為100%。

1.2.6.2 pH穩(wěn)定性的測(cè)定 用1.2.6.1中不同pH的緩沖液分別稀釋酶液(蛋白終濃度為0.5 mg/mL),將稀釋好的酶置于45 ℃水浴鍋中分別處理30 min,再迅速將樣品放置于冰水中冷卻30 min,測(cè)定殘余酶活力。以未經(jīng)處理的β-1,4-木聚糖酶為空白對(duì)照,計(jì)算殘余酶活力占對(duì)照酶活力的百分比。

1.2.6.3 最適溫度測(cè)定 用MOPS緩沖溶液(50 mmol/L,pH7.5)配制底物,分別在不同溫度(30～70 ℃)下按照1.2.3方法測(cè)定β-1,4-木聚糖酶的酶活力,以酶活力最高點(diǎn)為100%。

1.2.6.4 溫度穩(wěn)定性的測(cè)定 用MOPS緩沖溶液(50 mmol/L,pH7.5)適當(dāng)稀釋酶液(蛋白終濃度為0.5 mg/mL)后放置于不同溫度(30～65 ℃,每隔5 ℃)下處理30 min,再迅速將樣品置于冰水中冷卻30 min,測(cè)定殘余酶活力。以未經(jīng)處理的β-1,4-木聚糖酶為空白對(duì)照,計(jì)算殘余酶活力占對(duì)照酶活力的百分比。

1.2.6.5 底物特異性測(cè)定 分別以濃度為1%的櫸木木聚糖和羧甲基微晶纖維素鈉,濃度為0.5%的脫枝阿拉伯聚糖和大麥葡聚糖以及濃度為5 mmol/L對(duì)硝基苯-β-D-吡喃木糖苷和鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷為水解底物,按照1.2.3方法測(cè)定酶活力,以櫸木木聚糖為底物時(shí)的酶活力為100%,分別計(jì)算各底物對(duì)應(yīng)相對(duì)酶活。

1.2.6.6 水解櫸木木聚糖的特異性研究 向櫸木木聚糖(濃度為1%)中加入10 U/mL的β-1,4-木聚糖酶進(jìn)行水解反應(yīng),分別在不同時(shí)間點(diǎn)取樣并經(jīng)沸水蒸煮5 min以滅酶活,10000 r/min離心10 min后取上清待測(cè)。處理好的樣品再經(jīng)TLC分析,條件如下:采用德國(guó)Merck公司60F 254型號(hào)硅膠板,展層劑為正丁醇/乙酸/水=2∶1∶1 (v/v/v),顯色劑為5%硫酸甲醇溶液,展層2次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究中涉及的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容均重復(fù)3次;黃曲霉發(fā)酵條件優(yōu)化的數(shù)據(jù)處理均采用Microsoft Office Excel軟件(2007版);圖片的編輯和處理均采用Microsoft Office Picture Manager軟件(2007版)。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對(duì)黃曲霉發(fā)酵產(chǎn)胞外β-1,4-木聚糖酶的影響

碳源(2.0%)對(duì)黃曲霉發(fā)酵產(chǎn)胞外β-1,4-木聚糖酶的能力有重要影響(表1)。結(jié)果表明,以麩皮為單一碳源時(shí)黃曲霉胞外產(chǎn)β-1,4-木聚糖酶能力最強(qiáng),當(dāng)麩皮添加量為3.5%時(shí)得到最高酶活力,達(dá)31.83 U/mL(圖1)。

表1 碳源對(duì)黃曲霉發(fā)酵產(chǎn)β-1,4-木聚糖酶能力的影響Table 1 Effects of carbon sources on β-1,4-xylanase production by A. flavus

黃曲霉能利用天然纖維質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)β-1,4-木聚糖酶,其產(chǎn)酶量明顯高于單一糖類,說明黃曲霉更適合利用此類營(yíng)養(yǎng)全面的天然底物。這可能是因?yàn)辂熎げ粌H富含蛋白質(zhì)、糖類、維生素和礦物質(zhì)等常見營(yíng)養(yǎng)元素,還含有一些能促進(jìn)微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)β-1,4-木聚糖酶的生長(zhǎng)因子,它既可以作為碳源,又可以作為氮源。此外,麩皮還是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程當(dāng)中的廢棄物,價(jià)格低廉,它的利用可以一定程度上節(jié)約酶的生產(chǎn)成本。多種曲霉菌株也被發(fā)現(xiàn)具有代謝利用纖維質(zhì)原料并誘導(dǎo)分泌β-1,4-木聚糖酶的能力,但它們的生產(chǎn)方式主要集中于固態(tài)發(fā)酵[9]。由圖1可知,麩皮的添加量會(huì)對(duì)菌株的產(chǎn)酶能力造成影響,過低的添加濃度會(huì)造成培養(yǎng)基的養(yǎng)分不足,難以滿足黃曲霉發(fā)酵產(chǎn)酶的需求;但過量添加麩皮又很容易引起培養(yǎng)基黏度的增加,導(dǎo)致溶氧降低,反而抑制了黃曲霉產(chǎn)β-1,4-木聚糖酶的能力。

圖1 麩皮的添加量對(duì)黃曲霉產(chǎn)胞外 β-1,4-木聚糖酶的影響Fig.1 Effect of the additive amout of wheat bran on β-1,4-xylanase production

2.2 氮源對(duì)黃曲霉發(fā)酵產(chǎn)胞外β-1,4-木聚糖酶的影響

氮源(1.0%)能顯著影響黃曲霉產(chǎn)β-1,4-木聚糖酶的能力(表2)。磷酸氫二銨是黃曲霉最適合的氮源(酶活力為58.66 U/mL)。研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)磷酸氫二銨添加量為3.0%時(shí)β-1,4-木聚糖酶的酶活力最高,達(dá)64.43 U/mL(圖2)。

表2 氮源對(duì)黃曲霉發(fā)酵產(chǎn)β-1,4-木聚糖酶的能力影響Table 2 Effects of nitrogen sources on β-1,4-xylanase production by A. flavus

由表1可知,黃曲霉以磷酸氫二銨為氮源時(shí)的產(chǎn)酶能力明顯高于有機(jī)氮源。而且,無機(jī)氮源的成本通常要低于有機(jī)氮源,這將有效降低該酶的生產(chǎn)成本。由圖2可知,磷酸氫二銨的添加量也會(huì)嚴(yán)重影響黃曲霉的產(chǎn)酶能力,添加量過高,會(huì)使菌體生長(zhǎng)過于旺盛,不利于代謝產(chǎn)物的積累,而添加量不足,菌體繁殖速率降低,影響了黃曲霉分泌β-1,4-木聚糖酶。

圖2 磷酸氫二銨的添加量對(duì)黃曲霉產(chǎn)胞外 β-1,4-木聚糖酶的影響Fig.2 Effect of the additive amout of(NH4)2HPO4 on β-1,4-xylanase production

2.3 表面活性劑對(duì)黃曲霉發(fā)酵產(chǎn)胞外β-1,4-木聚糖酶的影響

表面活性劑對(duì)黃曲霉產(chǎn)胞外β-1,4-木聚糖酶的影響結(jié)果如表3所示。非離子型表面活性劑促進(jìn)黃曲霉產(chǎn)β-1,4-木聚糖酶的作用明顯高于離子型表面活性劑,以吐溫-60作用效果最好。由圖3知，添加1.0%的吐溫-60時(shí)黃曲霉的產(chǎn)酶水平最高,酶活為86.42 U/mL。

圖3 吐溫-60添加量對(duì)黃曲霉產(chǎn)胞外 β-1,4-木聚糖酶的影響Fig.3 Effect of the additive amout of Tween-60 on β-1,4-xylanase production

表3 表面活性劑對(duì)黃曲霉發(fā)酵產(chǎn) β-1,4-木聚糖酶的能力影響Table 3 Effects of surfactants on β-1,4-xylanase production by A. flavus

一定濃度的表面活性劑通常具有增強(qiáng)微生物細(xì)胞膜通透性的功能,促進(jìn)胞內(nèi)酶向外滲透,進(jìn)而提高胞外酶產(chǎn)量[18]。本研究發(fā)現(xiàn)吐溫-60是最優(yōu)的表面活性劑,在其作用下黃曲霉胞外β-1,4-木聚糖酶產(chǎn)量增長(zhǎng)了47.0%,具有較強(qiáng)的促進(jìn)效果。但過量添加吐溫-60又很容易導(dǎo)致產(chǎn)酶量下降,可能是高濃度的表面活性劑造成了細(xì)胞膜的裂解,引起細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)大量泄漏,從而導(dǎo)致代謝失調(diào)產(chǎn)生抑制作用。

2.4 發(fā)酵溫度對(duì)黃曲霉發(fā)酵產(chǎn)胞外β-1,4-木聚糖酶的影響

發(fā)酵溫度對(duì)黃曲霉發(fā)酵產(chǎn)β-1,4-木聚糖酶具有重要影響(圖4)。結(jié)果表明,黃曲霉在35 ℃條件下培養(yǎng)時(shí)能夠高產(chǎn)β-1,4-木聚糖酶,最高酶活為89.31 U/mL。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)黃曲霉發(fā)酵產(chǎn)胞外 β-1,4-木聚糖酶的能力影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on β-1,4-xylanase production

溫度是限制微生物生長(zhǎng)代謝的關(guān)鍵因子之一,溫度升高時(shí)菌體生長(zhǎng)加快，且促進(jìn)了合成酶等活性物質(zhì)的作用效率。黃曲霉在35 ℃下產(chǎn)酶能力最強(qiáng),但進(jìn)一步升高溫度時(shí)黃曲霉的生長(zhǎng)明顯受到抑制,導(dǎo)致其酶活降低。

2.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃曲霉發(fā)酵產(chǎn)胞外β-1,4-木聚糖酶的影響

基于以上優(yōu)化的結(jié)果,最終研究發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃曲霉產(chǎn)β-1,4-木聚糖酶的影響(圖5)。β-1,4-木聚糖酶的酶活力隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增高,發(fā)酵至第5 d時(shí)酶活力最高,達(dá)115.08 U/mL。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃曲霉發(fā)酵產(chǎn)胞外 β-1,4-木聚糖酶的能力影響Fig.5 Effect of fermentation time on β-1,4-xylanase production

國(guó)內(nèi)外主要采用固態(tài)發(fā)酵的方式優(yōu)化黃曲霉產(chǎn)β-1,4-木聚糖酶的能力[9],而有關(guān)液態(tài)深層次培養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)酶的報(bào)道仍然較少。Bhushan等[11]的研究發(fā)現(xiàn),黃曲霉能以小麥秸稈和玉米粉為原料發(fā)酵產(chǎn)β-1,4-木聚糖酶,發(fā)酵6 d后酶活力達(dá)27.30 U/mL;Pal等[15]研究發(fā)現(xiàn)，黃曲霉DFR-6同樣能夠以麩皮為碳源并發(fā)酵生產(chǎn)β-1,4-木聚糖酶,發(fā)酵至第6 d達(dá)到最高酶活31.40 U/mL;而國(guó)內(nèi)僅發(fā)現(xiàn)李科等[13]系統(tǒng)研究過黃曲霉發(fā)酵產(chǎn)β-1,4-木聚糖酶的能力,發(fā)現(xiàn)該菌能以玉米芯為碳源發(fā)酵產(chǎn)酶,至第6 d時(shí)達(dá)到最高酶活(122.23 U/mL)。與上述報(bào)道相比,本研究中的黃曲霉具有相對(duì)較強(qiáng)的發(fā)酵生產(chǎn)β-1,4-木聚糖酶的能力,在發(fā)酵至第5 d時(shí)即可達(dá)到最高酶活(115.08 U/mL),表現(xiàn)出更高效的產(chǎn)酶能力，是未優(yōu)化時(shí)的9.4倍。

2.6 黃曲霉胞外分泌β-1,4-木聚糖酶的特性分析

為解析黃曲霉分泌β-1,4-木聚糖酶的基本特性,首先采用鹽析法對(duì)黃曲霉分泌的β-1,4-木聚糖酶進(jìn)行分級(jí)沉淀,實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)SDS-PAGE和β-1,4-木聚糖酶酶譜分析(圖6)。結(jié)果表明,黃曲霉能夠分泌兩種β-1,4-木聚糖酶,它們分別在硫酸銨飽和度達(dá)40%～60%和60%～80%時(shí)沉淀析出,其分子量大小分別為20.1和31.0 kDa左右(分別命名為β-1,4-木聚糖酶A和β-1,4-木聚糖酶B)。目前,國(guó)際上雖已有部分關(guān)于黃曲霉分泌β-1,4-木聚糖酶的報(bào)道,但其研究的β-1,4-木聚糖酶分子量?jī)H有14.0、28.5和35.0 kDa三種,均與本研究中的β-1,4-木聚糖酶分子量不同[10-12]。因此,有必要對(duì)該酶的酶學(xué)特性進(jìn)行深入研究。

圖6 不同飽和度硫酸銨分級(jí)沉淀β-1,4-木聚糖酶的 SDS-PAGE及β-1,4-木聚糖酶酶譜分析Fig.6 SDS-PAGE and zymogram analysis of β-1,4-xylanase production by A. flavus

2.7 黃曲霉β-1,4-木聚糖酶的酶學(xué)特性研究

為了分析黃曲霉β-1,4-木聚糖酶粗酶的酶學(xué)特性,本研究分別考察了該酶的最適pH和pH穩(wěn)定性(圖7a、7b)、最適溫度和溫度穩(wěn)定性(圖7c、7d)以及底物特異性(表4)。結(jié)果顯示,該酶的最適pH和最適反應(yīng)溫度分別為MOPS 7.5和55 ℃;該酶可在pH5.5～9.0范圍內(nèi)及30～50 ℃保持酶活力的穩(wěn)定,相對(duì)酶活力均在80%以上;黃曲霉β-1,4-木聚糖酶不僅能水解櫸木木聚糖,還能微弱降解大麥葡聚糖,表現(xiàn)出一定的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的活性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),該酶能夠快速水解櫸木木聚糖(圖8),并最終生成木二糖、木五糖和木六糖等一系列木寡糖。

表4 β-1,4-木聚糖酶的底物特異性測(cè)定結(jié)果Table 4 Substrate specifitiy of the β-1,4-xylanase from A. flavus

圖7 黃曲霉發(fā)酵產(chǎn)胞外β-1,4-木聚糖酶的溫度及pH特性Fig.7 Characterization of the temperature and pH of β-1,4-xylanase

目前,β-1,4-木聚糖酶被廣泛應(yīng)用在不同的工業(yè)領(lǐng)域,如造紙工業(yè)中,它主要用于漂白紙漿。然而,紙漿制造生產(chǎn)通常需要在偏堿性的環(huán)境下進(jìn)行,這對(duì)于那些在堿性環(huán)境中酶活力低、穩(wěn)定性差的β-1,4-木聚糖酶而言非常不利[19]。本研究的β-1,4-木聚糖酶最適pH為7.5,且在pH5.5～9.0范圍內(nèi)具有優(yōu)越的穩(wěn)定性能,表明它更加適用于這種偏堿性的環(huán)境。相比而言,多數(shù)曲霉來源的β-1,4-木聚糖酶僅在弱酸性(pH在5.0～7.0范圍內(nèi))條件下表現(xiàn)有較高的酶活力[9,11,20-21],這也嚴(yán)重限制了它們的應(yīng)用范圍。此外,眾多曲霉來源的β-1,4-木聚糖酶也只能在較窄的pH范圍內(nèi)保持酶活力的穩(wěn)定,例如其他黃曲霉來源的β-1,4-木聚糖酶僅在pH范圍為4.5～6.5時(shí)保持酶活力穩(wěn)定[11],還有黑曲霉和煙曲霉來源的β-1,4-木聚糖酶分別在pH范圍為4.0～6.5[15]和7.0～9.0[21]時(shí)保持酶活力的穩(wěn)定。據(jù)報(bào)道,曲霉菌所分泌的β-1,4-木聚糖酶通常在45～60 ℃內(nèi)表現(xiàn)出最高酶活力,本研究的β-1,4-木聚糖酶最適溫度為55 ℃,說明該酶屬于典型的曲霉β-1,4-木聚糖酶。此外,該酶與其它絲狀真菌來源的β-1,4-木聚糖酶類似,都能保證在50 ℃及以下溫度保持穩(wěn)定的酶活力[20,22]。

眾多β-1,4-木聚糖酶不僅對(duì)木聚糖底物具有很強(qiáng)的水解作用,還能夠降解CMC、地衣多糖、淀粉和果膠等聚糖類底物以及對(duì)硝基苯-β-D-吡喃木糖苷等糖苷類底物[23]。而本研究中的β-1,4-木聚糖酶在對(duì)木聚糖底物具有很強(qiáng)水解作用的同時(shí)，還能微弱水解大麥葡聚糖(表4),這對(duì)于強(qiáng)化該酶降解木質(zhì)纖維素材料的應(yīng)用具有重要意義。另一方面,該酶不具備降解CMC的能力,有效避免了紙漿中的纖維素被降解,將有利于它在紙漿漂白工業(yè)中的應(yīng)用,這一特性也與來源于聚多曲霉和煙曲霉的β-1,4-木聚糖酶類似[24-25]。此外,該酶也不能水解對(duì)硝基苯-β-D-吡喃木糖苷底物,說明它沒有β-木糖苷酶的活性,這也為其制備和生產(chǎn)功能性低聚木糖奠定了良好的理論基礎(chǔ)。

如圖8所示,黃曲霉分泌的β-1,4-木聚糖酶可在0.5 h內(nèi)快速將櫸木木聚糖降解并生成不同聚合度的低聚木糖;隨著時(shí)間的延長(zhǎng),降解產(chǎn)物又進(jìn)一步被水解,最終生成木二糖、木五糖及少量的木六糖。一般來說,曲霉β-1,4-木聚糖酶降解木聚糖底物主要生成木二糖和木三糖[26],可見本研究中的β-1,4-木聚糖酶的水解特異性與常見木聚糖酶的特異性并不相同。據(jù)了解,木二糖至木七糖是目前公認(rèn)的功能性低聚糖,其中木二糖具有最好的益生活性、木五糖還具有良好的抗腫瘤功效[27-28]。

圖8 黃曲霉胞外β-1,4-木聚糖酶 水解木聚糖的TLC分析圖Fig.8 TLC analysis of beechwood xylan hydrolytic by β-1,4-xylanase from A. flavus

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)黃曲霉能夠利用廉價(jià)的麩皮發(fā)酵生產(chǎn)β-1,4-木聚糖酶,經(jīng)培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件優(yōu)化后該菌株最高可產(chǎn)115.08 U/mL的β-1,4-木聚糖酶,高于其他報(bào)道;該菌能夠分泌兩種β-1,4-木聚糖酶,且分子量大小均不同于已有報(bào)道。酶學(xué)性質(zhì)結(jié)果表明,該酶的最適pH和最適溫度分別為MOPS 7.5和55 ℃,并在pH5.5～9.0范圍內(nèi)以及30～50 ℃保持酶活力的穩(wěn)定;該酶不僅可以降解櫸木木聚糖,還能夠微弱水解大麥葡聚糖,有助于其在木質(zhì)纖維素材料降解當(dāng)中的應(yīng)用。研究還發(fā)現(xiàn),黃曲霉β-1,4-木聚糖酶可以降解櫸木木聚糖，并主要生成木二糖和木五糖等功能性低聚糖,具有潛在的應(yīng)用前景。