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(1.深圳市華大農業(yè)應用研究院,廣東深圳 518083; 2.深圳華大生命科學研究院,廣東深圳 518083)

近年來隨著人們生活水平的不斷提高以及飲食消費習慣的不斷升級,中國的肥胖、高血糖、高血脂案例頻繁發(fā)生。高含量的膽固醇攝入與心腦血管疾病密切相關,由于膽固醇攝入過多引起的心腦血管疾病逐漸受到專家學者的關注[1]。然而市面上常用的降膽固醇的藥物具有一定的副作用,因此開發(fā)尋求一種降低血清膽固醇的天然物質具有十分重要的現實意義。

國內外研究表明,益生菌具有調節(jié)腸道菌群[2]、增強免疫力[3]、預防癌癥[4]等作用。臨床數據表明,益生菌具有降低人體血清膽固醇、預防心腦血管疾病等作用[5-7]。因此國內外研究降膽固醇益生菌成為熱點,主要集中在降膽固醇益生菌的鑒定、降膽固醇機理、降膽固醇微生物制劑和降膽固醇保健食品的開發(fā)[6-8]。篩選并擁有高效降膽固醇的益生菌有著重大的意義。

為找到具有較好降膽固醇能力的優(yōu)勢菌株,本文研究了10株乳酸菌降膽固醇能力、膽鹽水解酶(BSH)活力、α-葡萄糖苷酶抑制能力、細胞黏附性和抗生素敏感性等指標,篩選出具有較好的降膽固醇能力的優(yōu)勢菌株,為心腦血管疾病研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

10株分離菌株(表1) 實驗室已保種鑒定;L.caseiATCC 334、植物乳桿菌299V 購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心;HT-29人結腸癌細胞 協(xié)和醫(yī)科大學基礎所細胞中心;MRS培養(yǎng)基 美國BD DIFCO;RPMI-1640培養(yǎng)液 美國Invitrogen;α-葡萄糖苷酶(≥100 U/mg)、4-硝基酚-α-D吡喃葡萄糖苷(PNPG)、 美國Sigma公司;胃蛋白酶(3000～3500 U/mg))生工生物工程(上海)股份有限公司;阿卡波糖 拜耳醫(yī)藥公司;慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、紅霉素、克林霉素、氯霉素、氨芐青霉素、新霉素、甲氧芐啶、萬古霉素 美國BBI;膽鹽、巰基乙酸鈉、膽固醇、甘氨酸等試劑 均為分析純,生工生物工程(上海)股份有限公司。

表1 10株乳桿菌的分離來源Table 1 Sources of 10 different Lactobacillus

Bio-Tek Synergy 2多功能酶標儀 美國Biotek公司;LMQ.C-50E立式壓力蒸汽滅菌器 山東新華醫(yī)療器械股份有限公司;5810R冷凍高速離心機 德國Eppendorf;SHP-080生化培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設備有限公司;DW-86L490超低溫保存箱 青島海爾股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株活化 將10株菌分別從甘油保藏管中取出100 μL放入5 mL MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃靜置培養(yǎng)16～18 h進行菌株活化。后續(xù)菌株均用此活化菌液。

1.2.2 膽固醇降解率測定 無菌MRS培養(yǎng)基中加入過濾除菌的膽鹽(30 mg/mL)、巰基乙酸鈉(10%,w/v)、膽固醇(100 μg/mL)[9]。分別將10株菌活化并以1%接種量接種于該培養(yǎng)基中,37 ℃厭氧培養(yǎng)18 h后,離心(12000×g,4 ℃,10 min)取上清液,采用試劑盒法測定膽固醇含量[10],并根據公式(1)計算膽固醇降解率。

膽固醇降解率(%)=(m1-m2)/m1×100

式(1)

式中:m1、m2分別為發(fā)酵前、后上清液中膽固醇含量,μg。

1.2.3 BSH活力測定

1.2.3.1 標準曲線 采用茚三酮比色法[11]測定不同濃度甘氨酸溶液(0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L)在570 nm的吸光度,以繪制標準曲線。

1.2.3.2 BSH活力測定 參照文獻[11]。分別將10株菌株發(fā)酵液離心(12000×g,4 ℃,3 min)收集菌體后,用0.1 mol/L PBS(pH6.8)將菌體濃度調至1×109CFU/mL,取1 mL加入4 mL 5 mmol/L甘氨去氧膽酸鈉(GDCA)緩沖液(pH6.8)中混勻,于37 ℃反應30 min后測定570 nm的吸光值。BSH酶活(U)定義為1 CFU/mL菌液經過1 min反應產生甘氨酸的物質的量(μmol)。

1.2.4α-葡萄糖苷酶抑制率測定α-葡萄糖苷酶活性測定方法參考文獻[12]。分別將1.2.1中菌液以1%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基,37 ℃厭氧培養(yǎng)18 h,離心(12000×g,4 ℃,10 min)收集上清液,取25 μL上清液加入96孔酶標板,然后加入25 μLα-葡萄糖苷酶溶液(0.5 U/mL),37 ℃保溫5 min,再加入75 μL 0.1 mol/L PBS(pH6.8)、37.5 μL 20 mmol/L PNPG 溶液,反應25 min后加入100 μL 0.1 mol/L Na2CO3溶液終止反應,并在405 nm下測定吸光值。以0.8 mg/mL阿卡波糖作為陽性對照,并根據公式(2)計算α-葡萄糖苷酶抑制率。

α-葡萄糖苷酶抑制率(%)=[1-(C-D)/(A-B)]×100

式(2)

式中:A:含酶但樣品替換為0.1 mol/L PBS(pH6.8)的吸光值;B:酶與樣品均替換為0.1 mol/L PBS(pH6.8)的吸光值;C:含酶含樣品的吸光值;D:含樣品但酶替換為0.1 mol/L PBS(pH6.8)的吸光值。

1.2.5 酸耐受性試驗 參考文獻[13],分別配制pH2.0和pH3.0的人工胃液(胃蛋白酶3.2 g,NaCl 2.0 g,HCl調pH),0.45 μm薄膜濾器過濾除菌后對其進行37 ℃預熱操作。取1 mL 1.2.1中菌液進行離心(5000×g,4 ℃,10 min)收集菌體,加入1 mL人工胃液,37 ℃下共培養(yǎng)0、2 h后分別測定兩種酸度人工胃液處理后活菌數,根據公式(3)計算菌株的存活率。

菌株的存活率(%)=活菌數(2 h)/活菌數(0 h)×100

式(3)

1.2.6 膽鹽耐受性試驗 正常人體小腸中膽汁酸含量約0.3%～0.5%,并且乳酸菌對膽固醇的吸收也依賴于膽酸鹽的存在[14]。食物經咀嚼后依次進入人體胃、腸道;此試驗體外模擬體內消化過程,研究菌株在膽鹽溶液的存活情況。參照文獻[15],0.45 μm薄膜濾器對pH3.0的人工胃液及0.3%的膽鹽溶液除菌并進行37 ℃預熱5 min。取1 mL 1.2.1中菌液離心(5000×g,4 ℃,10 min)并收集菌體,加入1 mL pH3.0的人工胃液,檢測菌體與pH3.0的人工胃液37 ℃共培養(yǎng)0 h時的活菌數;菌體與pH3.0的人工胃液共培養(yǎng)2 h后離心(5000×g,4 ℃,10 min)取菌體,加入1 mL膽鹽溶液,然后檢測菌體與膽鹽溶液37 ℃共培養(yǎng)3 h后的活菌數,根據公式(4)計算菌株的存活率。

菌株的存活率(%)=活菌數(3 h)/活菌數(0 h)×100

式(4)

1.2.7 黏附試驗 定植和黏附是菌株發(fā)揮益生功能的前提;以HT-29人結腸癌細胞來近似模擬機體結腸細胞,研究不同益生菌對機體細胞的黏附能力。菌株對HT-29人結腸癌細胞的黏附試驗[16-18]過程如下:向HT-29細胞中加入0.5 mL 0.25%胰酶溶液充分浸潤,消化時間約為1～3 min,肉眼觀察瓶壁半透明的細胞層,當見到出現細針孔空隙時,棄去胰酶溶液,并加入1 mL RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清,1%雙抗即青霉素和鏈霉素)終止消化;然后用不含雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋將細胞濃度調整至2×105cell/mL,隨后取1 mL加入12孔板中,靜置培養(yǎng)使其長成致密單層細胞。同時,將1.2.1中菌液用RPMI-1640培養(yǎng)液將菌液調至5×108CFU/mL,取1 mL菌液加入到12孔板中與細胞共孵育90 min,孵育結束后用pH7.4 PBS漂洗除去未黏附的細菌。繼而用胰酶消化細胞,對黏附菌體進行顯微鏡觀察。

1.2.8 抗生素敏感性試驗 配制不同種類的10種抗生素溶液(2.56 mg/mL),各取50 μL抗生素母液添加于微孔樣板孔中。將1.2.1中菌液用生理鹽水將菌濃度調整至1×109CFU/mL,混勻,取50 μL菌液置于各抗生素孔,37 ℃培養(yǎng)48 h,分光光度計測定OD625[19-20]。以菌株L.caseiATCC 334為質控菌株,陰性對照組添加50 μL去離子水和50 μL MRS培養(yǎng)液,陽性對照組添加50 μL去離子水和50 μL待測菌株的MRS菌液。當檢測值低于陰性對照組的2倍即視為停止生長。則此時的菌液濃度為該抗生素對實驗菌株的最小抑菌濃度(MIC)。將實驗室自主篩選的菌株分別與植物乳桿菌和卷曲乳桿菌的MIC安全臨界值對比,當所篩菌株能夠生長的最低抗生素濃度超過安全界值時,表明該菌株對此濃度的抗生素具有抗性,能正常生長,則該菌株不能被用于益生菌的開發(fā),存在潛在的耐藥性[21]。

1.3 數據處理

試驗中涉及的樣本數據均重復做三次數據,試驗數據表示為平均值±標準差(Mean±SD)。采用SPSS 17.0軟件對試驗中涉及的數據進行顯著性分析(p=0.05),用Microsoft Excel 2013對實驗數據進行繪圖。

2 結果與討論

2.1 菌株降膽固醇能力測定

由圖1可知,10株菌均具有一定的降膽固醇的能力,但不同乳桿菌菌株降膽固醇能力存在差異。除植物乳桿菌OF38-8 pH5和植物乳桿菌SD-H9外,其余8株菌對膽固醇的降解率均達到了30%以上。其中,植物乳桿菌LH-511、植物乳桿菌10-12、植物乳桿菌10-4對膽固醇的降解率均達到了50%以上,顯著高于對照菌株植物乳桿菌299V(p<0.05)。植物乳桿菌OF44-5pH5、植物乳桿菌10-14和卷曲乳桿菌OF48-2pH5體外降膽固醇能力與對照菌株植物乳桿菌299V相比無顯著差異(p>0.05)。

圖1 菌株體外降解膽固醇能力Fig.1 Abilities of lowering-cholesterol from different strains in vitro注:不同字母表示差異顯著,p<0.05;圖2～圖3,表2～表4同。

目前研究證明許多菌株都具有降膽固醇能力,但膽固醇的降解率存在差異。韋云路等[21]研究的三株益生菌的體外膽固醇降解率在23%左右。林斌等[22]證明從福建南平地區(qū)自然發(fā)酵的酸乳中分離得到的植物乳桿菌HLX37對膽固醇降解率達37.33%±2.55%。胡夢坤等[23]從泡菜中分離出來的植物乳桿菌LP1103對膽固醇降解率達42.5%。因此,本研究中降膽固醇能力最優(yōu)的三株菌(植物乳桿菌LH-511、植物乳桿菌10-12、植物乳桿菌10-4)均高于目前報道的菌株,在體外膽固醇降解方面存在優(yōu)勢。

2.2 菌株BSH活力測定

具有BSH活力的菌株在體內能發(fā)揮更好的降膽固醇能力,因此BSH活力成為篩選具有降膽固醇能力的菌株的一個重要指標[24]。甘氨酸標準液濃度在0～5 mmol/L內繪制的標準曲線方程為y=0.2991x+0.0064,R2=0.9987。結果如圖2所示,10株供試菌株均具有BSH活力,其中植物乳桿菌LH-511的BSH活力顯著高于其余菌株(p<0.05),植物乳桿菌10-14、卷曲乳桿菌OF48-2pH5的BSH活力次之,且與對照菌株植物乳桿菌299V無顯著性差異(p>0.05)。植物乳桿菌10-12、植物乳桿菌10-4、干酪乳桿菌11-6、戊糖乳桿菌OF39-21PH10-2、植物乳桿菌OF44-5PH5、植物乳桿菌OF38-8pH5和植物乳桿菌SD-H9的BSH活力相對較低,顯著低于對照菌株植物乳桿菌299V(p<0.05)。

圖2 菌株膽鹽水解酶活力Fig.2 Activities of BSH from different strains

2.3 α-葡萄糖苷酶抑制率的測定

由圖3結果可看出，10株供試菌株均表現出對α-葡萄糖苷酶的活性有抑制作用,并且抑制率均可達到30%以上。其中,植物乳桿菌10-12、植物乳桿菌10-14、植物乳桿菌SD-H9和卷曲乳桿菌OF48-2pH5對α-葡萄糖苷酶的抑制率顯著高于陽性對照組阿卡波糖(p<0.05)。植物乳桿菌11-6、戊糖乳桿菌OF39-21pH10-2、植物乳桿菌LH-511、植物乳桿菌OF44-5pH5、植物乳桿菌OF38-8pH5、植物乳桿菌10-4對α-葡萄糖苷酶的抑制率則與阿卡波糖相比無顯著性差異(p>0.05)。這與范文婭等[12]篩選的一株干酪乳桿菌對α-葡萄糖苷酶抑制率為37.36%相當,高于陳佩[25]篩選的干酪乳桿菌CCFM0412(29.41%)。

圖3 菌株對α-葡萄糖苷酶活的抑制率Fig.3 Inhibitory rate of different strains to α-glucosidase

2.4 菌株對酸耐受能力的測定

益生菌在體內其益生作用必須要耐受胃中的酸性環(huán)境,因此本研究將供試菌株接種于pH2.0和pH3.0的酸性培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h以檢測對胃酸的耐受性,結果如表2、表3所示。由表2可知,所有供試菌株在pH3.0條件下培養(yǎng)2 h活菌數仍維持在109CFU/mL,其存活率達到70%以上,說明10株供試菌株對pH3.0表現出較強的耐受性。其中,植物乳桿菌LH-511、植物乳桿菌10-12、植物乳桿菌10-4、干酪乳桿菌11-6在pH3.0條件下培養(yǎng)2 h后存活率較其余供試菌株存活率高,并與對照菌株植物乳桿菌299V耐酸能力相當。由表3可知,所有供試菌株在pH2.0環(huán)境下培養(yǎng)2 h后活菌數仍可達到106CFU/mL以上,其中植物乳桿菌LH-511、植物乳桿菌10-12、植物乳桿菌10-4的存活率較對照菌株植物乳桿菌299V高。結果表明,10株供試菌株在均可耐受pH2.0和pH3.0的酸性環(huán)境,能夠通過耐受胃酸從而達到腸道中。這與靳志強等[14]的研究結果相近:植物乳桿菌H3可耐受pH2.0和pH3.0的酸性環(huán)境,并且培養(yǎng)2 h后活菌數維持在106CFU/mL左右。

表2 pH3.0時的活菌數及存活率統(tǒng)計Table 2 Statistics of bacteria colony counts and survival rate at pH3.0

2.5 菌株對膽鹽耐受能力的測定

人體腸道中膽汁酸鹽正常含量為0.3%～0.5%,因此通常以0.3%膽鹽含量來衡量菌株耐受人體腸道膽汁酸的水平[13]。由表4可知,供試菌株在pH3.0條件下培養(yǎng)2 h轉接于0.3%膽鹽溶液培養(yǎng)3 h后存活率在0.59%～1.62%,活菌數有所下降,但均維持在107CFU/mL以上。其中,植物乳桿菌LH-511、植物乳桿菌10-14、植物乳桿菌10-4、卷曲乳桿菌OF48-2pH5和植物乳桿菌10-12的耐酸耐膽鹽能力較其余供試菌株強,與對照菌株植物乳桿菌299V耐酸耐膽鹽能力相近。這一結果與隋夢等[26]的研究結果相近,植物乳桿菌Zhang-LL利用0.3%膽鹽培養(yǎng)3 h后活菌數維持在106～107CFU/mL。

表4 菌株在0.3%膽鹽環(huán)境下的菌落計數及存活率統(tǒng)計Table 4 Statistics of bacteria colony counts and survival rate at 0.3% bile acid concentration

綜合考慮BSH活力、α-葡萄糖苷酶抑制能力以及耐酸耐膽鹽能力,認為植物乳桿菌LH-511、植物乳桿菌10-12、植物乳桿菌10-14、植物乳桿菌10-4和卷曲乳桿菌OF48-2pH5具有較好的應用潛力,因此選取此五株菌進行下一步的細胞黏附及抗生素試驗。

2.6 菌株黏附HT-29細胞能力比較

乳酸菌定植并黏附于腸道上皮細胞是其發(fā)揮益生功能的先決條件[19]。由圖4可知,植物乳桿菌LH-511、植物乳桿菌10-12、植物乳桿菌10-14、植物乳桿菌10-4和卷曲乳桿菌OF48-2pH5均具有黏附于HT-29細胞的能力,因此表明五株乳桿菌皆可定植于人體腸上皮細胞,進而起到降低機體膽固醇的作用。

圖4 菌株對HT-29細胞的黏附能力(1000×)Fig.4 Adhesion of bacteria to HT-29 cells(1000×)注:a、b、c、d、e、f分別代表植物乳桿菌LH-511、植物乳桿菌10-12、植物乳桿菌10-14、 植物乳桿菌10-4和卷曲乳桿菌OF48-2pH5對細胞黏附的狀態(tài)圖;箭頭處指示菌株附著示意。

2.7 菌株抗生素敏感性試驗

植物乳桿菌LH-511、植物乳桿菌10-12、植物乳桿菌10-14、植物乳桿菌10-4和卷曲乳桿菌OF48-2pH5對10種抗生素敏感性結果如表5所示。質控菌株L.caseiATCC 334對抗生素敏感性與報道數據吻合[27],因此該方法測定菌株抗生素敏感性結果可信。由表5可知,除植物乳桿菌10-12、10-14、10-4 對紅霉素、克林霉素的敏感性超出了安全局規(guī)定的安全界限值范圍外,其余菌株對10種抗生素的敏感性均在安全界限值內。綜上可知,本研究篩選的植物乳桿菌LH-511和卷曲乳桿菌OF48-2pH5通過了菌株抗生素敏感性試驗的安全性評價,可以作為有潛力的功能菌株進行深入挖掘及臨床應用。

表5 不同菌株對10種抗生素的MIC值比較Table 5 Bacteria MIC values to 10 antibiotics

3 結論

本研究所篩選出2株具有降膽固醇功能的乳桿菌分別為植物乳桿菌LH-511和卷曲乳桿菌OF48-2pH5,其益生特性各有優(yōu)劣。植物乳桿菌LH-511和卷曲乳桿菌OF48-2pH5體外降膽固醇能力較強,膽固醇降解率分別達到57.5%和41.9%;對α-葡萄糖苷酶也有較高的抑制率,分別達到33.8%和39.1%。另外,2株乳桿菌具有耐酸耐膽鹽和黏附腸上皮細胞能力,且通過了抗生素敏感性安全評價,表明植物乳桿菌LH-511和卷曲乳桿菌OF48-2pH5能夠很好地通過消化道的屏障作用而發(fā)揮降膽固醇和降血糖功能。本研究篩選到的2株乳桿菌下步將會進行動物實驗以驗證其降膽固醇和降血糖作用效果,以便于進一步對菌株進行開發(fā)和應用。