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(1.浙江農(nóng)業(yè)商貿(mào)職業(yè)學(xué)院,浙江紹興 312088; 2.淮陰師范學(xué)院,江蘇省高校區(qū)域現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與環(huán)境保護(hù)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇淮安 223300)

小麥?zhǔn)侵匾募Z食作物,小麥麩皮由小麥的果皮、種皮層、糊粉層、少量胚和胚乳組成,是面粉加工過(guò)程中的主要副產(chǎn)品[1]。小麥麩皮中含有豐富的蛋白質(zhì)、膳食纖維(多糖)、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分[2]。小麥麩皮中的多糖主要由非淀粉多糖和淀粉多糖組成,非淀粉多糖含量占46%左右,是小麥細(xì)胞壁的主要成分[3]。小麥麩皮多糖具有抗衰老、提高免疫力、抗癌、降血脂降血壓等功效[4]。因此,研究小麥麩皮多糖的高效提取對(duì)開(kāi)發(fā)利用小麥麩皮資源具有重要的意義。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于多糖提取的報(bào)道,多集中于熱浸水提、微波提取法、堿提取法、超聲波提取法等[5]。研究發(fā)現(xiàn),不同提取方法具有各自的優(yōu)缺點(diǎn),且對(duì)多糖的生物活性影響不同。傳統(tǒng)熱水浸提法以工藝簡(jiǎn)單、易于推廣等特點(diǎn)為人們所接受[6];酶提法具有操作簡(jiǎn)便、條件溫和、雜質(zhì)易去除等優(yōu)點(diǎn)[7];酸堿提取法具有可以降低多糖分子量、降低溶液粘度、提高其水溶性等優(yōu)點(diǎn)。本文以淮麥33麩皮為原料,分別采用水提法、纖維素酶提取法、堿提法及酸提法提取小麥麩皮多糖,初探不同提取方法對(duì)小麥麩皮多糖的提取率、化學(xué)組分及生物活性等的影響,以期為小麥麩皮多糖的進(jìn)一步研究與開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥超微粉麩皮(淮麥33) 江蘇省淮安農(nóng)科院;氫氧化鈉、乙醇、三氟乙酸 分析純,國(guó)藥集團(tuán);亞硝酸鈉、甲氮甲唑藍(lán)(MTT)、臺(tái)盼藍(lán)、葡萄糖(純度≥99.5%)、半乳糖醛酸(純度99%) Sigma公司;胎牛血清(FBS) HyClone公司;小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞 美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC);RPMI 1640培養(yǎng)基、雙抗、青霉素、鏈霉素) Gibco公司;微量BCA蛋白定量試劑盒 北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;Griess試劑盒北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;鹽酸 國(guó)藥集團(tuán);乙醇 國(guó)藥集團(tuán);二抗 Cell Signaling公司。

UV-8000紫外分光光度計(jì) 上海昂拉儀器有限公司;HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇億通電子有限公司;H1850R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) Eppendorf公司;Agilent7890A GC氣相色譜儀 美國(guó)Agilent公司;M200 Tecan infinite PRO酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司;MCO-15AC二氧化碳培養(yǎng)箱 日本SANYO公司;FEI Quanta 450FEG場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 美國(guó)FEI公司;ALPHA 1-2LDPLUS冷凍干燥機(jī) 德國(guó)CHRIST公司;JC-S12/24吹氮儀 南京榮華科學(xué)器材有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小麥麩皮多糖的提取

1.2.1.1 酸法提取小麥麩皮多糖 稱(chēng)取10.00 g小麥超微粉麩皮,按1∶20 (m/V)料液比加入pH3.0的鹽酸溶液,水浴加熱50 ℃提取2 h,濾布過(guò)濾得上清液,濾渣按上述方法重復(fù)提取一次,合并濾液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液濃縮至原體積的50%,加入4倍體積95%乙醇沉淀12 h,室溫離心(6000 r/min 15 min)收集多糖沉淀,經(jīng)冷凍干燥(-30 ℃18 h)得小麥麩皮粗多糖。

1.2.1.2 堿法提取麩皮多糖 稱(chēng)取10.00 g小麥超微粉麩皮,按1∶20 (m/V)料液比加入0.16 mol/L NaOH溶液,50 ℃水浴加熱浸提2 h,濾布過(guò)濾得上清液,濾渣按上述方法重復(fù)提取一次,合并濾液。其余操作與1.2.1.1相同,得小麥麩皮粗多糖。

1.2.1.3 水法提取小麥麩皮多糖 稱(chēng)取10.00 g小麥超微粉麩皮,按1∶20 (m/V)料液比加入蒸餾水,水浴加熱50 ℃下提取2 h,濾布過(guò)濾得上清液,濾渣按上述方法重復(fù)提取一次,合并濾液。其余操作與1.2.1.1相同,得小麥麩皮粗多糖。

1.2.1.4 酶法提取小麥麩皮多糖 稱(chēng)取10.00 g小麥超微粉麩皮,按1∶20 (m/V)料液比,加纖維素酶(酶活2000 U/g)0.75%(w/v),水浴加熱50 ℃提取2 h,煮沸10 min滅酶。濾布過(guò)濾得上清液,其余操作同1.2.1.1,得小麥麩皮粗多糖。

1.2.2 多糖含量測(cè)定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱(chēng)取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖(純度≥99.5%)10 mg,蒸餾水定容至10 mL容量瓶得標(biāo)準(zhǔn)液。將標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成質(zhì)量濃度為50、100、150、200、250、300、350 μg/mL的工作液,吸取工作液0.2 mL,加入0.4 mL 5%苯酚,混合后迅速加2 mL濃硫酸,室溫放置30 min,測(cè)定490 nm處吸光度,以蒸餾水做空白對(duì)照[8]。以葡萄糖濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度Y為縱坐標(biāo),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程:Y=0.002X-0.037(R2=0.994)。

1.2.2.2 粗多糖含量測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)取50 mg 1.2.1.1～1.2.1.4中的粗多糖,蒸餾水定容至100 mL,吸取0.2 mL按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法操作在490 nm測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖濃度,求得樣品中的多糖含量,見(jiàn)式(1),粗多糖得率計(jì)算見(jiàn)式(2)。

多糖含量(%)=(V×C×f/M)×100

式(1)

其中:V:溶解粗多糖定容后的體積,mL;C:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出多糖的濃度,g/mL;f:多糖的校正系數(shù);M:稱(chēng)取的粗多糖質(zhì)量,mg。

粗多糖得率(%)=粗多糖質(zhì)量/原料質(zhì)量×100

式(2)

1.2.3 小麥麩皮多糖糖醛酸含量測(cè)定

1.2.3.1 半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱(chēng)取半乳糖醛酸20 mg,蒸餾水溶解并定容至100 mL,制備成200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

分別取半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液125、250、375、500、750、1000 μL置于2 mL具塞試管加水稀釋至刻度,配制成濃度為12.5、25、37.5、50、75、100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。移取400 μL半乳糖醛酸系列標(biāo)準(zhǔn)液分別在冰水浴加入2.4 mL四硼酸鈉,沸水加熱20 min,立即取出于冰上冷卻,加入80 μL 0.15%的3-苯基苯酚溶液,室溫下顯色10 min,空白以蒸餾水替代,535 nm處測(cè)定吸光度[9]。以半乳糖醛酸濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度Y為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程:Y=0.001X-0.009(R2=0.992)

1.2.3.2 樣品測(cè)定 稱(chēng)取60 ℃干燥至恒重的小麥麩皮多糖25 mg,蒸餾水溶解并定容至100 mL,得濃度為250 μg/mL的樣品溶液,其余操作如1.2.3.1,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程,測(cè)定半乳糖醛酸含量。

1.2.4.1 硫酸鉀溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 配制BaCl2-明膠溶液備用,稱(chēng)取0.50 g明膠加少量蒸餾水于60～90 ℃溶解,定容至100 mL 4 ℃保存過(guò)夜。稱(chēng)取0.50 g BaCl2用明膠溶液定容至50 mL,室溫下放置2～3 h,4 ℃冰箱保存。

稱(chēng)取K2SO410 mg用蒸餾水溶解并定容至10 mL,分別移取0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0 mL K2SO4標(biāo)準(zhǔn)溶液于2 mL的具塞試管并加水至刻度,配制成濃度為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 mg/mL的K2SO4溶液。移取K2SO4標(biāo)準(zhǔn)溶液200(L于試管中,加3.8 mL 3%(w/v)的TCA溶液、1 mL BaCl2-明膠溶液,混合均勻,室溫下放置15～20 min,空白以蒸餾水替代,測(cè)定360 nm處吸光度值[10]。以K2SO4濃度X(mg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度Y為縱坐標(biāo),制得標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=1.775X+0.053(R2=0.993)

1.2.5 小麥麩皮多糖蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 按照BCA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線蛋白含量為Y=0.0129X-0.0144(R2=0.996),蛋白濃度測(cè)定范圍為20～5000 g/mL。

小麥麩皮多糖溶解于蒸餾水中,配成250 μg/mL水溶液,采用BCA法在526 nm處測(cè)得吸光度,帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到蛋白質(zhì)含量[11]。

1.2.6 單糖組分分析

1.2.6.1 單糖衍生物的制備 分別稱(chēng)取鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖10 mg置于具塞玻璃管中,加入鹽酸羥胺10 mg,無(wú)水吡啶500 μL,90 ℃水浴加熱30 min;取出后放置冰上迅速冷卻至室溫,加入500 μL醋酸酐,水浴加熱90 ℃乙?；磻?yīng)30 min,反應(yīng)完成后利用吹氮儀吹干,再加入1 mL三氯甲烷復(fù)溶。將各標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物混合,取1 μL混合液直接進(jìn)行色譜分析[12]。

色譜條件:色譜柱:DM-5(30 m×0.25 mm,0.25 μm);柱溫:從120 ℃以0.4 ℃/min升溫至160 ℃,2 min后以0.1 ℃/min升溫至162 ℃,再以3 ℃/min的速度升溫至169 ℃,以0.2 ℃/min升溫至171 ℃;N2作為載氣;進(jìn)樣溫度為235 ℃;進(jìn)樣方式:分流(分流比10∶1);檢測(cè)器:FID為280 ℃(氮?dú)怏w積流量30 mL/min,氫氣體積流量30 mL/min,空氣體積流量300 mL/min);進(jìn)樣量:1.0 μL。

1.2.6.2 小麥麩皮多糖的水解和衍生化 稱(chēng)取小麥麩皮多糖10 mg,加入4 mol/L 三氟乙酸溶液4 mL,混合均勻。100 ℃水解12 h,吹氮儀吹干備用。水解后的樣品,按照單糖衍生物的制備方法進(jìn)行衍生化處理,取1 μL樣品進(jìn)行氣相色譜分析。

1.2.7 小麥麩皮殘?jiān)奈⒂^形態(tài)觀察 將不同提取液處理后的小麥麩皮殘?jiān)鼧悠泛娓?分別取樣品適量,鋪于電鏡銅臺(tái)上,噴金鍍膜后置于掃描電子顯微鏡下觀察。

1.2.8 細(xì)胞毒性的檢測(cè)

1.2.8.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代方法 小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞,用含終濃度為10%胎牛血清、青霉素(100 μg/mL)及鏈霉素(100 μg/mL)的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)并置于5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況約48 h換液1次。

傳代方法:待細(xì)胞貼壁率達(dá)到80%左右后,用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下,加入5 mL的1640培養(yǎng)基,吹打分離細(xì)胞后進(jìn)行傳代培養(yǎng),約3～4 d 傳代1次,取12～25傳代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.8.2 細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn) 采用MTT法[13]檢測(cè)樣品對(duì)RAW264.7細(xì)胞毒性的影響。取細(xì)胞懸浮液稀釋細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)/mL,以每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板,培養(yǎng)16～18 h。向96孔板中加入不同提取方法所得小麥麩皮多糖(12.5、25、100、200 μg/mL)為實(shí)驗(yàn)組,未加小麥麩皮多糖的為空白組。每組設(shè)3個(gè)重復(fù),于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,吸去上清,每孔加入100 μL MTT工作液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,加入100 μL MTT終止液。待完全溶解后,用酶標(biāo)儀在550 nm處測(cè)定OD值,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)存活率。

細(xì)胞相對(duì)存活率(%)=(OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組)/(OD對(duì)照組-OD空白組)×100

1.2.8.3 不同提取方法小麥麩皮多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞釋放一氧化氮(NO)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)/mL,以每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板,培養(yǎng)16 h。添加不同濃度小麥麩皮多糖溶液(0、12.5、25、50、100、200 μg/mL)處理細(xì)胞,24 h后采用Griess試劑盒法檢測(cè)細(xì)胞上清液中NO的含量。

1.2.8.4 不同提取方法小麥麩皮多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞COX-2和iNOS蛋白表達(dá)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下,加入5 mL的1640培養(yǎng)基,吹打分離細(xì)胞后計(jì)數(shù),用1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL,按100 μL/孔接種于直徑為40 mm的培養(yǎng)皿中,每個(gè)小培養(yǎng)皿接種5×105個(gè)細(xì)胞,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,貼壁24 h后,吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液,設(shè)置對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(麩皮多糖100 μg/mL)每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔,在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,收集細(xì)胞。加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑提取總蛋白,BCA試劑盒法測(cè)定總蛋白濃度,建立30 μL的體系,95 ℃滅活蛋白5 min,蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后,半干轉(zhuǎn)印至PVDF膜,用10 mL 1×TBS在洗膜10 min,加入3%的BSA洗膜1 h,再加入10 mL的TTBS繼續(xù)洗膜3次,HRP標(biāo)記的二抗于室溫下孵育1 h,洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶試劑顯色。分析不同提取方式獲得的小麥麩皮多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞COX-2和iNOS蛋白表達(dá)的影響。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPASS 20.0進(jìn)行Duncan法比較分析,p<0.05為差異顯著,SigmaPlot繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法小麥麩皮多糖得率比較

如圖1,四種提取方法對(duì)小麥麩皮多糖得率影響差異顯著(p<0.05)。堿提法粗多糖得率為31.73%±1.60%,多糖含量為57.79%±0.60%(是水提法的1.7倍);酶提法粗多糖得率為14.47%±0.68%,多糖含量為49.2%±0.38%;酸提法和水提法粗多糖得率及多糖含量均較低。與張曉娜[14]的研究結(jié)果相似。小麥麩皮中的部分多糖與體系中的木質(zhì)素、纖維素、蛋白質(zhì)等組分間存在著許多以阿魏酸連接的共價(jià)酯鍵[15],形成水不溶性多糖。NaOH能夠打斷共價(jià)酯鍵的結(jié)合,有利于小麥麩皮多糖的溶出。小麥麩皮中酸性多糖含量較高,堿液能夠使酸性多糖浸出,因此堿提法得到的多糖得率及含量最高[16]。

圖1 不同提取方法對(duì)小麥麩皮多糖的 得率及多糖含量的比較Fig.1 Comparison of yield and content of polysaccharides from wheat bran by different extraction methods注:圖中相同指標(biāo)不同小寫(xiě)字母代表差異顯著, p<0.05;圖2～圖3,圖7同。

2.2 不同提取方法對(duì)小麥麩皮多糖糖醛酸、硫酸根含量的影響

圖2中堿提取法所得小麥麩皮粗多糖的糖醛酸、硫酸根含量最高,為8.01%±0.08%、13.02%±0.07%;酶提取法的糖醛酸和硫酸根含量為6.19%±0.11%、9.91%±0.81%;酸提和水提法取糖醛酸及硫酸根含量較低。小麥麩皮半纖維素是由木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖及葡萄糖醛酸組成的異質(zhì)木聚糖,葡萄糖醛酸及它的4-甲基醚存在于側(cè)鏈的非還原末端。

圖2 不同提取方法下小麥麩皮多糖的 糖醛酸及硫酸根含量比較Fig.2 Effects of different extraction methods on the contents of uronic acid and sulfuric acid of wheat bran polysaccharides

2.3 小麥麩皮多糖蛋白質(zhì)含量的比較

圖3可見(jiàn)不同提取方法得到粗多糖中蛋白質(zhì)含量各不相同,酶提法得到粗多糖的蛋白質(zhì)含量最高為22.74%±0.32%;堿提法粗多糖蛋白質(zhì)含量為5.64%±0.78%;酸提和水提粗多糖中蛋白質(zhì)含量分別為22.19%±0.64%和20.48%±1.46%,這一結(jié)果與周素梅等[17]一致。纖維素酶能酶解麩皮細(xì)胞壁并能將與多糖連接在一起的蛋白質(zhì)游離出來(lái);稀堿溶液只能使少量的堿溶性蛋白質(zhì)游離出來(lái),且部分蛋白質(zhì)遇堿性溶液會(huì)降解成多肽或短肽類(lèi)物質(zhì)。因此,酶提法粗多糖中蛋白質(zhì)含量最多,堿提法粗多糖中蛋白質(zhì)含量最低,酸提和水提粗多糖蛋白質(zhì)含量相當(dāng)。

圖3 不同提取方法下小麥麩皮多糖蛋白質(zhì)含量的比較Fig.3 The protein content of wheat bran polysaccharides by different extraction methods

2.4 小麥麩皮粗多糖的單糖組分分析

根據(jù)各色譜峰與混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰的保留時(shí)間對(duì)照,由圖4可知,四種不同提取方法提取的小麥麩皮多糖主要是由阿拉伯糖、木糖及葡萄糖組成的雜多糖。依據(jù)氣相色譜面積歸一化方法分析[18]得四種不同提取方法所得小麥麩皮多糖的單糖組分含量,酸提法小麥麩皮多糖的阿拉伯糖、木糖及葡萄糖含量摩爾比為0.43∶0.40∶0.10;堿提法小麥麩皮多糖的阿拉伯糖、木糖及葡萄糖含量摩爾比為0.42∶0.36∶0.08;水提法小麥麩皮多糖的阿拉伯糖、木糖及葡萄糖含量摩爾比為0.23∶0.20∶0.07;酶提法小麥麩皮多糖的單糖含量摩爾比為0.58∶0.71∶0.08。由氣相色譜面積歸一化方法分析得小麥麩皮多糖主要單糖組分是阿拉伯糖和木糖。

圖4 不同提取方法下小麥麩皮多糖單糖組分的比較Fig.4 The monosaccharide composition analysis of wheat bran polysaccharides by different extraction methods注：(a)混合單糖標(biāo)品:1:鼠李糖,2:阿拉伯糖,3:木糖,4:甘露糖,5:葡萄糖,6:半乳糖;(b)酸法提單糖組分分析;(c)堿法提單糖組分分析;(d)水法提單糖組分分析;(e)酶法提單糖組分分析。

2.5 小麥麩皮殘?jiān)奈⒂^形態(tài)

圖5a小麥麩皮超微粉原料存在較大塊組織,除了片狀外大部分呈棒狀且細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整表面光滑。圖5b～圖5e可見(jiàn)經(jīng)酸、堿、水、酶在相同提取條件下小麥麩皮超微粉細(xì)胞壁均有不同程度的破損且表面粗糙,組織碎片較多。其中,堿提法和酶提法對(duì)小麥麩皮細(xì)胞壁破壞程度較大,這是由于堿(NaOH)能夠打斷多糖與纖維素、半纖維素等以阿魏酸連接的共價(jià)酯鍵;纖維素酶在很大程度上破壞了纖維素的結(jié)構(gòu),使細(xì)胞壁的致密結(jié)構(gòu)變得松散。這證明了不同提取方法下小麥麩皮多糖得率與小麥麩皮結(jié)構(gòu)被破壞的程度有關(guān)。

圖5 不同提取方法下小麥麩皮殘?jiān)奈⒂^形態(tài)比較(8000×)Fig.5 The effect of different extraction methods on the microstructure of wheat bran(8000×)注:a:小麥麩皮超微粉;b:經(jīng)酸提取后小麥麩皮超微粉;c:經(jīng)堿提取后小麥麩皮超微粉; d:經(jīng)水提取后小麥麩皮超微粉;e:經(jīng)酶提取后小麥麩皮超微粉。

2.6 小麥麩皮多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞的影響

2.6.1 小麥麩皮多糖的細(xì)胞毒性 如圖6可知,各樣品處理組細(xì)胞存活率與空白對(duì)照組相比較差異不顯著。不同提取方法所得小麥麩皮多糖在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯的毒性作用。

圖6 不同提取方法提取的小麥麩皮多糖 對(duì)RAW264.7細(xì)胞毒性影響Fig.6 The cytotoxicity of wheat bran polysaccharides by different extraction methods on RAW264.7 cells

2.6.2 小麥麩皮多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌NO的影響 如圖7所示,空白對(duì)照組RAW264.7巨噬細(xì)胞上清液中僅含少量的NO,經(jīng)不同濃度小麥麩皮多糖刺激后,各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量較空白對(duì)照組顯著提高(p<0.05)。

圖7 不同提取方法提取的小麥麩皮多糖 對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌NO的影響Fig.7 The nitric oxide inhibitory effect of wheat bran polysaccharides by different extraction methods on RAW264.7 cells

不同提取方法所得小麥麩皮多糖在一定濃度和作用時(shí)間范圍內(nèi)均可顯著促進(jìn)(p<0.05)RAW264.7細(xì)胞NO的分泌,具有激活巨噬細(xì)胞的功能。其中水提取法和酶提取法所得小麥麩皮多糖對(duì)巨噬細(xì)胞分泌NO因子的功能強(qiáng)于酸提法和堿提法。這是由于相同提取條件酸堿提取劑提取的多糖粘度較高,溶解度較差且多糖結(jié)構(gòu)在一定程度上也遭到破壞,不利于多糖生物活性的發(fā)揮繼而影響巨噬細(xì)胞分泌NO因子。

2.6.3 不同提取方法小麥麩皮多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞COX-2和iNOS蛋白表達(dá)的影響 如圖8,Western Blot結(jié)果顯示,正常對(duì)照組中,iNOS和COX-2蛋白不表達(dá)。不同提取方法所得小麥麩皮多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞COX-2和iNOS蛋白表達(dá)從高到低依次為:水提法>酶提法>酸提法=堿提法,其中酸提法和堿提法所得多糖對(duì)iNOS和COX-2蛋白不表達(dá),水提法和酶提法小麥麩皮多糖可以上調(diào)iNOS和COX-2的蛋白表達(dá)水平且水提法效果強(qiáng)于酶提法。這是由于相同提取條件下酸堿作為多糖提取劑,所得多糖溶解度低,粘度較高且部分多糖由于酸堿作用其結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變,不利于其免疫活性的發(fā)揮;其次,相同提取條件下水作為提取劑提取的多糖,溶解度較大,分子量降低,粘度減小,大量的活性基團(tuán)暴露出來(lái)有利于小麥麩皮多糖發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)的生物活性,Hromádková等[19]的研究結(jié)果表明分子量較低,水溶性好的麥麩麩皮多糖的生物活性較高,這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。因此,水提法小麥麩皮多糖能夠有效刺激RAW264.7細(xì)胞并使其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的生物活性作用。

圖8 不同提取方法提取的小麥麩皮多糖 對(duì)RAW264.7細(xì)胞COX-2和iNOS蛋白表達(dá)的影響Fig.8 The protein COX-2 and iNOS expression of RAW 264.7 cells in present of wheat bran polysaccharides by different extraction methods

3 結(jié)論

在本研究中,采用了四種提取方法對(duì)小麥麩皮多糖的提取率、化學(xué)組分及生物活性進(jìn)行了比較。結(jié)果表明:四種不同提取方法得到的粗多糖得率、化學(xué)組分及生活性方面均存在差異性。其中堿提法粗多糖得率及多糖含量最高(是水提法的1.7倍),酶提法次之。小麥麩皮多糖化學(xué)組分的測(cè)定結(jié)果表明:相同提取條件下堿提法所得糖醛酸和硫酸根含量從高到低:堿提法>酶提法>酸提法>水提法。這是由于同等提取條件下稀堿溶液使大量的酸性多糖溶于稀堿溶液且稀堿溶液能使小麥麩皮細(xì)胞壁致密結(jié)構(gòu)變得疏松,打斷了葡萄糖醛酸與半纖維素之間分子的連接,從而使糖醛酸溶于稀堿溶液中,堿提法提取小麥麩皮中酸性多糖主要含有糖醛酸和硫酸根等酸性基團(tuán),故堿提法得到糖醛酸和硫酸根含量最高[20]。此外,電鏡掃描結(jié)果顯示:不同提取方法相同提取條件下纖維素酶對(duì)小麥麩皮細(xì)胞壁的破壞程度較其他提取工藝破壞程度大,幾乎看不到完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和組織碎片。

MTT法檢測(cè)得不同提取方法提取的小麥麩皮多糖對(duì)巨噬細(xì)胞無(wú)毒性作用。Griess法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明四種不同提取工藝所得小麥麩皮多糖對(duì)巨噬細(xì)胞分泌NO因子具有促進(jìn)作用,其中酶提法和水提法所得麩皮多糖對(duì)RAW264.7分泌NO作用效果更為明顯,由此可得,不同提取方法提取的小麥麩皮多糖具有激活巨噬細(xì)胞的功能;Western Blot 檢測(cè)結(jié)果顯示水提法和酶提法所得小麥麩皮多糖能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞iNOS和COX-2的蛋白表達(dá)且水提法多糖生物活性效果強(qiáng)于酶提法多糖。綜上所述,不同提取方法對(duì)小麥麩皮多糖的化學(xué)組分及生物活性之間的比較,可為未來(lái)小麥麩皮的開(kāi)發(fā)利用研究提供一定的理論依據(jù)。