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(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

脂肪組織是機(jī)體重要的能量代謝器官,分為白色脂肪和棕色脂肪,白色脂肪主要用來(lái)儲(chǔ)存能量,棕色脂肪則可直接消耗能量產(chǎn)熱[1]。皮下脂肪、內(nèi)臟脂肪和尾部脂肪都屬于白色脂肪組織。脂肪組織還可以分泌激素和細(xì)胞因子,參與調(diào)控機(jī)體的生理與病理,包括Ⅱ型糖尿病、肥胖等[2-3]。同時(shí),羊肉特有的膻味還與脂肪組織有關(guān),脂肪中與膻味有關(guān)的化合物會(huì)在加熱過(guò)程中釋放,產(chǎn)生使人感覺(jué)到不愉快的氣味[4]。蘇尼特羊?yàn)閮?nèi)蒙古獨(dú)特的優(yōu)良羊種,其蛋白質(zhì)含量高,富含人體所需的各種氨基酸和脂肪酸,具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值且膻味輕。

目前在肉用家畜研究領(lǐng)域,選擇性脂肪沉積是一個(gè)較新的思路。在家畜生產(chǎn)過(guò)程中,選擇性的脂肪沉積可以改善肉品質(zhì)量,包括多汁性,嫩度,風(fēng)味等。影響脂肪沉積的因素包括遺傳、飼養(yǎng)以及環(huán)境等。通過(guò)脂肪沉積調(diào)控可提高肌肉中脂肪含量,改善肉質(zhì)。不同脂肪組織間,細(xì)胞代謝和遺傳機(jī)制存在差異。比如豬內(nèi)臟脂肪細(xì)胞增殖速度比其他脂肪細(xì)胞慢[5]。LPL和激素敏感性酯酶(HSL)可調(diào)控脂肪組織分解產(chǎn)生脂肪酸。有研究發(fā)現(xiàn),豬皮下脂肪組織中LPL基因高表達(dá)能夠顯著增加脂肪酸沉積[6]。SCD是催化飽和脂肪酸合成單不飽和脂肪酸的關(guān)鍵酶,可影響脂肪組織中脂肪酸的構(gòu)成[7-9]。目前脂肪沉積機(jī)制在豬和牛中研究較多,而羊中脂肪部位脂肪酸沉積順序相關(guān)研究較少。

本研究以蘇尼特羊不同脂肪組織為實(shí)驗(yàn)材料,分析不同脂肪組織中脂肪酸和脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)的差異性,旨在得到蘇尼特羊脂肪沉積規(guī)律和脂肪沉積調(diào)控機(jī)制,提高脂肪的利用率,同時(shí)對(duì)提高蘇尼特羊這一內(nèi)蒙古特色肉羊品種的保護(hù)和利用具有實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘇尼特羊 12月齡,共12只,公母各6只,內(nèi)蒙古烏拉特中旗牧區(qū);三氯甲烷(分析純)、正己烷(色譜純)、三氟化硼-乙醚絡(luò)合物(分析純)、氯化鈉(分析純)、氫氧化鈉(分析純)、無(wú)水硫酸鈉(分析純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;37種脂肪酸甲酯的混標(biāo) Sigma公司;RNAiso Plus、6×loading buffer、Marker DL2000、Premix Taq? Version2.0、PremeScriPtTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR? Premix Ex TaqTM大連寶生物工程有限公司。

Trace 1300氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 賽默飛世爾科技公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;CFX96TMReal-TimePCR儀 美國(guó)Bio-rad;普通PCR儀 美國(guó)APPlied Biosystems(AB);5810R低溫離心機(jī) Eppendorf生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 屠宰后,取皮下脂肪,尾部脂肪和腎臟脂肪20 g于-20 ℃保藏,用于脂肪酸分析。采集相同的脂肪組織2 g于2 mL無(wú)菌無(wú)酶凍存管中,液氮保存,置于-80 ℃冰箱保藏,用于基因表達(dá)量分析。

1.2.2 脂肪組織中脂肪酸的測(cè)定

1.2.2.1 脂肪酸的提取 根據(jù)Folch等[10]的方法進(jìn)一步調(diào)整:稱取1 g已均質(zhì)脂肪組織加入氯仿-甲醇混合液(2∶1)振搖2 h,浸泡8 h后用G3漏斗過(guò)濾,濾液中加入5 mL 20%氯化鈉溶液,靜止分層,下層的氯仿層即為脂肪提取液。通過(guò)無(wú)水硫酸鈉脫水后,40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到脂肪。然后加入0.5 mol/L的氫氧化鈉甲醇溶液5 mL,70 ℃下回流5 min,進(jìn)行脂肪皂化,隨后加入5 mL的三氟化硼乙醚溶液,70 ℃下回流2 min,進(jìn)行脂肪甲酯化。最后加入2 mL色譜純正己烷,70 ℃下回流1 min后,加入5 mL飽和NaCl溶液,靜置10 min,吸取出1 mL正己烷層于進(jìn)樣瓶中,用0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后,進(jìn)行氣相色譜分析。

1.2.2.2 氣相色譜條件 氣相色譜條件:色譜柱:反式色譜柱(100 m×0.25 mm×0.20 μm),載氣為氦氣,載氣流速為1 mL/min,進(jìn)樣口溫度:240 ℃,進(jìn)樣量為1 μL,分流比為100∶1。采用程序升溫,初始溫度為60 ℃,保持1 min,然后以20 ℃/min的速度升至120 ℃,保持1 min;然后以5 ℃/min的速度升至240 ℃,保持15 min。

MS條件:離子源溫度為300 ℃,傳輸線溫度240 ℃,質(zhì)量掃描范圍50～500 (m/z),溶劑延遲時(shí)間:4 min。

樣品中脂肪酸根據(jù)37種脂肪酸混標(biāo)來(lái)定性,再通過(guò)國(guó)標(biāo)(GB/T 9695.2-2008)中定量的方法計(jì)算樣品中各脂肪酸的含量。

1.2.3 脂肪代謝基因表達(dá)量的測(cè)定

1.2.3.1 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄 RNA的提取參照miRNeasy Mini Kit(50)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,進(jìn)一步用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度(A260 nm/A280 nm)及濃度,并通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量;將RNA 樣品稀釋為統(tǒng)一濃度500 ng/μL。使用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimerScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser)兩步法將RNA樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA,在-20 ℃冰箱內(nèi)保存待用。

1.2.3.2 引物設(shè)計(jì) 基因引物序列由華大基因設(shè)計(jì)并合成,β-actin作為管家基因。序列如表1所示。

表1 實(shí)時(shí)定量引物Table 1 Primers of real-time PCR

1.2.3.3 實(shí)時(shí)定量PCR 參照TaKaRa SYBR? Premix Ex TaqTMII試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。實(shí)時(shí)定量PCR 反應(yīng)體系和擴(kuò)增反應(yīng)條件見(jiàn)文獻(xiàn)[11]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)時(shí)定量PCR數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法,數(shù)據(jù)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件單因素方差分析(ANOVA LSD),Duncan多重比較和雙變量相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同脂肪組織中飽和脂肪酸差異性分析

由表2所示,蘇尼特羊脂肪組織中飽和脂肪酸主要以肉豆蔻酸、棕櫚酸和硬脂酸為主,約占總脂肪酸的51.9%～62.7%。皮脂中辛酸、癸酸和月桂酸的含量顯著高于尾脂和腎脂(p<0.05),這與剛虎軍等[12]對(duì)南疆多浪羊的結(jié)果一致。不同脂肪組織中,肉豆蔻酸的含量差異顯著(p<0.05),皮脂最高,尾脂最低。腎脂中硬脂酸的含量顯著高于尾脂(p<0.05),且硬脂酸與羊肉膻味有關(guān),特別是當(dāng)皮脂中硬脂酸含量高時(shí)會(huì)造成羊肉膻味的加重。李維紅等[13]也表明尾部脂肪中硬脂酸最少,膻味最小。

對(duì)于反芻動(dòng)物來(lái)說(shuō),部分中長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸產(chǎn)生可能是瘤胃微生物中一些具有氫化作用的細(xì)菌可以將大部分多不飽和脂肪酸(多為12碳以上)氫化所致,并沉積于脂肪組織中,成為脂肪組織的主要成分,并對(duì)畜肉產(chǎn)品的風(fēng)味產(chǎn)生重要影響[14-15]。

2.2 不同脂肪組織中不飽和脂肪酸差異性分析

由表3可知,蘇尼特羊脂肪組織中單不飽和脂肪酸主要以棕櫚油酸和油酸為主,約占總脂肪酸的27.3%～41.7%。不同脂肪組織中,皮脂中棕櫚油酸含量顯著高于尾脂和腎脂(p<0.05);尾脂中油酸含量顯著高于皮脂和腎脂(p<0.05),這一結(jié)果與雙金等[16]的研究一致。

表3 蘇尼特羊不同脂肪組織中不飽和脂肪酸的差異分析(g/100 g)Table 3 Variation analysis of the contents of unsaturated fatty acid in different adipose tissue of Sunit sheep(g/100 g)

蘇尼特羊脂肪組織中多不飽和脂肪酸主要以亞油酸和亞麻酸為主,約占總脂肪酸的5.6%～13.1%。皮脂的亞油酸的含量顯著高于尾脂和腎脂(p<0.05),這與孟影[17]的研究結(jié)果不一致;亞麻酸的含量顯著高于尾脂(p<0.05)。亞油酸和亞麻酸作為風(fēng)味前體物可氧化還原生成醛、酮類物質(zhì),對(duì)羊肉風(fēng)味的形成起重要作用,比如己醛主要來(lái)源于亞油酸的自氧化[18]。但皮脂的共軛亞油酸的含量顯著低于尾脂和腎脂(p<0.05)。研究表明共軛亞油酸和亞麻酸具有抗動(dòng)脈粥樣硬化,抗腫瘤等重要生理作用[19]。EPA和DHA屬于n-3系脂肪酸,腎脂中EPA的含量顯著高于皮脂和尾脂(p<0.05),但皮脂中DHA的含量顯著高于尾脂(p<0.05)。

2.3 蘇尼特羊脂肪組織中總脂肪酸差異性比較

由表4可知,蘇尼特羊脂肪組織中脂肪酸主要以飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸為主,約占88.1%～93.5%。腎脂和皮脂中飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸顯著大于尾脂(p<0.05),但單不飽和脂肪酸含量顯著小于尾脂(p<0.05),這可能是由于脂肪酸來(lái)源部位特異性所致[20]。Alves等[21]研究發(fā)現(xiàn)綿羊脂肪組織中脂肪酸的組成以油酸、棕櫚酸和硬脂酸為主,占總脂肪酸的66.6%,并參與到甘油三酯的合成。Sebastien等[22]研究發(fā)現(xiàn)羔羊脂肪組織飽和脂肪酸和單不飽和脂肪含量占總脂肪酸的87%,本試驗(yàn)與以上研究結(jié)果較一致。

表4 蘇尼特羊不同脂肪組織中總脂肪酸的差異分析(g/100 g)Table 4 Variation analysis of the contents of fatty acid in different adipose tissue of Sunit sheep(g/100 g)

2.4 不同脂肪組織中脂肪代謝基因表達(dá)量差異性分析

動(dòng)物脂肪中脂肪酸沉積主要來(lái)源于脂肪酸的從頭合成反應(yīng),而脂肪酸合成需要FASN催化乙酰輔酶A和丙二單酰輔酶A來(lái)完成,通過(guò)調(diào)控FASN的表達(dá)調(diào)控可以用來(lái)調(diào)控動(dòng)物脂肪沉積[23]。由表5可知,腎脂中FASN基因表達(dá)量顯著高于皮脂和尾脂(p<0.05),這表明腎臟脂肪沉積優(yōu)于皮脂和尾脂沉積。脂肪組織在不同部位沉積的數(shù)量存在著差異,可能是調(diào)控不同部位脂肪組織的FASN基因在序列的啟動(dòng)時(shí)間和空間上存在著差異所致[23]。

表5 蘇尼特羊不同脂肪組織中 脂肪代謝基因表達(dá)量的差異性分析Table 5 Analyze differentially of the gene expression of fat metabolismin different adipose tissue of Sunit sheep

LPL能夠?qū)⒀褐腥槊游⒘：蜆O低密度脂蛋白所攜帶的甘油三酯分解成甘油和脂肪酸,向有關(guān)組織提供合成甘油三酯所需的原料,對(duì)脂肪沉積起著重要的調(diào)控作用[24]。由表5可知,不同脂肪組織間LPL基因表達(dá)量差異顯著(p<0.05),腎脂最高,尾脂最低。Castro等[25]研究發(fā)現(xiàn),LPL基因表達(dá)量在不同脂肪組織中存在差異且在脂肪組織中基因表達(dá)量高于肌內(nèi)脂肪并在腎脂中最高,這與本研究結(jié)果一致。

ACC是催化動(dòng)物脂肪合成的限速酶,也是長(zhǎng)鏈脂肪酸合成時(shí)的限速酶[26]。由表5可知,皮脂中ACC基因表達(dá)量顯著高于腎脂(p<0.05)。CPT1作為機(jī)體脂肪酸β氧化,轉(zhuǎn)運(yùn)長(zhǎng)鏈脂肪酸進(jìn)入線粒體的限速酶,主要依賴丙二酰輔酶A進(jìn)行調(diào)節(jié)[27]。皮脂中CPT1基因表達(dá)量顯著高于尾脂和腎脂(p<0.05)。

由表5可知,腎脂中SCD基因表達(dá)量顯著高于其他兩個(gè)部位(p<0.05),而不同脂肪組織間氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)和脂肪酸脫氫酶(FADS1,FADS2)基因表達(dá)量差異不顯著(p>0.05)。

總體上,本研究中皮脂中ACC和CPT1基因表達(dá)高于腎脂和尾脂,可表明無(wú)論脂肪沉積還是脂肪氧化供能都從皮脂開(kāi)始,進(jìn)一步說(shuō)明皮脂可作為羊胴體肥瘦的衡量指標(biāo)。

2.5 蘇尼特羊脂肪組織中脂肪代謝基因間相關(guān)性分析

由表6可知,LPL與脂肪酸合成代謝過(guò)程中的酶類(FASN、SCD、FADS1和FADS2)呈顯著正相關(guān)(p<0.05)。LPL作為機(jī)體脂質(zhì)和脂蛋白代謝的關(guān)鍵酶,在脂肪組織中分解產(chǎn)生脂肪酸,通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入細(xì)胞膜被機(jī)體吸收。從某種意義上來(lái)說(shuō),LPL基因的高表達(dá)有利于脂肪酸合成過(guò)程的進(jìn)行。FADS1和FADS2間呈極顯著正相關(guān)(p<0.001),這表明FADS1和FADS2有協(xié)同促進(jìn)的作用,與梅秀麗等[28]的研究一致。FASN酶與脂肪酸脫氫酶(FADS1、FADS2)呈顯著正相關(guān),這表明FASN與FADS1、FADS2共同參與脂肪酸的合成。由表6可知,脂肪組織中PPARγ與脂肪代謝相關(guān)基因成負(fù)相關(guān),說(shuō)明氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)參與調(diào)控許多啟動(dòng)脂肪合成和沉積基因的表達(dá),從而導(dǎo)致脂肪細(xì)胞的分化和脂肪的生成[29]。

2.6 蘇尼特羊脂肪組織中脂肪代謝基因與脂肪酸相關(guān)性分析

由表7可知,FADS1與共軛亞油酸呈顯著正相關(guān)(p<0.05),與C20∶5間呈極顯著正相關(guān)(p<0.01);FADS2與C18∶2,C18∶3和C20∶5之間呈顯著正相關(guān)(p<0.05);SCD與共軛亞油酸呈顯著正相關(guān)(p<0.05);LPL與亞麻酸,共軛亞油酸和C20∶5間呈顯著正相關(guān)(p<0.05)。脂肪酸脫氫酶(FADS1、FADS2)是多不飽和脂肪酸合成過(guò)程的關(guān)鍵酶和限速酶,其酶活性直接影響多不飽和脂肪酸的合成[30]。本實(shí)驗(yàn)研究表明FADS1和FADS2可能參與C20∶5的合成,這與之前的研究結(jié)果一致[31]。

表7 蘇尼特羊脂肪組織中脂肪代謝基因與脂肪酸相關(guān)性分析Table 7 Analyze correlation between fat metabolism gene and fatty acid in adipose tissue of Sunit sheep

SCD為參與單不飽和脂肪酸的生物合成關(guān)鍵酶[32],且脂肪組織中油酸的含量較高,推測(cè)SCD對(duì)油酸的合成有一定的促進(jìn)作用。Madhu等[33]還研究表明SCD在共軛亞油酸的合成過(guò)程中起重要作用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明SCD基因的高表達(dá)有利于共軛亞油酸的合成(r=0.581,p=0.032)。

LPL是脂肪分解的關(guān)鍵酶,這些酶通過(guò)調(diào)控體內(nèi)甘油三酯的水解,來(lái)降低體脂合成和沉積,本試驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)LPL基因表達(dá)量高時(shí)會(huì)增加脂肪組織中多不飽和脂肪酸含量。FADS2與C18∶1間呈顯著負(fù)相關(guān)(p<0.05)。

ACC與共軛亞油酸和C20∶5間呈顯著負(fù)相關(guān)(p<0.05)。脂肪組織中FADS2基因表達(dá)量高時(shí)會(huì)抑制C18∶1的生成,而ACC是脂肪酸合成的限速酶,可能會(huì)抑制多不飽和脂肪酸(共軛亞油酸、C20∶5)的生成。

3 結(jié)論

蘇尼特羊脂肪組織中脂肪酸的組成主要以硬脂酸,棕櫚酸和油酸為主;腎脂中硬脂酸C18∶0的含量顯著高于尾脂(p<0.05);尾脂中C18∶1含量顯著高于皮脂和腎脂(p<0.05)。不同脂肪組織間脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)量差異性分析發(fā)現(xiàn),腎脂中SCD、LPL和FASN基因表達(dá)量顯著高于皮脂和尾脂(p<0.05);皮脂中CPT1和ACC基因表達(dá)量顯著高于腎脂(p<0.05)。分析不同脂肪組織中脂肪酸和脂肪代謝基因表達(dá)的差異,可推測(cè)出調(diào)控脂肪代謝基因表達(dá)可能是改善脂肪沉積的一個(gè)途徑。

脂肪酸與脂肪代謝基因表達(dá)量相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),CLA與FADS1、LPL和SCD呈顯著正相關(guān)(p<0.05);C20∶5與FADS1和LPL間呈顯著正相關(guān)(p<0.05),與ACC呈顯著負(fù)相關(guān)(p<0.05)。因此,上調(diào)FADS1和LPL基因的表達(dá),有利于CLA和C20∶5的沉積;而下調(diào)FADS2和ACC基因的表達(dá),有利于C18∶1和C20∶5的沉積。