關(guān)樺楠，宋巖，龔德狀，韓博林，劉曉飛，張娜

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150076）

近年來(lái)，伴隨高新分子學(xué)技術(shù)理論的更新、多功能納米材料的介入、以及高靈敏度電化學(xué)等有效手段的開發(fā)，基于電信號(hào)傳感體系的相關(guān)檢測(cè)技術(shù)也獲得了極大的發(fā)展。其原理是電化學(xué)生物傳感器的換能元件（電極），將識(shí)別到的目標(biāo)物質(zhì)，在電極表面形成特異性雜交，將雜交信息轉(zhuǎn)化為電流、電位、電導(dǎo)或電阻等特征檢測(cè)信號(hào)輸出，從而將信息轉(zhuǎn)換成可測(cè)量信號(hào)[1]。電化學(xué)傳感器具有儀器簡(jiǎn)便、成本低廉、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、靈敏度高和特異性好等特點(diǎn)，以其智能化、微型化、便攜化的優(yōu)點(diǎn)已發(fā)展為一種較為理想的快速檢測(cè)體系[2-3]。

目前，在傳統(tǒng)食源性有害微生物的檢測(cè)過(guò)程中，普遍存在著操作過(guò)程繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，檢測(cè)靈敏度不高，檢測(cè)專一性不強(qiáng)，檢測(cè)成本過(guò)高的缺陷。與此同時(shí)，電化學(xué)型生物傳感器在檢測(cè)食源性致病菌的過(guò)程中，以其高特異性和高精確度，實(shí)現(xiàn)了低成本高效實(shí)時(shí)檢測(cè)有害微生物的目標(biāo)。因此，電化學(xué)生物傳感器已成為用來(lái)鑒定和定量檢測(cè)食源性致病菌的一條有效途徑，并在食品安全監(jiān)管和疾病的預(yù)防控制等方面具有廣泛的應(yīng)用前景[4]。該文綜述了近年來(lái)電化學(xué)生物傳感器在檢測(cè)食源性致病菌領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展并對(duì)其發(fā)展方向進(jìn)行展望。

1 檢測(cè)食源性致病菌及其毒素的電化學(xué)生物傳感器的分類

電化學(xué)生物傳感器是識(shí)別并轉(zhuǎn)換生物分子信息信號(hào)為電信號(hào)的一種分析檢測(cè)裝置，主要由兩部分組成：生物感受器和換能器。生物感受器識(shí)別生物分子，由具有分子識(shí)別功能的生物受體或識(shí)別靶分析物的生物識(shí)別元件構(gòu)成，生物受體主要包括微生物、組織、細(xì)胞、細(xì)胞器、抗體抗原、酶、核酸等。生物受體接受對(duì)應(yīng)生物響應(yīng)，或識(shí)別元件識(shí)別靶分析物，通過(guò)換能器等轉(zhuǎn)換元件將其轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，再通過(guò)信號(hào)放大元件將輸入的信號(hào)轉(zhuǎn)換為大的包含基本特征的可測(cè)量電信號(hào)，最后將擴(kuò)增后的信號(hào)分析處理[5]。

檢測(cè)食源性致病菌的電化學(xué)生物傳感器以生物感受器或換能器不同類型下的各子類而分類[4-5]。按生物感受器的識(shí)別元件通常被分為四大類，主要包括抗原/抗體、酶、核酸和噬菌體；按換能器轉(zhuǎn)換信號(hào)的類型可分為：光學(xué)、電化學(xué)、質(zhì)量敏感型；其中光學(xué)傳感器又可分為表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）、光纖、拉曼光譜輔助類型[6]；根據(jù)最終測(cè)量信號(hào)的不同可分為，電流型、電阻型、電導(dǎo)型和電位型。在實(shí)際應(yīng)用中稱為電流型電化學(xué)生物傳感器、阻抗型電化學(xué)生物傳感器、電導(dǎo)型電化學(xué)生物傳感器、電勢(shì)型電化學(xué)生物傳感器[7]。

2 不同類型電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)食源性致病菌及其毒素的進(jìn)展

2.1 電流型生物傳感器在檢測(cè)食源性致病菌及其毒素中的應(yīng)用

電流型電化學(xué)生物傳感器也被稱為安培型電化學(xué)生物傳感器，是化學(xué)傳感器最常采用的一種類型，它的檢測(cè)原理是當(dāng)工作電極的電位設(shè)定在一定值時(shí)，被測(cè)物在電極表面或其修飾層內(nèi)氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生電流，從而可以通過(guò)生成的電流隨時(shí)間的變化來(lái)定量分析生物電化學(xué)反應(yīng)中的電活性物質(zhì)[8]。近年來(lái)，電流型電化學(xué)生物傳感器通過(guò)制備免疫復(fù)合物或與其他免疫分離技術(shù)相結(jié)合，縮短檢測(cè)時(shí)間，降低檢測(cè)限，與傳統(tǒng)方法相比誤差小，具有良好的可操作性。王澤華等[9]制備了電沉積納米金修飾的16 通道電流型前列腺特異抗原（prostate specific antigen，PSA）免疫傳感器，降低了成本，簡(jiǎn)化預(yù)處理過(guò)程，獲得良好的特異性和重現(xiàn)性。

在食源性致病菌檢測(cè)的應(yīng)用中，郭燕等[10]為實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確的檢測(cè)致奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌（S.aureus），優(yōu)化培養(yǎng)物中葡萄糖的制備條件，研制對(duì)目標(biāo)菌具有嚴(yán)格選擇性的培養(yǎng)基，適用于電流型葡萄糖傳感器?；谄淞己玫目垢蓴_能力和穩(wěn)定性，為基層奶牛場(chǎng)提供快速可靠的初步診斷。在檢測(cè)黃曲霉毒素（aflatoxin B1，AFB1）的應(yīng)用中，基于免疫分析方法將抗原與牛血清蛋白的結(jié)合物（bovine serum albuminaflatoxin B1，BSA-AFB1）或抗體固定在修飾電極表面，有時(shí)需要使用酶標(biāo)記物堿性磷酸醋酶（alkaline phosphatase，ALP）和辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）[11]。在酶促反應(yīng)中，常用ALP 標(biāo)記二抗作為信號(hào)放大系統(tǒng)。待檢的游離AFB1與固定在電極表面的BSA-AFB1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗黃曲霉毒素（antibody-afla toxin B1，anti-AFB1）抗體，ALP 催化底液1-萘基磷酸鹽產(chǎn)生的響應(yīng)電流，電流隨AFB1濃度增大而減小。結(jié)果表明在實(shí)際操作中，大麥樣品的背景信號(hào)要大于在AFB1標(biāo)準(zhǔn)液中的信號(hào)，所以基質(zhì)效應(yīng)是實(shí)際樣品檢測(cè)中需要克服的問(wèn)題。而釆取類似方法，使用多個(gè)電極或含有多個(gè)電極的多孔微板形成的傳感器陣列分析在實(shí)際玉米樣品中的檢測(cè)性能，開展多樣品同時(shí)在線測(cè)定，可以效率并節(jié)約成本[11]。與此同時(shí)，部分研究利用了黃曲霉毒素氧化還原酶（aflatoxin-oxidase，AFO）的催化氧化作用或黃曲霉毒素對(duì)乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）的活性抑制作用，但檢測(cè)效果不理想，如果想進(jìn)一步降低檢測(cè)限，提高靈敏度，必須對(duì)測(cè)試液進(jìn)行預(yù)濃縮處理[12]。

Chen 等[13]研制了一種新型的基于三維石墨烯（3D G）結(jié)構(gòu)的金納米顆粒修飾的電化學(xué)DNA 生物傳感器。采用自行設(shè)計(jì)的生物捕獲探針對(duì)異化亞硫酸鹽還原酶（dissimilatory sulfite reductase，DsrAB）基因進(jìn)行識(shí)別，可檢測(cè)多種食源性致病菌。此類含有3D G 的金納米粒子可參與食源性致病菌的富集識(shí)別探針的構(gòu)建。該類型電化學(xué)生物傳感器具有較大的比表面積，顯著提高了檢測(cè)體系的響應(yīng)電流值，進(jìn)而改善了檢測(cè)有害微生物體系的靈敏度，見圖1。

圖1 寡核苷酸序列電化學(xué)生物傳感器的制作原理Fig.1 Fabrication principle of oligonucleotide sequence electrochemical biosensor

由圖1可知，首先制備3D G 修飾的金米（3D GAuNPs），經(jīng)超聲處理后，在分散體上與苯酚充分混合；將制備的混合物涂于玻碳電極（glassy carbon electrode，GCE）?；贏u 鍵和靜電相互作用，采用滴涂法將捕獲探針（capture probe，CP），與3D G-AuNPs 進(jìn)行免疫交聯(lián)反應(yīng)，構(gòu)建修飾電極CP/3D G-AuNPs/GCE；靶標(biāo)DNA 樣品與亞甲基藍(lán)（MB）相互作用并在CP/3D G-AuNPs/GCE 表面產(chǎn)生電流響應(yīng)。在優(yōu)化條件下，該傳感器靈敏度高，檢測(cè)限可達(dá)9.41×10-15mol/L。

2.2 阻抗型生物傳感器在檢測(cè)食源性致病菌及其毒素中的應(yīng)用

阻抗型電化學(xué)生物傳感器主要是通過(guò)檢測(cè)電極表面發(fā)生微生物繁殖代謝轉(zhuǎn)化為電活性物質(zhì)的生物識(shí)別反應(yīng)引起電極表面阻值的變化來(lái)測(cè)量分析物。電化學(xué)阻抗譜（electrochemical impedance spectroscopy，EIS）是研究傳感界面電特性并跟蹤界面反應(yīng)，研究電極系統(tǒng)以及測(cè)定固體電解質(zhì)電導(dǎo)率的一種電化學(xué)測(cè)量方法，可以檢測(cè)電極表面的電子傳遞阻抗，觀察生物分子間相互作用的動(dòng)力學(xué)，被廣泛應(yīng)用于電化學(xué)傳感器的開發(fā)[14]。電化學(xué)阻抗是一種新的電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)，近年來(lái)開發(fā)了基于生物識(shí)別特異性來(lái)利用電化學(xué)阻抗來(lái)檢測(cè)致病菌的方法。根據(jù)電極表面固定受體的不同可以將阻抗生物傳感器分為四類，分別為免疫型、核酸型、噬菌體型和凝集素型[15-16]。

電化學(xué)阻抗技術(shù)應(yīng)用于食源性致病菌的定量檢測(cè)中一般不需要標(biāo)記物?；诳乖?抗體的免疫反應(yīng)導(dǎo)致電極表面阻抗值變化的原理，Zhou 等[17]使用電沉積法制備出一種修飾在金電極表面復(fù)合物膜，將anti-AFB1抗體固定在微電極表面，可應(yīng)用于病原菌（如大腸桿菌和沙門氏菌）的快速檢測(cè)。而類似的檢測(cè)方法也可采用溶膠凝膠法和離子液生物相容性膜固定抗體，可以增強(qiáng)電極表面的導(dǎo)電性，提高靈敏度。核酸生物傳感器使核酸在高濃度合成過(guò)程中修飾官能團(tuán)，固定在電極表面，應(yīng)用于細(xì)菌檢測(cè)[18]。Kara 等[19]基于此方法檢測(cè)芽孢桿菌炭疽，靈敏度高。噬菌體生物傳感器因噬菌體可溶解細(xì)菌，特異性強(qiáng)，應(yīng)用于細(xì)菌的檢測(cè)。Arghavan 等[20]用此方法檢測(cè)大腸桿菌，大腸桿菌濃度為102cfu/mL～108cfu/mL 時(shí)測(cè)得的阻抗值隨著細(xì)菌濃度的增大而減小，凝集素生物傳感器以凝集素為生物受體與細(xì)菌表面的單糖或多糖結(jié)合以捕獲細(xì)菌。Gamella 等[21]用阻抗免標(biāo)記法檢測(cè)大腸桿菌，線性范圍為5.0×103cfu/mL～5.0×107cfu/mL。

Tokonami 等設(shè)計(jì)了一種具有代表性的基于T4 噬菌體的阻抗生物傳感器用于大腸桿菌的檢測(cè)[22]。結(jié)果表明，隨著大腸桿菌濃度的增加，電荷轉(zhuǎn)移抗性增強(qiáng)。既可以歸因于噬菌體修飾的細(xì)菌被束縛在表面，也可以歸因于大腸桿菌表面（帶負(fù)電）和離子氧化還原探針之間的靜電相互作用，此類型傳感器構(gòu)建原理見圖2。從圖2可知，首先將巰基乙胺組裝在金電極上（A）；其次，使用1，4-二硫氰酸酯作為介質(zhì)進(jìn)行交聯(lián)（B）；采用乙醇胺對(duì)T4 噬菌體進(jìn)行固定化和阻斷（C），捕獲大腸桿菌細(xì)胞（D），基于阻抗/線性放大雙重反應(yīng)對(duì)大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)（E）。

Hoda 等研制了一種新型的用于病毒DNA 檢測(cè)的電化學(xué)生物傳感檢測(cè)裝置，利用EIS 對(duì)試驗(yàn)步驟進(jìn)行了優(yōu)化，確定了制備生物傳感器的最佳條件[23]。利用自制的生物傳感器和空白溶液的標(biāo)準(zhǔn)偏差，得到了4.7 nmol/L 的檢出限，具體構(gòu)建流程見圖3。

圖2 基于T4 噬菌體的阻抗生物傳感器構(gòu)建原理Fig.2 Construction principle of impedance biosensor based on T4 phage

圖3 電化學(xué)DNA 生物傳感器的制備原理示意圖Fig.3 Schematic diagram of preparation principle of electrochemical DNA biosensor

如圖3所示，將biao 序列固定在絲網(wǎng)印刷電極表面；再利用生物素化的靶鏈DNA 進(jìn)行雜交，制備出DNA 傳感器裝置；采用雙電位脈沖伏安法對(duì)鏈霉親和素-堿性磷酸酶標(biāo)記生物素化雜合物產(chǎn)生的阻抗進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。

2.3 電導(dǎo)型生物傳感器在檢測(cè)食源性致病菌及其毒素中的應(yīng)用

電導(dǎo)型電化學(xué)生物傳感器通過(guò)在金屬電極上施加交流電壓來(lái)產(chǎn)生電流，無(wú)需參比電極，電極表面通常被涂覆選擇性聚合物和相應(yīng)的離子載體，選擇性聚合物成膜沉積在金屬電極上，離子載體的濃度和組成的改變會(huì)引起的電極間電導(dǎo)發(fā)生變化，通過(guò)電導(dǎo)參數(shù)的變化測(cè)定被測(cè)物的濃度。電導(dǎo)型傳感器通過(guò)改變傳感器組分來(lái)優(yōu)化靈敏度，將電極作為換能器，測(cè)量膜的阻抗，阻抗值與膜接觸的樣品溶液中的離子濃度有關(guān)[24-25]。由此設(shè)計(jì)的傳感器，通過(guò)阻抗測(cè)量，驅(qū)動(dòng)電勢(shì)低，具有微型化和大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)。由于原理的相近和技術(shù)的共通點(diǎn)，電導(dǎo)型常被看作是阻抗型電化學(xué)生物傳感器的一個(gè)分支，近年來(lái)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域獲得顯著發(fā)展。針對(duì)食源性致病菌的檢測(cè)，電導(dǎo)型生物傳感器更注重電極表面修飾，降低氧化還原電勢(shì)。Liu 等[26]將anti-AFB1抗體固定在金微叉指電極表面，用辣根過(guò)氧化物酶封閉剩余的活性位點(diǎn)，測(cè)量AFB1濃度，電極表面的抗原-抗體結(jié)合物影響了HRP 對(duì)底液的催化反應(yīng)，電解質(zhì)電導(dǎo)的變化與AFB1濃度成反比。Solcktkin等[27]釆用差分模式，制備出一種基于金叉指薄膜電極和AChE 活性抑制的傳感器，催化底物水解，溶液電導(dǎo)隨電極薄膜上離子濃度的變化而變化。利用此體系檢測(cè)黃曲霉毒素B1，檢出限達(dá)到0.05 μg/mL。

2.4 電勢(shì)型生物傳感器在檢測(cè)食源性致病菌及其毒素中的應(yīng)用

電勢(shì)型電化學(xué)傳感器通過(guò)檢測(cè)工作電極和參比電極之間電流為零時(shí)的電勢(shì)變化與電化學(xué)反應(yīng)中離子活性的關(guān)系來(lái)測(cè)量分析物的濃度，基于生物電識(shí)別分析，結(jié)合多電極接口陣列，可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)。在實(shí)際應(yīng)用中，通常與免疫分析方法相結(jié)合[28]。Rameil 等[29]開發(fā)了一種電位黃曲霉毒素M1免疫傳感器，該測(cè)定系統(tǒng)由多克隆anti-AFM1抗體，Ag/AgCl 參比電極和HRP-AFB1綴合物組成工作電極。利用3-（4-羥基苯基）-丙酸（p-hydroxybenzene propanoic acid，p-HPPA）作為辣根過(guò)氧化物酶的電子給體化合物（HRP），為標(biāo)記HRP 的抗原提供電子，測(cè)試底液中含有的H2O2，電勢(shì)的變化隨AFM1濃度增大而減小?；谠摲椒z測(cè)黃曲霉毒素M1，獲得了良好的線性關(guān)系和檢出限，其中檢出限達(dá)到500 pg/mL。Larou 等[30]開發(fā)了一種基于生物電識(shí)別法（bioelectric recognition assay，BERA）的快速檢測(cè)黃曲霉毒素M1的生物傳感器系統(tǒng)。通過(guò)將AFM1同源抗體電植入非洲綠猴腎細(xì)胞的細(xì)胞膜上來(lái)實(shí)現(xiàn)，銀絲工作電極和參考電極插入待測(cè)液中，AFM1與細(xì)胞膜中的抗體相互作用后使細(xì)胞膜電勢(shì)發(fā)生改變。在極低濃度5 pg/mL 下，可以實(shí)現(xiàn)在3 min 內(nèi)的快速檢測(cè)。該檢測(cè)系統(tǒng)使用多細(xì)胞電極接口陣列，允許高通量的AFM1分析，每小時(shí)可完成160 次獨(dú)立測(cè)試。

3 結(jié)論與展望

電化學(xué)生物傳感器的電極系統(tǒng)組成、電極類型和電解液構(gòu)成都關(guān)乎其靈敏度與特異性，在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上構(gòu)建新型復(fù)合生物傳感器平臺(tái)，拓寬電極修飾材料種類，是推動(dòng)其廣泛應(yīng)用的發(fā)展方向，而細(xì)致應(yīng)用分類也是需要完善的問(wèn)題。電流型傳感器發(fā)展最為成熟，但需要提高選擇性和靈敏度，減少預(yù)處理過(guò)程，才能實(shí)現(xiàn)商業(yè)化。阻抗型電化學(xué)生物傳感器雖然能比其他常規(guī)的電化學(xué)方法得到更多的電極界面結(jié)構(gòu)的信息，但在檢測(cè)低濃度微生物時(shí)成本較高，限制了其在實(shí)際中的應(yīng)用。電導(dǎo)型和電勢(shì)型傳感器由于原理與其他兩種較為相近，實(shí)際應(yīng)用中不是很廣泛。為了提高傳感器的靈敏度和特異性，可以改善電極表面微結(jié)構(gòu)，使用復(fù)合材料和納米材料。為了實(shí)現(xiàn)超靈敏和高通量，就要完善抗體制備技術(shù)。另外，為了加快傳感技術(shù)的發(fā)展，除了要融合生物醫(yī)學(xué)等新技術(shù)，還要設(shè)計(jì)開發(fā)新型傳感器，修飾電極、研發(fā)電路模型、研究多樣轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，解決傳感器壽命、不可重復(fù)、穩(wěn)定性差等問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)智能化、便攜化、商業(yè)化發(fā)展。在食品加工制造產(chǎn)業(yè)中，食源性致病菌和真菌毒素通常以非常低的濃度存在，難以檢出，因此電化學(xué)傳感器的發(fā)展可融合介質(zhì)電泳、電通透等其他技術(shù)多元化發(fā)展，探求食源性病原菌及其毒素檢測(cè)體系最優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)多重目標(biāo)檢測(cè)。電化學(xué)傳感技術(shù)的發(fā)展將為各個(gè)領(lǐng)域提供一項(xiàng)快速響應(yīng)、成本低廉、特異性強(qiáng)、靈敏度高的檢測(cè)方法。