田淑雨，鹿士峰，吳楊洋，杜秀菊

（聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東聊城252000）

靈芝（Ganoderma lucidum）又名黑芝、赤芝、紫芝、萬年蕈、靈芝草等，在分類學(xué)系統(tǒng)上隸屬于擔(dān)子菌門（Hymenomyeetes），多孔菌目（Polyporace），靈芝科（Ganodermataceae），靈芝屬（GanodermaP.Kars）[1-2]，靈芝含有多種活性物質(zhì)，主要成分包括多糖類、多肽類、三萜類物質(zhì)、生物堿、無機(jī)離子、油脂類、呋喃類、甾醇類等，對(duì)于靈芝的開發(fā)和利用可以追溯到兩千年前，據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》記載，靈芝具有延年益壽，補(bǔ)氣安神，止咳平喘等多種功效，在民間更是流傳著靈芝起死回生的神奇?zhèn)髡f[3-5]。

靈芝多糖（G.lucidumpolysaccharide，GLP）是靈芝的主要活性物質(zhì)之一，近年來，許多學(xué)者都提出靈芝多糖具有抗腫瘤[9]、抗氧化[10]、抗衰老、提高機(jī)體免疫力、提高記憶力[11]、降血糖、降血脂[12]、抗輻射[13]、抑制血栓形成、活血化瘀、抗病毒等功效[6-8]，靈芝多糖能夠有效地清除體內(nèi)羥自由基，超氧陰離子，并且具有一定的還原力，對(duì)超氧化物歧化酶也具有一定的作用[14]，已分離的靈芝200 多種，僅僅數(shù)十種結(jié)構(gòu)被報(bào)道，構(gòu)效關(guān)系不明確，且提取得率也有待提高。因此，對(duì)于靈芝的研究，也成為國(guó)內(nèi)外爭(zhēng)先恐后研究的熱點(diǎn)。毛健等[6]研究表明傳統(tǒng)提取靈芝多糖的方法操作簡(jiǎn)單，成本低，但提取時(shí)間長(zhǎng)，效率不高；超聲提取法作為一種物理破碎過程，通過超聲場(chǎng)形成局部瞬間高壓，使細(xì)胞壁和整個(gè)生物體破裂，然后產(chǎn)生的空化作用和機(jī)械作用能夠增加分子的運(yùn)動(dòng)，有利于多糖析出，操作簡(jiǎn)單，提取率高，反應(yīng)過程無物料損失，回收率相對(duì)較高[15]。

本文旨在對(duì)超聲破碎輔助提取靈芝多糖的工藝進(jìn)行優(yōu)化，獲得最優(yōu)提取方式，比較靈芝多糖的抗氧化活性，體外篩選最優(yōu)抗氧化活性部位，為靈芝的開發(fā)和利用提供科學(xué)的理論根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝：山東聊城冠縣；濃硫酸（H2SO2）、苯酚（Phenol）、磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）、 過 氧 化 氫（H2O2）、 無 水 乙 醇（CH3CH2OH）、三氯化鐵（FeCl3·6H2O）：均為分析純，萊陽經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠；DPPH：分析純Solarbio公司；抗壞血酸：天津市紅巖試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲波破碎儀（JY92-IIN 型）：寧波新芝生物科技有限公司；可見光分光光度計(jì)（WF-J2100 型）：上海尤尼柯儀器有限公司；低速離心機(jī)（LD4-2 型）：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；磁力加熱攪拌器（78-1 型）：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；循環(huán)水式多用真空泵（SHZDIII）：鄭州博科儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 材料預(yù)處理

靈芝子實(shí)體烘干（60 ℃）至恒重→粉碎過100 目篩→按15：1（mL/g）液料比加入95%無水乙醇→浸泡24 h，重復(fù)兩次，濾渣自然烘干后留取備用。

1.3.2 多糖和蛋白含量分析

苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量[16]、二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法測(cè)定還原糖含量[17]、考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量[18-19]。

多糖含量（%）=總糖含量（%）－還原糖含量（%）

1.3.3 單因素試驗(yàn)

據(jù)文獻(xiàn)[20-21]的研究方法略作改動(dòng)。選取液料比、提取時(shí)間、提取功率進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各因素對(duì)靈芝多糖得率的影響。

1.3.3.1 液料比對(duì)靈芝多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱取3 g 靈芝子實(shí)體，分別按照液料比10：1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1 （mL/g）溶解于蒸餾水中，混勻，靜置3 min，500 W 超聲破碎40 min，冷卻至室溫，7 000r/min，15 min 離心2 次，醇沉（酒精濃度至80%），4 ℃冰箱內(nèi)過夜，7 000 r/min，10 min 離心，收集沉淀，60 ℃干燥至恒重得靈芝多糖。

1.3.3.2 提取時(shí)間對(duì)靈芝多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱取3 g 靈芝子實(shí)體，按照液料比20 ∶1（mL/g）溶解于蒸餾水中，混勻，靜置3 min，500 W 超聲功率分別破碎30、40、50、60、70 min，冷卻至25 ℃，7 000 r/min，15 min 離心2 次，醇沉（酒精濃度至80%），4 ℃冰箱內(nèi)過夜，7 000 r/min，10 min 離心，收集沉淀，60 ℃干燥至恒重得靈芝多糖。

1.3.3.3 提取功率對(duì)靈芝多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱取3 g 靈芝子實(shí)體，按照液料比20 ∶1（mL/g）的比例溶解于蒸餾水中，混勻，靜置3 min，分別以300、400、500、600、700、800 W 的超聲功率破碎40 min，7 000 r/min，15 min 離心2 次，醇沉（酒精濃度至80%），4 ℃冰箱內(nèi)過夜，7 000 r/min，10 min 離心，收集沉淀，60 ℃干燥至恒重得靈芝多糖。

1.3.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用運(yùn)用Design-Expert 8.0.5 軟件，設(shè)計(jì)Box-Behnken 試驗(yàn)，采用三因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)[22-23]，因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of the response surface methodology

1.3.4 乙醇分級(jí)沉淀靈芝多糖

取一定量的靈芝多糖濃縮液，加入無水乙醇，溶液濃度至40%，靜置，4 ℃冰箱過夜，7 000 r/min 離心20 min，收集沉淀，上清液留取備用，60 ℃干燥，得靈芝多糖，即為GLP40；取留取待用的上清液，繼續(xù)添加無水乙醇，溶液濃度至60%，靜置，4℃冰箱過夜，7 000 r/min離心20 min，收集沉淀，上清液留取備用，60 ℃干燥，得靈芝多糖，即為GLP60；取留取待用的上清液，繼續(xù)添加無水乙醇，溶液濃度至80 %，靜置，4 ℃冰箱過夜，7 000 r/min 離心20 min，收集沉淀，上清液留取備用，60 ℃干燥，得靈芝多糖，即為GLP80[24]。

1.3.5 抗氧化活性試驗(yàn)

1.3.5.1 不同濃度供試液的制備

準(zhǔn)確稱取0.02 g 的靈芝多糖，溶解于10 mL 蒸餾水，配置濃度為2 000 μg/mL 的多糖溶液→取4.5 mL 2 000 μg/mL 多糖溶液溶于1.5 mL 蒸餾水，配置濃度為1 500 μg/mL 的多糖溶液→取5 mL 2 000 μg/mL 多糖溶液溶于5 mL 蒸餾水，配置濃度為1 000 μg/mL 的多糖溶液→取5 mL 1 000μg/mL 多糖溶液溶于5 mL蒸餾水，配置濃度為500 μg/mL 的多糖溶液→取5 mL 500 μg/mL 多糖溶液溶于5 mL 蒸餾水，配置濃度為250 μg/mL 的多糖溶液→重復(fù)以上操作，至濃度為62.5 μg/mL。

1.3.5.2 DPPH 自由基清除活性

據(jù)文獻(xiàn)[25-27]的方法，略作改動(dòng)。依次往試管中加入：靈芝多糖樣品液（1 mL）→0.2 mmol/L DPPH 無水乙醇溶液（1 mL）→混合均勻，在避光條件下反應(yīng)30 min→在預(yù)熱好的可見光分光光度計(jì)中，測(cè)其吸光度值（517 nm）為Ai；靈芝多糖樣品液（1 mL）→無水乙醇溶液（1 mL）→混合均勻，避光條件下反應(yīng)30 min→在預(yù)熱好的可見光分光光度計(jì)中，測(cè)其吸光度值（517 nm）為Aj；0.2 mmol/L DPPH 無水乙醇溶液（1 mL）→無水乙醇溶液（1 mL）→混合均勻，在避光條件下反應(yīng)30 min→在預(yù)熱好的可見光分光光度計(jì)中，測(cè)其吸光度值（517 nm）為A0，相同方法VC作陽性對(duì)照，3 次試驗(yàn)。DPPH 自由基清除率計(jì)算公式為：

DPPH 自由基清除率/%=[1-（Ai-A）j/A0]×100

式中：A0為空白對(duì)照組的吸光度；Ai為加入多糖溶液后的吸光度；Aj為待測(cè)液本底的吸光度。

2.危害性。高校突發(fā)事件通常都具有較高的危害性，對(duì)學(xué)校帶來的影響較大，不僅可能會(huì)影響到學(xué)校正常教學(xué)工作的開展，而且可能會(huì)對(duì)學(xué)校師生的思想觀念造成較大的沖擊，對(duì)后期教學(xué)工作造成影響。甚至該類型事件還可能被一些不法分子利用，對(duì)社會(huì)的穩(wěn)定帶來較大的影響。

1.3.5.3 羥自由基清除活性

據(jù)文獻(xiàn)[28-29]的方法，略作改動(dòng)。依次往試管中加入：4 mmol/L 30%H2O2溶液（1 mL）→超純水（1 mL）→4 mmol/L FeSO4溶液（1 mL）→4 mmol/L 水楊酸乙醇溶液（1 mL）→混合均勻，37 ℃下避光恒溫保持30 min→離心（3 000 r/min，10 min）→取上清液，在預(yù)熱好的可見光分光光度計(jì)中，測(cè)溶液的吸光度值（510 nm）為A0；4 mmol/L 30 % H2O2溶液（1 mL）→靈芝多糖樣品液（1 mL）→4 mmol/L FeSO4溶液（1 mL）→4 mmol/L 水楊酸乙醇溶液（1 mL）→混合均勻，37 ℃下避光恒溫保持30 min→離心（3 000 r/min，10 min）→取上清液，在預(yù)熱好的可見光分光光度計(jì)中，測(cè)溶液的吸光度值（510 nm）為Ai；4 mmol/L 30%H2O2溶液（1 mL）→靈芝多糖樣品液（1 mL）→4 mmol/L FeSO4溶液（1 mL）→乙醇溶液（1 mL）→混合均勻，37 ℃下避光恒溫保持30 min→離心（3 000 r/min，10 min）→取上清液，在預(yù)熱好的可見光分光光度計(jì)中，測(cè)溶液的吸光度值（510 nm）為Aj，相同方法VC作陽性對(duì)照，3 次重復(fù)，取平均值，清除羥基自由基計(jì)算公式是：

羥基自由基清除率/%=[1-（Ai-A）j/A0]×100

式中：A0為空白對(duì)照組的吸光度；Ai為加入多糖溶液后的吸光度；Aj為待測(cè)液本底的吸光度。

1.3.5.4 還原力測(cè)定

據(jù)據(jù)文獻(xiàn)[30-31]的方法，略作改動(dòng)。依次往試管中加：靈芝多糖供試樣品液（1 mL）→1 %鐵氰化鉀溶液（2 mL）→2 mol/L pH值為6.60 的磷酸鹽緩沖液（2 mL）→混合均勻，恒溫培養(yǎng)20 min→10 %三氯乙酸溶液（2 mL）→離心（3 000 r/min，10 min）→上清液（2.5 mL）→超純水（2.5 mL）→0.1%的三氯化鐵溶液（1 mL），混合均勻，靜置10 min→測(cè)吸光度值為A（700 nm），相同方法VC作陽性對(duì)照，3 次試驗(yàn)，取平均值，吸光度值數(shù)值越大還原力也就越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 含量分析

靈芝粗多糖（GLP40、GLP60、GLP80）的總糖含量、還原糖含量、蛋白含量如表2所示，GLP40、GLP60、GLP80含量各不相同，可能對(duì)抗氧化活性造成一定的影響。

表2 多糖含量分析Table 2 Analysis of the content of poly saccharide

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

圖1為靈芝多糖提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果。

圖1 靈芝多糖提取的單因素試驗(yàn)Fig.1 The signal-factor result of yield of the polysaccharide from G.lucidum

2.2.1 液料比對(duì)靈芝多糖得率的影響

由圖1（a）可知，隨著液料比的不斷增加，靈芝多糖得率不斷增加，當(dāng)液料比增加到20 ∶1（mL/g），提取得率反而降低，原因可能是因?yàn)槿軇┨?，多糖濃度偏低，醇沉不夠完全，因此，本試?yàn)選取20 ∶1（mL/g）的液料比較為合適。

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)靈芝多糖得率的影響

由圖1（b）可知，隨著提取時(shí)間的不斷增加，提取得率不斷增加，在提取時(shí)間為50 min 時(shí)提取得率最高，隨著時(shí)間的增加，提取得率反而降低，可能由于時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致多糖的分解，因此，從縮短生產(chǎn)周期，增加提取效果等方面綜合考慮，本試驗(yàn)選定提取時(shí)間在50 min 左右。

2.2.3 提取功率對(duì)靈芝多糖得率的影響

由圖1（c）可知，隨著提取功率的不斷增加，提取得率也不斷增加，在提取功率為700 W 具有最高值，此后隨著提取功率的增加，提取得率反而降低，可能是因?yàn)槌暺扑檫^長(zhǎng)時(shí)間，導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)被破壞，因此，本試驗(yàn)選定提取功率在700 W 左右。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)Box—Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，對(duì)超聲破碎提取靈芝多糖進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表3。利用Design—Expert 8.0.5 軟件對(duì)表3 數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合和顯著性分析，結(jié)果見表4。響應(yīng)面分析的二次回歸方程為：Y=2.58+0.42A+0.31B+0.27C+0.24AB+0.32AC+0.33BC-0.10A2+0.067B2-0.092C2。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果Table3 Scheme and results of the response surface test

表4 響應(yīng)面結(jié)果方差分析Table 4 analysis of variance of the response surface results

續(xù)表4 響應(yīng)面結(jié)果方差分析Continue table 4 analysis of variance of the response surface results

根據(jù)表4可知，模型的P值＜0.01，表明回歸方程模型極其顯著，失擬項(xiàng)P＞0.05，且相關(guān)系數(shù)R2=0.942 2，失擬項(xiàng)不顯著，表明該模型能夠反應(yīng)響應(yīng)值的變化，試驗(yàn)擬合好，失擬小，預(yù)測(cè)值與實(shí)際值具有高度的相關(guān)性，可直接采用回歸方程對(duì)超聲破碎提取靈芝多糖工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。在各因素之中A、B的P值＜0.01，說明對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響極其顯著，C的P值＜0.05，說明對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著，二次項(xiàng)C2的P值＜0.01，影響極其顯著，交互項(xiàng)指標(biāo)BC的P值＜0.01，說明結(jié)果極其顯著，AC的P值＜0.05，影響顯著。根據(jù)F 值的大小可判斷各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響順序?yàn)椋篈＞B＞C，即液料比＞提取時(shí)間＞提取功率，響應(yīng)面優(yōu)化所得最佳提取條件為液料比25 ∶1（mL/g）、超聲時(shí)間60 min、超聲功率760 W，靈芝多糖的預(yù)測(cè)提取得率為3.78%，實(shí)際提取得率3.68%，與理論值相差0.10%。

2.3.2 各因素交互作用

各因素之間的交互作用見圖2。

將其中一個(gè)因素固定為0，可得另外兩個(gè)因素之間的交互作用影響結(jié)果，由圖2（b）可知，隨著提取功率和液料比的增加，提取得率也不斷的增加，當(dāng)增加到一定程度，提取得率反而降低，由圖2（c）可知，隨著提取功率和提取時(shí)間的不斷增加，提取得率也不斷的增加，當(dāng)?shù)竭_(dá)一定范圍，提取得率反而下降，交互作用顯著，與試驗(yàn)?zāi)Ｐ头治鱿嘁恢隆?/p>

圖2 液料比、超聲時(shí)間、超聲功率對(duì)靈芝多糖提取得率的影響Fig.2 The yield of G.lucidum polysaccharide between the material-liquid ratio and ultrasonic power，ultrasonic time and material-liquid ratio，ultrasonic power and ultrasonic power

2.4 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇分級(jí)醇沉靈芝多糖

不同體積分?jǐn)?shù)乙醇分級(jí)醇沉靈芝多糖，所得GLP40 多糖比例最大，約占醇沉多糖總含量的45%，其次是GLP60，約占醇沉多糖總含量29%，最后是GLP80 多糖，約占醇沉多糖總含量的26 %，GLP40、GLP60 約占醇沉多糖總量74%，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是靈芝多糖濃縮液先經(jīng)40 %和60 %的乙醇沉淀，再經(jīng)80%乙醇沉淀，導(dǎo)致先醇沉的多糖含量較高；也可能和多糖的分子量有關(guān)，分子量大的多糖，先醇沉出來，分子量小的多糖后醇沉出來。

2.5 抗氧化活性試驗(yàn)

2.5.1 DPPH 自由基清除試驗(yàn)

以VC為陽性對(duì)照，分級(jí)后靈芝多糖（GLP40、GLP60、GLP80）和未分級(jí)靈芝多糖（GLP）的體外清除DPPH 自由基的活性結(jié)果如圖3（a）所示，5 種多糖的確具有清除DPPH 自由基的能力，且隨著濃度的不斷增加（62.5、125、250、500、1 000、1 500 μg/mL），清除能力不斷增加，在濃度和清除率之間有著良好的正相關(guān)關(guān)系，多糖EC50值如表5所示，DPPH 自由基清除力大小排列順序?yàn)椋篤c＞GLP80＞GLP＞GLP60＞GLP40，GLP80清除能力相對(duì)較好。

圖3 靈芝多糖體外清除活性Fig.3 Scavenging activity of polysaccharide from G.lucidum in vitro

表5 4種靈芝多糖對(duì)DPPH 自由基、羥基自由基清除活性和還原力大小的EC50值Table 5 EC50 values and RP0.5AU values of DPPH-scavenging activity，Hydroxhl-scavenging activity，Reducing power of differen polysaccharide from G.lucidum（GLP80，GLP60，GLP40，GLP）

2.5.2 羥基自由基清除試驗(yàn)

以VC為陽性對(duì)照，分級(jí)后靈芝多糖（GLP40、GLP60、GLP80）和未分級(jí)靈芝多糖（GLP）的體外清除羥基自由基的活性如圖3（b）所示，該多糖的確具有清除羥自由基的能力，且隨著濃度的不斷增加（62.5、125、250、500、1 000、1 500 μg/mL），清除能力不斷增加，濃度和清除率之間有良好的線性關(guān)系，多糖EC50值如表5所示，羥自由基清除力大小排列順序?yàn)椋篤C＞GLP＞GLP40＞GLP60＞GLP80，GLP 和GLP40 清除羥自由基能力相對(duì)較好。

2.5.3 還原力試驗(yàn)

以VC為陽性對(duì)照，分級(jí)后靈芝多糖（GLP40、GLP60、GLP80）和未分級(jí)靈芝多糖（GLP）還原力如圖3（b）所示，4種多糖的確具有還原力，且隨著濃度的不斷增加（62.5、125、250、500、1 000、1 500 μg/mL），還原力增加，在濃度和還原力之間有良好的線性關(guān)系，多糖EC50值如表5所示，還原力大小的排序?yàn)閂C＞GLP60＞GLP80＞GLP＞GLP40，GLP60 還原力相對(duì)較好。

3 結(jié)論

考察單因素液料比、提取時(shí)間、提取功率對(duì)靈芝多糖提取得率的影響，并在此基礎(chǔ)上運(yùn)用Design-Expert 8.0.5 軟件進(jìn)行Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)，得到超聲破碎法提取靈芝多糖的最優(yōu)提取工藝為液料比25：1（mL/g），提取時(shí)間60 min，提取功率760 W，靈芝多糖的提取得率3.60%，試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷腜 值＜0.01 且失擬項(xiàng)P＞0.05，表明模型顯著，回歸方程能夠較好對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響順序?yàn)椋篈＞B＞C，即液料比＞提取時(shí)間＞提取功率。液料比、提取時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響極其顯著，提取功率影響顯著。響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果對(duì)于對(duì)靈芝多糖的開發(fā)和利用具有一定的意義。

采用乙醇沉淀法對(duì)靈芝多糖進(jìn)行分級(jí)，所得GLP40、GLP60、GLP80 多糖比例為45：29：26，靈芝粗多 糖GLP40、GLP60、GLP80 所 對(duì) 應(yīng) 的 總 糖 含 量 為15.20%、26.02%、15.52%；還原糖含量2.46%、2.43%、3.18%；蛋白含量3.98%、3.65%、2.56%。

對(duì)GLP、GLP40、GLP60、GLP80 進(jìn)行DPPH 自由基清除試驗(yàn)、羥基自由基清除試驗(yàn)、還原力試驗(yàn)，結(jié)果顯示4種多糖都具有一定的抗氧化活性，其中GLP80 清除DPPH 自由基的能力最強(qiáng)，GLP、GLP40 清除羥基自由基能力最強(qiáng)，GLP60 還原力最好，且抗氧化活性與多糖濃度有著正相關(guān)關(guān)系，隨著多糖濃度的不斷增加，抗氧化活性也不斷增加。