彭瀟，陳義倫

(山東農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院山東省高校食品加工技術與質(zhì)量控制重點實驗室，山東泰安271018）

亞硝酸鹽進入人體后，會將血紅蛋白轉(zhuǎn)變成高鐵血紅蛋白[1]；產(chǎn)生的亞硝基化合物可生成強致癌物亞硝胺[2]。人體每天攝入亞硝酸鹽0～20 mg，主要來源于蔬菜和肉制品[3]。降低食物和人體內(nèi)亞硝酸鹽的含量可預防其對人體健康的潛在危害。研究表明，維生素C、多酚[4]、黃酮[5-6]、有機酸、皂苷等天然抗氧化物質(zhì)及富含有抗氧化活性成分的植物提取物[7-11]，可與亞硝酸鹽發(fā)生氧化還原反應來降低食品中亞硝酸鹽的含量[12-13]，達到有效降解亞硝酸鹽的效果。

沙棘（Hippophae rhamnoidesL.）是藥食同源植物，具有抗炎、清除自由基、提高免疫功能和抗腫瘤等藥理作用[14]。沙棘不僅有多種維生素、微量元素和氨基酸等營養(yǎng)成分，同時富含黃酮、多糖、有機酸、原花青素等抗氧化性強的活性物質(zhì)[15-16]。其活性成分的還原性決定了沙棘具有清除亞硝酸鹽的能力[17]。

天然果蔬提取物降解食品中亞硝酸鹽安全高效，沙棘具有良好降解亞硝酸鹽的能力，影響沙棘果提取物降解亞硝酸鹽的因素和反應條件尚不明確。本試驗以沙棘果為原料，研究沙棘果降解亞硝酸鹽的作用條件，探討影響其降解效果的主要因素，以期為開發(fā)和應用高效降解亞硝酸鹽的天然抗氧化物質(zhì)提供理論依據(jù)和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘干果：泰安市金泰聯(lián)藥店；亞硝酸鈉、鹽酸、無水對氨基苯磺酸、無水乙醇（以上均為分析純）：天津市凱通化學試劑有限公司；N-（1-萘基）乙二胺鹽酸鹽（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

T6 新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；FA2104A 電子天平：上海精天電子儀器有限公司；BL25B31 攪拌機：美的集團；高速多功能粉碎機：永康市博歐五金制品有限公司；Sartorius 普及型pH 計：賽多利斯科學儀器有限公司；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 沙棘果提取物的制備

將沙棘干果用粉碎機粉碎，過40 目篩，置干燥器中備用。準確稱取10.00 g 沙棘果干粉于錐形瓶中，按料液比1 ∶20（g/mL）加入體積分數(shù)為50%的乙醇溶液，打漿，于70 ℃水浴鍋中水浴40 min，取出冷卻至室溫，抽濾，定容至250 mL 容量瓶中，備用。1 mL 該提取液中含有40 mg 樣品粉末溶出物質(zhì)。

1.3.2 反應條件對沙棘果提取物降解亞硝酸鹽效果的影響

1.3.2.1 沙棘果提取物添加量對亞硝酸鹽降解率的影響

在25 mL 的具塞比色管中各加入1、2、3、4、5、6、7 mL 的沙棘果提取物溶液，分別加入1 mL 25.0 μg/mL的亞硝酸鹽溶液，在pH值為2，25 ℃水浴條件下反應10 min。每組做3 次平行試驗，比較沙棘果提取物添加量對亞硝酸鹽降解率的影響。

1.3.2.2 反應時間對沙棘果提取物亞硝酸鹽降解率的影響

取25 mL 具塞比色管分別做標記，各加入5 mL 沙棘果提取物溶液，加入1 mL 25.0 μg/mL 的亞硝酸鹽溶液，在pH值為2，25 ℃水浴條件下分別反應10、20、30、40、50、60 min。每組做3 次平行試驗，比較反應時間對亞硝酸鹽降解率的影響。

1.3.2.3 反應溫度對沙棘果提取物亞硝酸鹽降解率的影響

取5 mL 沙棘果提取物溶液置于25 mL 具塞比色管中，將比色管分別置于20、30、40、50、60 ℃的水浴鍋中加熱，各加入1 mL 25.0 μg/mL 的亞硝酸鹽溶液并混勻，在pH值為2 條件下反應10 min。每組做3 次平行試驗，比較反應溫度對亞硝酸鹽降解率的影響。

1.3.2.4 pH值對沙棘果提取物亞硝酸鹽降解率的影響

取5 mL 沙棘果提取物溶液置于25 mL 具塞比色管中，各加入1 mL 25.0 μg/mL 的亞硝酸鹽溶液并混勻，在pH值分別為2、3、4、5、6 條件下，25 ℃水浴反應10 min。每組做3 次平行試驗，比較pH值對亞硝酸鹽降解率的影響。

1.3.3 沙棘果降解亞硝酸鹽反應條件優(yōu)化

在單因素試驗的基礎上，固定反應時間為20 min，選取沙棘果提取物添加量（A）、反應溫度（B）、pH值（C）進行三因素三水平的Box-Behnken 試驗設計，以亞硝酸鹽降解率為響應值，進行沙棘果提取物降解亞硝酸鹽反應條件的優(yōu)化。試驗的因素水平設計見表1。

1.4 分析測定方法

1.4.1 亞硝酸鹽標準曲線的繪制

參照GB 5009.33-2016《食品安全國家標準食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》，準確吸取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 的5.0 μg/mL 亞硝酸鹽標準使用液，置于25 mL 的具塞比色管中。分別加入2 mL 濃度為4 g/L 的對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置5 min，再加入1 mL 濃度為2 g/L 的鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混勻，靜置15 min。用1 cm 比色杯，以零管調(diào)節(jié)零點，于波長538 nm 處測定吸光度。以吸光度y 為縱坐標，亞硝酸鹽濃度x（μg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線。得到吸光度y 與亞硝酸鹽濃度x（μg/mL）的標準曲線方程為：y=0.6769x+0.0072，R2=0.999 3，線性關系良好。

1.4.2 沙棘果提取物降解亞硝酸鹽效果的測定

取一定量的沙棘果提取物于25 mL 具塞比色管中，與25.0 μg/mL 亞硝酸鈉溶液反應一定時間，加入2 mL 濃度為4 g/L 的對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置5 min 后加入1 mL 濃度為2 g/L 的鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混勻，靜置15 min。用1 cm 比色杯，于波長538 nm 處測定反應前后亞硝酸鹽溶液的吸光度，按照下式計算亞硝酸鹽降解率[5]。

式中：A1為未添加提取物時亞硝酸鹽的吸光度值；A2為添加提取物之后反應液的吸光度值；A0為提取物本底吸光度值。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007、SPSS 22.0、Design Expert 8.0 軟件對數(shù)據(jù)進行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘果提取物添加量對亞硝酸鹽降解率的影響

添加量對亞硝酸鹽降解率的影響見圖1。

由圖1可知，當沙棘果提取物添加量在1 mL～5 mL范圍時，亞硝酸鹽降解率增加顯著。添加量為5 mL 時，降解率達到最大值76.41%。此后增大添加量，降解率降低并趨于平穩(wěn)。沙棘果提取物添加量對降解亞硝酸鹽的影響顯著，可以通過適當增加添加量的方式來提高其對亞硝酸鹽的降解效果。

圖1 添加量對亞硝酸鹽降解率的影響Fig.1 Effects of additive amount on nitrite degradation rate

2.2 反應時間對沙棘果提取物亞硝酸鹽降解率的影響

反應時間對亞硝酸鹽降解率的影響見圖2。

圖2 反應時間對亞硝酸鹽降解率的影響Fig.2 Effects of reaction time on nitrite degradation rate

由圖2所示，反應時間對亞硝酸鹽降解率的影響較小。沙棘果提取物與亞硝酸鹽在反應10 min 時，降解率已超過70%，說明其在短時間內(nèi)即可降解大部分亞硝酸鹽，降解速度較快。反應時間在20 min～40 min內(nèi)，降解率增加緩慢，亞硝酸鹽降解為氧化還原反應，反應20 min 可達到高效降解的效果。

2.3 反應溫度對沙棘果提取物亞硝酸鹽降解率的影響

反應溫度對亞硝酸鹽降解率的影響見圖3。

圖3 反應溫度對亞硝酸鹽降解率的影響Fig.3 Effects of reaction temperature on nitrite degradation rate

由圖3可以看出，隨著反應溫度升高，沙棘果提取物降解亞硝酸鹽的能力逐漸增大，反應溫度顯著影響沙棘果提取物降解亞硝酸鹽的效果。當溫度從30 ℃上升至40 ℃時，降解率增加明顯，40 ℃時降解率即達到91.92%，較高反應溫度下分子熱運動加快，有效成分與亞硝酸鹽作用更充分，從而提高降解率。溫度過高可能影響活性成分的存在狀態(tài)，綜合考慮，選擇反應溫度為40 ℃。

2.4 pH值對沙棘果提取物亞硝酸鹽降解率的影響

pH值對亞硝酸鹽降解率的影響見圖4。

圖4 pH值對亞硝酸鹽降解率的影響Fig.4 Effects of pH value on nitrite degradation rate

由圖4可知，在pH值2～6 的范圍內(nèi)，亞硝酸鹽降解率總體隨著pH值的增大而降低，pH值對亞硝酸鹽降解率的影響顯著。在pH值從2 增加到4 時，降解率下降較為明顯，從72.95%迅速降低到60.26%。降低反應液pH值可以增大沙棘果提取物對亞硝酸鹽的降解效果，酸性環(huán)境下可促進有效成分與亞硝酸根發(fā)生氧化還原反應從而降低亞硝酸鹽含量[18-19]。此外，pH值可能影響有效成分在溶液中的解離狀態(tài)，或影響其穩(wěn)定性，從而影響提取物降解亞硝酸鹽的效果，需要選擇適宜的酸度值。

2.5 沙棘果降解亞硝酸鹽反應條件優(yōu)化

2.5.1 響應面試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，固定反應時間為20 min，選擇添加量、反應溫度和pH值進行三因素三水平的響應面試驗，試驗結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken 試驗設計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of Box-Behnken

表2 Box-Behnken 試驗設計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of Box-Behnken

2.5.2 回歸模型擬合及方差分析

根據(jù)表2的試驗結(jié)果，以亞硝酸鹽的降解率為響應值（即因變量Y），確定回歸方程的系數(shù)，對該回歸方程進行方差分析，結(jié)果如表3所示。

表3 回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗Table 3 Regression equation coefficients and F test

得到亞硝酸鹽降解率與添加量、反應溫度、pH值的二元多次回歸方程如下：

Y=76.91 ＋2.43A＋5.29B－7.60C＋1.23AB＋0.76AC＋1.97BC＋2.09A2＋1.48B2＋2.03C2。

由表3回歸模型的方差分析結(jié)果可知，該模型的P＜0.01，說明建立的二元多次回歸方程模型極顯著。失擬項P=0.762 0＞0.05，顯示模型失擬不顯著，本模型可信度較高，誤差較小，可以用該回歸方程代替試驗真實點進行分析。決定系數(shù)R2=0.987 7，說明該模型可以解釋98.77%的試驗，表明該模型擬合情況較好。校正決定系數(shù)R2（Adj）=0.972 0，說明該模型的預測性較好、操作可靠。綜合以上情況，表明該回歸模型合理，可以適用于對亞硝酸鹽降解率的反應條件進行預測[20]。

從表3中可以看出，一次項A、B、C 和二次項A2達到了極顯著水平（P＜0.01），交互作用項BC 和二次項B2、C2達到了顯著水平（P＜0.05），其余各項影響均不顯著（P＞0.05）。說明添加量、反應溫度、pH值、添加量的二次項、反應溫度的二次項、pH值的二次項、反應溫度和pH值之間的交互作用對亞硝酸鹽降解率有顯著影響（P＜0.05）。通過比較各因素F 值的大小，得到其對亞硝酸鹽降解率的影響程度大小順序為：pH值（C）＞反應溫度（B）＞添加量（A）。

2.5.3 驗證試驗結(jié)果

利用Design Expert 8.0 軟件得出沙棘果提取物降解亞硝酸鹽的優(yōu)化反應條件為：沙棘果提取物添加量為6 mL，反應溫度為50 ℃，反應時間20 min，pH值為2。按照此反應條件進行3 次平行試驗，得到亞硝酸鹽的平均降解率為96.10%，接近理論預測值96.33%，說明優(yōu)化結(jié)果可靠，此回歸方程能夠真實地反映篩選因素對亞硝酸鹽降解率的影響，具有實用參考價值。

3 結(jié)論

試驗結(jié)果表明，沙棘果提取物可高效降解亞硝酸鹽，影響沙棘果提取物亞硝酸鹽降解率的主要因素是pH值，其次是反應溫度和添加量，反應溫度和pH值之間的交互作用對亞硝酸鹽降解率影響顯著。優(yōu)化得到的沙棘果提取物降解亞硝酸鹽的反應條件為：添加量為6 mL，反應溫度為50 ℃，反應時間為20 min，pH值為2。在此條件下，沙棘果提取物亞硝酸鹽降解率為96.10%，與理論預測值基本一致。沙棘果中降解亞硝酸鹽的主要成分、降解途徑和機理及在食品中應用效果，需進一步研究明確。