羅政，郭媛媛，陳飛平，宮曉波，陳于隴

（廣東省農(nóng)業(yè)科學研究院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東廣州510610）

菜心（Brassica parachinensis）是廣東地區(qū)主要栽培的特色蔬菜之一，其營養(yǎng)豐富，質(zhì)嫩味佳，風味可口[1]。但是菜心采摘后，菜心的木質(zhì)化嚴重影響菜心品質(zhì)和口感。木質(zhì)素的生物合成需要一系列酶類地催化，其單體合成由苯丙氨酸開始，通過氧化和聚合反應將這些結(jié)構(gòu)單元直接羥化聚合為木質(zhì)素[2]。而苯丙氨酸解氨酶（phenylalaninammo-nialyase，PAL）是苯丙烷類代謝途徑的第一步反應的限速酶和關鍵酶[3-6]，在植物木質(zhì)素代謝過程中起著重要作用。當今，國內(nèi)外針對高氧氣調(diào)對蔬菜中酶活的影響的研究逐漸增加。王貴禧等[7]在研究中發(fā)現(xiàn)采用100%O2處理后的冬棗中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活性要低于采用70%O2處理后的冬棗，說明高氧可以有效的減緩冬棗貨架期的衰老。鄭永華等[8]用90%O2處理枇杷，可有效抑制多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性，降低果肉褐變程度及木質(zhì)素的生物合成。Day[9]也指出高氧能夠抑制PPO 的活性。高氧氣調(diào)包裝對鮮切菜心木質(zhì)化PAL 的研究鮮有報道，研究大多集中在PAL 在植物抗病反應過程中的作用。本試驗采用高氧氣調(diào)包裝和空氣包裝鮮切菜心在25 ℃條件下貯藏，研究其木質(zhì)化程度與調(diào)控關鍵酶PAL 活性及其基因轉(zhuǎn)錄表達間的關系，為高氧氣調(diào)包裝處理抑制菜心木質(zhì)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菜心：廣州市天河區(qū)粵墾農(nóng)貿(mào)市場。

TRIzol 試劑盒、第一鏈cDNA 合成試劑盒（TaKaRa PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒）、2×Taq PCR MasterMix PCR 反應試劑盒、PCR引物：天根生化科技（北京）有限公司；

氯仿、異丙醇、75%乙醇、氯化鋇（均為分析純）：天津市富于精細化工有限公司；DEPC 水：焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC）（98 %）；1×TAE 緩沖液：三羥甲基氨基甲烷（Tris base）、乙酸（acetic acid）；乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）（≥99.9%titration）；聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）（分子量：55 000 Da）；20 mmol/L L-苯丙氨酸BR（99%）：上海源葉生物科技有限公司；Biowest瓊脂糖：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；液氮：佛山市禪城區(qū)普雷克絲氣體配套設備貿(mào)易部；72%的濃硫酸（分析純）：珠海市化成達化工有限公司；0.1 mol/L pH 8.8 硼酸緩沖液（分析純）：天津市福晨化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

S1000 型快速PCR 儀、164-5050 型核酸電泳儀及電泳槽、ChemiDocTMXRS 凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司；MAP-1D400 型盒式氣調(diào)包裝機：上海炬鋼機械制造有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型予華牌循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限公司；UV1800 型紫外可見分光光度計：日本島津公司；CARY Eclipse 熒光分光光度計：美國VARIAN 公司；Sorvall Stratos 冷凍高速離心機：美國ThermoFisher 公司；

1.3 試驗方法

1.3.1 材料的預處理

將新鮮菜心整理、分級、洗凈，甩干表面水分后，選取新鮮未木質(zhì)化、長度均勻（約18 cm）且無機械損傷的新鮮菜心400 g 為一袋進行包裝，5 組用高氧氣調(diào)包裝，其中O2濃度固定比例大于90%，CO2濃度低于1%，其它N2補充。另外5 組空氣包裝（記作CK）。包裝袋材質(zhì)為PE，每個包裝中注入氣體總體積約為200 mL。試驗時樣品用液氮研磨成粉末置于-20 ℃貯藏待用。還有一組作為0 d 對照處理，貯藏于25 ℃，以上分別設置3 個重復，每隔1 d 取樣一次，共取樣5 次。

1.3.2 ribonucleic acid（RNA）的提取及檢測

采用TRIzol 試劑盒的方法加以改進。取0.5 g 用液氮研磨好的菜心于離心管中，加入1.0 mL Trizol 試劑，將研磨液充分搖勻，室溫靜置10 min 后，在12 000 r/min 4 ℃離心5 min；去除沉淀后加入0.2 mL 氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15 s；室溫靜置15 min，12 000 r/min，4 ℃離心15 min；吸取上清液置于一新的離心管中，加入0.5 mL 預冷的異丙醇，混勻后于室溫靜置5 min，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄去上清液，RNA 沉淀用1 mL 75%乙醇溶液洗，8 000 r/min 4 ℃離心5 min；棄去上清液，加入DEPC 水充分溶解。提取的RNA 濃度及純度由分光光度計測定其OD值。

1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈complementary deoxyribonucleic acid（cDNA）

參照TaKaRa PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行。反應條件為：65 ℃保溫5 min 后冰上迅速冷卻（目的使模板RNA 變性，提高反轉(zhuǎn)錄效率），之后加入逆轉(zhuǎn)錄酶，30 ℃保溫10 min 后再95 ℃保溫5 min（使酶失活），拿出后在冰上迅速冷卻。

1.3.4 PCR 擴增反應

以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為反應模板，參照2×Taq PCR MasterMix PCR 反應試劑盒說明書進行PCR 擴增反應。按下列體系加樣：2 μL 模板cDNA，上游引物1 μL，下游引物1 μL，12.5 μL 的2×MasterMix，最后用ddH2O 補足至25 μL。PCR 反應循環(huán)的設置如下：94 ℃3 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃1 min，30 個循環(huán)；72 ℃5 min。

1.3.5 PCR 反應產(chǎn)物的檢測

反應結(jié)束后取1 μL 6×LoadingBuffer 和5 μL產(chǎn)物均勻混合，加入含1 μL DNAGreen 的3.0%瓊脂糖凝膠中，150 V 電泳45 min。電泳結(jié)果用Bio-Rad 公司的凝膠成像系統(tǒng)進行紫外成像和光密度掃描分析。

1.3.6 苯丙氨酸解氨酶（PAL）的測定

參考Koukol 等[10]的方法測定并加以改進。稱取3 g 用液氮研磨過的鮮樣，之后加pH 8.8，0.05 mol/L 硼酸緩沖液（內(nèi)含5 mmol/L 巰基乙醇）7 mL 及PVP 0.4 g，冰浴研磨，研缽應該提前預冷，將研磨充分的樣液在4 ℃下12 000 r/min 離心20 min，取上清液用于酶活性測定。反應液系統(tǒng)包括：0.1 mL 酶液，1.9 mL 0.1 mol/L pH 8.8 的硼酸緩沖液和1 mL 20 mmol/L 苯丙氨酸溶液，反應液在37 ℃水浴中保溫1 h 后，立即加入0.1 mL 1%HCl 溶液終止反應，測定保溫前后酶液在290 nm 下的OD 值，以每小時在290 nm 處吸值收變化0.01 所需酶量為一個酶活力單位。測定3 次重復。

1.3.7 木質(zhì)素測定

參考Kirk，T.K.等[11]方法并加以改進。稱取5 g 用液氮磨碎的菜心，移入100 mL 燒杯中，加入30 mL 質(zhì)量分數(shù)為72%的濃硫酸，充分攪拌混勻后，在35 ℃恒溫水浴1 h，之后用蒸餾水潤洗，將洗滌液移入1 000 mL燒杯中，將體積定容到700 mL。將該稀酸液煮沸2 h，這個過程要保持液體體積不變。待其冷卻后，用烘干過的恒重G4 砂芯漏斗抽吸過濾，洗滌至洗液與10 %BaCl2溶液反應無白色沉淀為止，于80 ℃烘干至恒重稱量，測定3 次重復。

式中：ω 為木質(zhì)素含量，%；m0為樣品質(zhì)量，g，m1為砂芯漏斗凈重，g；m2為干燥后砂芯漏斗質(zhì)量，g。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

每個試驗重復3 次，其結(jié)果表示為平均值。利用Origin，9.0 生成圖表分析木質(zhì)素含量及酶活力變化的趨勢。電泳結(jié)果采用專業(yè)軟件Quantity One V4.5 處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 高氧氣調(diào)包裝對木質(zhì)素含量的影響

鮮切菜心在25 ℃下，5 d 內(nèi)木質(zhì)素含量的變化規(guī)律如圖1所示。

圖1 鮮切菜心在25 ℃下木質(zhì)素含量的變化規(guī)律Fig.1 Thechangesoflignincontentoffresh-cutcabbageunder25 ℃

在植物體中，木質(zhì)素含量在15%～36%之間，是地球上僅次于纖維素的大分子有機物[12]，是構(gòu)成細胞壁次生結(jié)構(gòu)的主要成分，有硬化細胞壁的作用，但果蔬中過高的木質(zhì)素含量會影響其食用品質(zhì)[13]。陳學紅等[14]對綠蘆筍采用了80%濃度的高氧包裝處理，貯藏期間PAL 和過氧化物酶（peroxidase，POD）活性均受到抑制，木質(zhì)素的合成量與空氣處理相比顯著降低。

本試驗中采用氧濃度90%以上的高氧處理，由圖1可知，鮮切菜心木質(zhì)素含量隨貯藏時間逐漸增加，并且隨貯藏期的延長增加速度變緩。且處理組的木質(zhì)素含量均低于對照組，到第3 天時，兩種處理下的木質(zhì)素含量接近?？傮w增長速度處理組要低于對照組，說明高氧氣調(diào)包裝可延緩鮮切菜心木質(zhì)素含量的增加。

2.2 高氧氣調(diào)包裝對苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的影響

鮮切菜心在25 ℃下，5 d 內(nèi)PAL 活性的變化規(guī)律如圖2所示。

圖2 鮮切菜心在25 ℃下PAL 活性的變化規(guī)律Fig.2 TheChangeofPALactivityoffresh-cutcabbageunder25 ℃

PAL 是木質(zhì)素合成途徑的第一個酶，其酶活性能夠直接影響植物的木質(zhì)素合成，在多種植物中發(fā)現(xiàn)在木質(zhì)化組織中含有較高的PAL 活性，而在這些植物的非木質(zhì)化組織中不能檢測到PAL 活性[15]。PAL 酶基因的轉(zhuǎn)錄表達極易受到外界各種刺激因子的誘導[16]。如，光、溫度、機械傷害、病原微生物侵染、外源植物激素和氣體成分等均對PAL 基因在轉(zhuǎn)錄水平有誘導作用[17-20]。

高氧氣調(diào)抑制酶活的機理主要是通過抑制呼吸從而降低果蔬木質(zhì)素合成的相關酶活達到的。在貯藏過程中，高氧氣調(diào)包裝的鮮切菜心的PAL 活要低于對照組。Tucker 和Laties[21]認為氧氣濃度超過呼吸鏈末端氧化酶的飽和濃度時，其對呼吸有負反饋抑制作用。Limbo 等[22]用高氧氣調(diào)包裝處理馬鈴薯，發(fā)現(xiàn)其貯藏期間揮發(fā)性物質(zhì)的顯著減少，呼吸作用受到抑制。

陳學紅等[23]對鮮切萵苣進行高氧處理也得到了同樣的結(jié)果，在貯藏一定時間后，呼吸作用會達到高峰同時PAL 活也會達到高峰，后持續(xù)降低。貯藏期間對照組的PAL 活性要低于對照組，因此高氧處理對PAL 活有抑制作用。

在An Jianshen 等[24]研究采用高濃度臭氧對蘆筍進行處理，發(fā)現(xiàn)其PAL 活性受到明顯抑制，而且抑制作用與臭氧濃度正相關，這說明高濃度的氧處理對果蔬產(chǎn)品PAL 活性有抑制作用。

2.3 高氧氣調(diào)包裝對木質(zhì)素PAL 在轉(zhuǎn)錄水平表達的影響

鮮切菜心在25 ℃下，5 d 內(nèi)PAL 的DNA 轉(zhuǎn)錄水平表達如圖3所示。

圖3 鮮切菜心在25 ℃下PAL 基因的表達差異Fig.3 The difference of PAL enzyme gene expression of fresh-cut cabbage under 25 ℃

由圖中可得知，每個樣品的PAL 的基因都發(fā)生轉(zhuǎn)錄水平的表達。結(jié)果顯示，從0 d 到第2 天條帶亮度在逐漸減弱，到了第3 天條帶又變亮，之后又逐漸減弱；說明0 d 與3 d 的酶基因表達較多，與之前測定的PAL活性結(jié)果一致，在第3 天時出現(xiàn)了PAL 活性高峰。貯藏到第4 天時，可以發(fā)現(xiàn)，處理組條帶的的亮度比對照的要弱。

試驗結(jié)果表明，PAL 基因在高氧氣調(diào)和空氣包裝兩種不同處理方式下均有表達，前期差異不明顯，到后期空氣包裝處理后的PAL 基因的轉(zhuǎn)錄表達水平高于采用高氧氣調(diào)處理，高氧氣調(diào)包裝在一定程度上降低了PAL 基因的轉(zhuǎn)錄表達。孫涵等[25]采用高氧動態(tài)氣調(diào)處理雙孢蘑菇后，發(fā)現(xiàn)除了PAL，高氧氣調(diào)還能有效抑制4-香豆酸-輔酶A 連接酶（4-coumarate：coenzyme A ligase，4CL）和肉桂醇脫氫酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD），3 種酶活都在貯藏過程中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，同時其活性與木質(zhì)素含量呈顯著正相關。而4CL 與CAD 的相關性要大于PAL。

因此，在研究木質(zhì)素合成的苯丙烷代謝途徑時，還要考慮PAL 以外有很多酶的參和作用，包括：甲基化酶[包括咖啡酸-3-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（caffeic acid-3-Omethyltransferase，COMT）和咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（caffeoyl-CoA O-methyltransferase，CCoAOMT）]，羥基化酶[香豆酸-3 羥-基化酶（coumarate 3-hydroxylase，C3H 和阿魏酸-5-羥基化酶，F(xiàn)erulate-5-hydroxylase，F(xiàn)5H）]，連接酶（4CL），還原酶[肉桂酰輔酶A 還原酶，（cinnamoyl-coA reductase，CCR）和CAD]以及聚合酶，Ran 等[26]在對甘藍型黃黑籽油菜種皮發(fā)育過程木質(zhì)素含量變化研究中發(fā)現(xiàn)，4CL、F5H 和CAD 酶活力與木質(zhì)素的含量在前期呈顯著或極顯著關系。所以，通過研究高氧氣調(diào)包裝對其他關鍵酶活性的抑制作用，能更有效的提高保鮮效果，減少蔬菜木質(zhì)化。

3 結(jié)論

采后果蔬硬度增加主要是由于組織纖維化，甚至逐步產(chǎn)生木質(zhì)素的積累，導致組織發(fā)生木質(zhì)化，木質(zhì)化后的葉菜細胞壁變厚，皮質(zhì)變韌，口感也會嚴重下降。

本試驗中，鮮切菜心在高氧包裝下，其木質(zhì)素增長速度隨貯藏期的延長增加速度變緩，但普通包裝下，鮮切菜心木質(zhì)素合成速度在3 d 后會再次加快；同時PAL 活性及轉(zhuǎn)錄水平表達均在3 d 時達到高峰，后持續(xù)降低，其中3 d 后空氣包裝處理的PAL 基因的轉(zhuǎn)錄表達水平高于高氧氣調(diào)處理；因此認為抑制PAL 的活性及其基因的轉(zhuǎn)錄表達與鮮切菜心木質(zhì)素的合成速度變緩是相關的。結(jié)合前人的研究，朱海英等[27]研究絲瓜發(fā)育過程的木質(zhì)素的積累趨勢，發(fā)現(xiàn)PAL 和CAD 的活性高峰出現(xiàn)在木質(zhì)素大量合成之前。吳曉麗等[28]研究發(fā)現(xiàn)竹筍在貯藏過程中木質(zhì)素含量增加與PAL、POD 活性呈正相關，說明竹筍的采后老化和木質(zhì)化是PAL、POD 活性增高引起的。吳錦程等[29]研究得出枇杷果實的木質(zhì)素合成與PAL 活性之間具有較高的相關性，PAL 活性差異是導致不同成熟度冷藏枇杷果實產(chǎn)生不同程度木質(zhì)化的主要因素。

本試驗采用高氧包裝處理，通過抑制鮮切菜心的呼吸作用，進而抑制了鮮切菜心在貯藏過程中的PAL基因的轉(zhuǎn)錄表達及其活性。結(jié)合前人研究，周濤等[30]經(jīng)研究通過氣調(diào)包裝抑制了輕加工茭白中PAL 和POD酶的活性，進而抑制了其木質(zhì)素的合成，延緩了茭白的老化速率。李偉麗等[31]利用80%高氧處理雪蓮果，吳緒敏等[32]利用高氧氣調(diào)包裝鮮切洋蔥，均能有效抑制相關酶活性。

本試驗結(jié)果認為，高氧氣調(diào)包裝可以在一定程度上抑制鮮切菜心PAL 基因的轉(zhuǎn)錄表達及其活性，從而降低其木質(zhì)素含量，減緩鮮切菜心木質(zhì)化進程，從而延長其貨架期。