李湛 李穎 荊紅波 王彥波 朱美娟 張赫

副溶血性弧菌(vibrioparahaemolyticus，簡稱VP)主要來自魚蝦蟹等海產品及鹽腌制品中，進食含該菌食物后可引起食物中毒[1]。由于水產養(yǎng)殖業(yè)及臨床上抗生素的不規(guī)范使用導致副溶血性弧菌耐藥性日益嚴重[2]，給臨床治療帶來很大難度，嚴重威脅著人類健康。為了更好地了解感染性副溶血弧菌的耐藥情況，現采用肉湯稀釋定量的藥敏檢測方法，旨在對北京市順義區(qū)人源性副溶血性弧菌的耐藥狀況及敏感抗生素是否存在,以及耐藥風險進行分析。

1 材料與方法

1.1標本來源 標本分別來自2015年1月-2016年12月順義區(qū)醫(yī)院和順義區(qū)空港醫(yī)院腸道門診腹瀉病人糞便，兩年間共采集糞便標本768份，標本采集均由臨床醫(yī)護人員按照規(guī)范操作方法，由腹瀉病人留取糞便，采用無菌有蓋容器，取有膿血、黏液部分的糞便3 g以上，液體糞便取3 mL以上置于無菌瓶中，立即送檢，送檢時間不超過1 h。

1.2試劑及實驗方法

1.2.1試劑： 增菌使用3%NaCl堿性蛋白胨水，分離使用TCBS(硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖瓊脂培養(yǎng)基)和科馬嘉弧菌顯色培養(yǎng)基分別購自北京陸橋(生產批號：1604127)、法國科馬嘉公司(生產批號：P000410)。

1.2.2標準菌株： 大腸埃希菌ATCC 25922。

1.2.3實驗方法： 菌株分離按照感染性腹瀉診斷標準(WS/T 271-2007)進行。

1.2.4藥敏試驗： 采用上海興佰生物技術公司生產的革蘭陰性需氧菌藥敏檢測板檢測(貨號：D-016XS)，依據其說明書的檢測原理及操作步驟完成：即每種抗生素都設有一系列倍比稀釋濃度的抗生素試劑，通過加入待檢細菌肉湯培養(yǎng)液稀釋的菌懸液，經18～20 h 孵育后，用肉眼判讀的方法對藥敏板條進行讀數，經數據分析得到最低抑菌濃度(MIC)值，并根據2015年美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI)的相應標準獲得相應敏感(S)、中度敏感(I)和耐藥(R)的結果(表1)。

表1 46株副溶血弧菌藥敏試驗結果

注：復方磺胺全稱為復方磺胺甲惡唑，為復方制劑，含活性成分磺胺甲惡唑和甲氧芐啶。

2 結果

2.12015-2016年標本檢出情況 2015年和2016年分別采集383份和385份，共計768份糞便標本。2015年和2016年致病菌陽性標本分別為59份和109份，共計168株致病菌，包括致瀉大腸埃細菌，志賀菌，沙門菌，空腸彎曲菌，副溶血性弧菌，腹瀉病人感染致病菌的總陽性率為21.88%。2015年有11份為副溶血弧菌感染的腹瀉病人標本，副溶血弧菌陽性率為2.87%；2016年副溶血弧菌陽性標本為35份，陽性率為9.91%。兩年間共計有46株是副溶血弧菌陽性標本，感染副溶血弧菌的腹瀉病人占總陽性率的27.38%。

2.2性別及不同年齡組副溶血弧菌檢出情況 根據分析發(fā)現男性腹瀉病人感染副溶血弧菌的陽性率為6.99%(33/472)，女性陽性率為4.39%(13/296)，感染副溶血弧菌的腹瀉病人的年齡在22歲～74歲之間，青年組(18～30歲)、中年組(31～59歲)和老年組(≥60歲)分別占感染副溶血弧菌腹瀉病人的52%、46%和2%。

2.3藥敏結果分析 通過藥敏實驗，發(fā)現這46株副溶血性弧菌中有四株耐藥株，主要耐藥的抗生素是氨芐西林，耐藥率為6.52%，共3株，且有41株副溶血弧菌對氨芐西林藥敏結果是中度敏感，2株敏感。其次頭孢西丁的耐藥率是2.17%，共1株，其余45株均敏感。有1株對氨芐西林和舒巴坦聯合抗菌藥是中度敏感，其他45株為敏感。46株副溶血弧菌對其他八種抗生素中敏率和耐藥率均為0(表1)。比較兩年間的副溶血弧菌耐藥情況發(fā)現，對氨芐西林耐藥的三株菌都在2015年，而2016年幾乎都對氨芐西林中度敏感。在2015年副溶血弧菌都對氨芐西林和舒巴坦敏感，但在2016年出現一株菌對兩種抗生素中度敏感。在2015年出現一株對頭孢西丁耐藥，但其余都對其敏感，而在2016年有兩株菌對頭孢西丁中度敏感，無耐藥株產生(表2)。根據不同類別的抗生素，對這十一種抗生素進行分類比較發(fā)現，副溶血弧菌對氨基糖胺類的慶大霉素，四環(huán)素類，氯霉素類，喹諾酮類的環(huán)丙沙星以及磺胺類的復方磺胺都很敏感，沒有耐藥株。而對β-內酰胺酶類的抗生素出現耐藥菌株(表3)。

表2 2015-2016年副溶血弧菌耐藥株情況比較(株)

表3 副溶血弧菌對β-內酰胺酶類抗生素的耐藥情況比較(株)

3 討論

3.1副溶血弧菌是我國沿海地區(qū)食物中毒和夏季腹瀉的重要病原，我國由副溶血性弧菌引起的食物中毒在微生物性食物中毒中位居第三，沿海地區(qū)的城市更是位居細菌性食物中毒的首位[1-4]。北京市順義區(qū)這次的調查結果，與三亞市、杭州市以及廣東省等沿海地區(qū)食物中毒病人副溶血型弧菌耐藥性研究相符，即都對青霉素類和頭孢菌素具有很高的耐藥率[5-7]。部分地區(qū)副溶血弧菌對氨基糖苷類的鏈霉素和慶大霉素有一定的耐藥率，其中杭州市一些食物中毒的病人對環(huán)丙沙星有較低耐藥率[6]。而順義區(qū)這次調查的菌株對上述抗生素幾乎都敏感，說明副溶血弧菌的耐藥性差異可能與地區(qū)、醫(yī)院和養(yǎng)殖業(yè)使用抗菌素的習慣及經驗用藥有關，以及菌株來源不同等因素綜合所致。

3.2研究發(fā)現，男性腹瀉病人要略多于女性，感染副溶血弧菌的腹瀉病人多集中在青年和中年，兩者總和高達98%，這與同期順義區(qū)相關文獻結果差異不大[8]。從耐藥情況來看，46株感染性副溶血弧菌僅對氨芐西林和頭孢西丁耐藥，耐藥率都低于10%，對其他抗生素都是敏感的，這與近年來通州區(qū)情況大致相同[9]，耐藥情況與同期北京市調查結果相比較輕[10]，2016年調查順義區(qū)副溶血弧菌耐藥情況[11]，發(fā)現只對頭孢類完全耐藥，可以看出順義區(qū)人源性副溶血性弧菌的耐藥程度大致不變且并不是很嚴重。

3.3調查結果顯示，氨芐西林的中敏率為89.13%，而敏感率僅為4.35%，菌株中敏率較高的情況需要重視。頭孢西丁的中敏率為0，敏感率為97.83%，說明菌株對頭孢西丁的耐藥情況遠沒有氨芐西林嚴重。調查中還發(fā)現氨芐西林在2015年出現三株耐藥，而2016年未產生耐藥株。2015年存在一株頭孢西丁耐藥株，但在2016年也沒有耐藥株，需要加強監(jiān)測副溶血弧菌對頭孢西丁的耐藥情況，查閱近幾年文獻結果發(fā)現副溶血性弧菌對氨芐西林都有耐藥[12-13]；文獻中大多對頭孢唑林、頭孢噻吩等第一代頭孢菌類抗生素也具有較高耐藥率。頭孢西丁是一種半合成制得的抗生素，歸類于第二代頭孢菌素，文獻報道耐藥程度低于第一代頭孢菌素和氨芐西林類，耐藥株很少[14-15]。通過查閱北京地區(qū)相關文獻，在調查北京市副溶血弧菌耐藥情況，發(fā)現一代頭孢已達到耐藥，二代頭孢達到中度敏感，建議臨床使用三代頭孢[16]。而此次出現1株，由于耐藥譜很窄，尚不能說明副溶血弧菌也對其產生耐藥。臨床上經常使用舒巴坦氨芐西林聯合抗菌，此次調查出現對這兩種抗生素中度敏感的菌株，這在2016年房山區(qū)對副溶血弧菌的調查中也有顯示[17]，菌株出現多重耐藥現象，但順義區(qū)還未出現多重耐藥菌株的情況，但也需要提示臨床上治療由感染性副溶血性弧菌引起的腹瀉應注意此類抗生素的使用。

3.4此次使用的肉湯稀釋定量測定方法，使菌株可以對每種抗生素的敏感耐藥情況進行定量，比紙片定性法更加準確，精確到菌株對某種抗生素的每一個稀釋度的情況。建議臨床應以肉湯稀釋的藥敏試驗結果來選擇最佳治療方案，既合理使用抗生素，又可以監(jiān)測地區(qū)副溶血弧菌的耐藥情況，以此來減少副溶血性弧菌產生耐藥菌株的風險。