潘 勇 賈貴清 王 凱

(四川省人民醫(yī)院胃腸外科,成都610072)

直腸癌屬于現(xiàn)代日常生活中較為常見的一類消化道惡性腫瘤[1]。隨著人們生活水平的提高和飲食習(xí)慣的改變，近些年來的研究多有發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌發(fā)病率及死亡率每年均呈現(xiàn)上升的趨勢，嚴重威脅著人類生活質(zhì)量和身體健康[2，3]。癌癥的增殖和侵襲在結(jié)腸癌患者發(fā)病過程中占有重要的地位，但就目前的研究而言，關(guān)于直腸癌增殖和侵襲的機制尚未完全了解。miRNAs在體內(nèi)參與諸如細胞應(yīng)激、增殖、凋亡、脂肪代謝生物過程的信號通路調(diào)控，對腫瘤發(fā)生發(fā)展作用重大[4，5]。miR-21 是一種較為廣泛存在的miRNA，因在多種腫瘤組織中高表達，成為探討miRNA 在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中研究的熱點之一[6，7]。本文通過在直腸癌HT-29細胞系中研究AS-miR-21對直腸癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響，來探討其生理功能。

1 材料與方法

1.1材料 直腸癌HT29細胞株(上海賽默生物科技發(fā)展有限公司)、RPMI1640培養(yǎng)液(杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)、胰蛋白酶(美國賽默飛公司)、Lipofectamine?2000 Transfection Reagent(美國Invitrogen公司)、TaqMan?MicroRNA Reverse Trans-cription kit試劑盒(美國ABI公司)、白介素6試劑盒(美國賽默飛公司)、氯仿、異丙醇、酒精、結(jié)晶紫均為色譜純，均購于天津化工試劑廠。LightCycler 480高通量實時熒光定量PCR儀(美國羅氏公司)、YCP-50型培養(yǎng)箱(長沙華曦電子科技有限公司)、3-18KS型離心機(美國Sigma公司)、CX31型奧林巴斯顯微鏡(日本OLYMPUS公司)、96孔板和24孔板均購自上海晶安生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 細胞復(fù)蘇：首先取出凍存直腸癌HT29細胞株，迅速放置于37℃水浴鍋中融化，然后室溫低速1 000 r/min離心3 min，棄去上清，加入1 ml含有10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液將細胞重懸，然后置于培養(yǎng)皿中，放入含有5% CO2的37℃培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，當(dāng)生長至合適的細胞密度(70%至80%)時，對其進行傳代培養(yǎng)。

細胞轉(zhuǎn)染：其中AS-miR-21 (5′-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3′)以及無義序列(5′-AAGGCAAGCUGACCCUGAAGU-3′)均在生工生物進行合成，細胞轉(zhuǎn)染嚴格按照Invitrogen公司的Lipofecta-mine?2000 Transfection Reagent說明書進行操作，空白對照組不進行轉(zhuǎn)染，陰性對照組轉(zhuǎn)染miR-NC。

1.2.2細胞RNA提取 對轉(zhuǎn)染24 h后的直腸癌HT29細胞經(jīng)0.25%的胰酶進行消化，收集消化后的細胞懸液于15 ml離心管中；進行4 ℃低速(1 000 r/min)離心2 min，棄去上清，置于冰上；加入1 ml Trizol裂解液，重懸并混勻細胞，置于冰上；向Trizol裂解液中加入200 μl氯仿，劇烈震蕩細胞懸液，室溫放置5～10 min，然后4℃離心15 min(2 000 r/min)；離心之后取上層置于RNase-free離心管(1.5 ml)，添加等體積異丙醇，充分震蕩混勻后，于冰上放置30～40 min；取出離心管，然后4℃離心15 min(12 000 r/min)，得到RNA沉淀；采用500 μl，75%的酒精對RNA沉淀進行兩次的洗滌，而后風(fēng)干；加入50 μl RNase-free的水，室溫溶解RNA；采用NanoDrop對總抽提的RNA進行濃度的測定，而后置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3miRNA的反轉(zhuǎn)錄與定量PCR檢測 按照ABI公司的TaqMan?MicroRNA Reverse Transcrip-tion kit試劑盒操作說明書，對抽提的RNA進行體外反轉(zhuǎn)錄實驗，得到cDNA產(chǎn)物；反應(yīng)條件為：16℃，孵育30 min，42℃孵育30 min，85℃加熱5 min，4℃保存。以得到的cDNA為模版，進行熒光定量PCR，采用TaqMan?Universal PCR Master Mix 20 μl反應(yīng)體系，在羅氏LightCycler480儀器上操作，以U6作為表達檢測的內(nèi)參，ΔCT 表示miR-21的相對表達，其中ΔCT=|CTmiR-21-CTU6|；反應(yīng)條件為：95℃，預(yù)變性10 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，70℃ 30 s進行40個循環(huán)的擴增。

1.2.4CCK8檢測細胞增殖活力 采用CCK-8方法檢測HT-29細胞增殖能力，將轉(zhuǎn)染24 h后的HT29細胞分別以5 × 103細胞/每孔接種于96孔板中，在37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細胞生長到24、48和72 h時，每孔中分別加入10 μl CCK-8溶液，放入培養(yǎng)箱孵育30 min后，使用酶標讀數(shù)儀檢測細胞在450 nm 處的吸光度值。

1.2.5細胞劃痕實驗 取各轉(zhuǎn)染組HT29細胞106個接種至6孔板中，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)直至細胞密度達到90%以上；采用無菌槍頭在培養(yǎng)皿中均勻的進行劃痕，然后采用1×PBS對細胞洗滌3次，加入培養(yǎng)基后顯微鏡下拍照，即為0 h時細胞遷移情況；繼續(xù)置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，24 h后顯微鏡下拍照，記錄兩次拍照之間的劃痕距離，重復(fù)6次實驗，以遷移的平均距離反映各組直腸癌細胞的遷移能力。

1.2.6Transwell小室侵襲檢測 在Transwell小室基膜上鋪設(shè)基質(zhì)膠，將小室至于24孔板，室溫靜止5～10 min；將轉(zhuǎn)染后的細胞接種于小室上，小室中接種的細胞數(shù)量為5×104個/ml；然后將孔板至于37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h；取出Transwell小室置于室溫，并擦拭小室基膜表面細胞后，用95%的酒精固定15 min，之后再用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，用雙蒸水清洗后并拍照，記錄每組發(fā)生侵襲的細胞數(shù)量，其中每組實驗重復(fù)6次。

1.2.7白介素6的檢測 采用酶聯(lián)免疫法對癌細胞培養(yǎng)上清中IL-6濃度進行檢測： IL-6單抗包被于酶標板上，血清中的 IL-6與單抗結(jié)合；加入生物素標記IL-6二抗，在酶標板上形成抗體-抗原-酶標抗體免疫復(fù)合物；加入顯色液進行顯色處理；用酶標儀測量在450nm 波長下的吸光度值，通過繪制標準曲線計算血漿中IL-6濃度。具體操作步驟如下：濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋，混勻后備用；將標準品進行稀釋，并得到 200 pg/ml的高濃度標準品，然后依次稀釋為：100、50、25、12.5、6.25、3.13、0 pg/ml；在酶標板上加入 100 μl標準品及待測樣品，每個樣品加一個孔；混勻后封住板孔，室溫孵育2 h；去除酶標板內(nèi)液體，并洗滌反應(yīng)板(每孔內(nèi)加入 300 μl洗滌液)，每次洗滌后完全去除液體，反復(fù)洗滌3次；每孔加入 100 μl IL-6抗體生物素液，混勻后室溫孵育1 h；去除酶標板內(nèi)液體，并洗滌反應(yīng)板(每孔內(nèi)加入300 μl 洗滌液)，每次洗滌后完全去除液體，反復(fù)洗滌3次；每孔加入 100 μl酶聯(lián)結(jié)合液，混勻后室溫孵育30 min；去除酶標板內(nèi)液體，并洗滌反應(yīng)板(每孔內(nèi)加入 300 μl洗滌液)，每次洗滌后完全去除液體，反復(fù)洗滌3次；每孔加入 100 μl顯色液，混勻后室溫孵育30 min；反應(yīng)完成后，在每孔中加入 50 μl終止液，混勻，在450 nm 波長的酶標儀上讀取吸光度值；以濃度為Y軸，吸光度為X軸，繪制標準曲線；將待測樣本的吸光度帶入標準曲線對應(yīng)的方程中，計算待測樣本的濃度。

2 結(jié)果

2.1各組HT29細胞中miR-21表達水平比較 通過定量PCR檢測各轉(zhuǎn)染組細胞中miR-21的相對表達量發(fā)現(xiàn)，在AS-miR-21組中miR-21的表達顯著降低，平均為(2.42±0.27)ΔCT，而陰性對照組中miR-21的表達平均為(3.24±0.32)ΔCT，空白對照組中miR-21的表達平均為(3.19±0.48)ΔCT，相比于AS-miR-21組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.797，P=0.001；t=3.425，P=0.007)，見表1。

表1 各組細胞中miR-21表達水平比較

Note：1)P<0.05， compared to AS-miR-21 group.

圖1 AS-miR-21對HT29細胞增殖活性的影響Fig.1 Effect of AS-miR-21 on proliferation activity of HT29 cellsNote: *.P<0.05，* *.P<0.01.

2.2AS-miR-21對HT29細胞增殖活性的影響 轉(zhuǎn)染24、48、72 h后檢測各組細胞OD450 nm吸光值發(fā)現(xiàn)，AS-miR-21組的增殖活性在轉(zhuǎn)染24 h后顯著下降，與陰性對照組以及空白對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.588，P=0.028)，并且在48、72 h后增殖率均低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=22.83,P<0.001；F=31.09,P<0.001)，見圖1。

2.3AS-miR-21對HT29細胞遷移能力的影響 細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，AS-miR-21組HT29細胞遷移距離平均為(61.5±6.2)μm，相比于陰性對照組HT29細胞遷移平均距離為(97.6±9.7)μm，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.681，P<0.05)。相比于空白對照組HT29細胞遷移平均距離為(101.3±9.2)μm，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.787，P<0.05)，而陰性對照組HT29細胞遷移與空白對照組HT29細胞遷移平均距離相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.680，P=0.513)，見圖2。

2.4AS-miR-21對HT29細胞侵襲能力的影響 Transwell小室實驗表明，轉(zhuǎn)染AS-miR-21組HT29細胞侵襲數(shù)目平均為(17.5±3.8)個，陰性對照組HT29細胞侵襲數(shù)目平均為(56.5±9.8)個，空白對照組HT29細胞侵襲數(shù)目平均為(59.7±11.2)個。三組HT29細胞侵襲數(shù)目相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=42.12，P<0.05)，其中AS-miR-21組HT29細胞侵襲數(shù)目顯著低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.089，P<0.05)，AS-miR-21組HT29細胞侵襲數(shù)目也顯著低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.740，P<0.05)，見圖3。

圖2 不同組細胞遷移能力的比較(×200)Fig.2 Comparison of cell migration ability in different groups (×200)

圖3 不同組HT29細胞侵襲能力的比較(×200)Fig.3 Comparison of invasive ability of HT29 cells in different groups (×200)

表2 各組細胞IL-6濃度的比較

Note：1)P<0.05， compared to AS-miR-21 group.

2.5AS-miR-21對HT29細胞IL-6表達的影響 在AS-miR-21組中IL-6的濃度顯著降低，平均為(21.33±5.86)pg/ml，而陰性對照組中IL6的濃度平均為(58.62±10.43)pg/ml，空白對照組中miR-21的表達平均為(63.21±11.24)pg/ml，相比與AS-miR-21組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.635，P<0.05；t=8.093，P<0.05)，見表2。

3 討論

直腸癌的發(fā)病率和死亡率均在國內(nèi)外有上升趨勢，是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，其出現(xiàn)化療耐藥及侵襲轉(zhuǎn)移為預(yù)后差的主因[8]，嚴重威脅著人類的生命安全。直腸癌發(fā)病具有隱匿性，多數(shù)直腸癌患者確診時已為晚期，其侵襲轉(zhuǎn)移機制與多種癌基因及抑癌基因的異常表達相關(guān)[9]。以放化療為主的綜合治療療效欠佳，探索新的治療方案提高結(jié)腸癌患者生存質(zhì)量是目前研究關(guān)注熱點[10]。惡性腫瘤組織最明顯的生物學(xué)特性為腫瘤細胞的增殖、侵襲，如何有效抑制惡性腫瘤增殖和侵襲能力對病情控制及提高生存期意義重大[9-10]。

腫瘤的增殖與侵襲與諸多因素密切相關(guān)，miRNA 對腫瘤增殖和侵襲相關(guān)基因表達的調(diào)控作用是目前研究的熱點，miRNA-34、miRNA-21、miRNA-143、miRNA-198、miRNA-224等均與直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中miRNA-21 是目前研究最廣泛的miRNA，在結(jié)直腸癌中存在高水平表達[11-13]。Yamamichi等[14]對34 例手術(shù)切除的直腸癌與39 例內(nèi)鏡下切除的進展期結(jié)直腸癌采用核酸原位雜交發(fā)現(xiàn)從癌前息肉到癌癥早期miRNA-21 持續(xù)高表達，并且是逐漸升高趨勢，miRNA-21 還可能被用于預(yù)后檢測，Oue等[15]研究發(fā)現(xiàn)對直腸癌腫瘤組織miRNA-21 進行檢測，結(jié)果提示miRNA-21 高表達預(yù)示預(yù)后不良，但是CEA 水平與miRNA-21 表達水平并無明顯相關(guān)性[16]；由此可見，miRNA-21 表達上調(diào)是影響直腸癌預(yù)后的重要因素，其與直腸癌細胞增殖、侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期密切相關(guān)。反義寡核苷酸(Antisense oligonucleotide，ASO)是一類2′-甲氧基修飾、能有效敲除miRNA 功能的方法，通過導(dǎo)入細胞相應(yīng)AS-miRNA，與細胞內(nèi)源miRNA分子發(fā)生特異性堿基互補配對，抑制內(nèi)源miRNA 介導(dǎo)的RNA-induced silencing complex(RISC)活性，從而阻止miRNA 功能發(fā)揮[17]。李民等[18]通過在膠質(zhì)瘤U87細胞系中，轉(zhuǎn)染反義miR-21進行研究發(fā)現(xiàn)，AS-miR-21可以通過下調(diào)細胞內(nèi)源hTERT的表達，一方面抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖，另一方面誘導(dǎo)細胞的凋亡過程；王曉玫等[19]對宮頸鱗狀癌細胞系CaSki的研究發(fā)現(xiàn)，AS-miR-21 轉(zhuǎn)染可敲低CaSki 細胞中miR-21表達，并有效抑制細胞增殖活性，促進細胞凋亡。

我們在體外對HT29直腸癌細胞系進行研究發(fā)現(xiàn)，通過轉(zhuǎn)染AS-miR-21，可以降低細胞內(nèi)源miR-21的表達，從而顯著抑制癌細胞的增殖活力，并且隨著時間的延長，其增殖活力逐漸下降，相比于陰性對照組以及空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染AS-miR-21組的癌細胞在遷移距離上，要顯著低于陰性對照組和空白對照組，表明AS-miR-21的高表達能夠顯著抑制癌細胞的遷移能力，通過Transwell小室實驗對各組細胞的侵襲能力進行評估發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染AS-miR-21組的癌細胞，其侵襲能力顯著下降，相比于陰性對照組以及空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明AS-miR-21的高表達可抑制癌細胞的侵襲能力；對細胞培養(yǎng)液上清中的IL-6進行檢測發(fā)現(xiàn)，細胞中AS-miR-21的高表達，能夠顯著降低其培養(yǎng)上清中IL-6的濃度，表明在直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中，miR-21可能通過影響IL-6的表達，參與機體的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

綜上所述，在直腸癌HT29細胞系中，AS-miR-21通過降低細胞內(nèi)源miR-21的表達，從而削弱癌細胞的增殖活力，抑制其侵襲能力以及遷移活性，在臨床治療直腸癌中具有潛在的臨床價值，為臨床治療以及預(yù)后監(jiān)測提供新思路。