廖偉聰 黃建芳 向軍儉 馮沛然 何亞運 張 宇

(暨南大學抗體工程研究中心，廣東省分子免疫與抗體工程重點實驗室，廣州510632)

細胞程序性凋亡配體(Programmed cell death ligand-1，PD-L1)在腫瘤微環(huán)境中的異常高表達被認為是腫瘤免疫逃逸的作用之一。PD-L1通過與表達在免疫細胞上的PD-1相互作用，往往可導致免疫細胞上PD-1抑制性信號的活化與轉導，從而發(fā)揮強有力的免疫抑制作用。而相關研究報道，在某些腫瘤環(huán)境中PD-L1的異常高表達，能抑制免疫系統(tǒng)清除功能，促進腫瘤進展并導致腫瘤免疫逃逸[1-4]。

PD-1/PD-L1抗體藥物是當前腫瘤免疫療法中最受矚目的抗體靶向藥物，其作用機理主要是通過阻斷T細胞PD-1與腫瘤細胞PD-L1的結合來削弱T細胞上PD-1介導的抑制作用，從而增強免疫系統(tǒng)對腫瘤的殺傷作用[5,6]。目前已有PD-1抗體藥物Keytruda和Opdivo,PD-L1抗體藥物Tecentiq、Imfinzi和Bavencio等5個PD-1/PD-L1抗體藥物在國外上市。

PD-1/PD-L1免疫療法在多種難治愈的癌癥上都具有良好的治療效果，但其總體治療的客觀反應率偏低[7,8]。Topalian等[9]通過觀察42名患有多種實體瘤的患者，發(fā)現(xiàn)有36%PD-L1陽性患者對使用Nivolumab存在客觀反應，而PD-L1陰性患者則無一例產(chǎn)生客觀反應，提示實體瘤的PD-L1表達量與PD-1/PD-L1抗體藥物療效呈正相關。Balar等[10]發(fā)現(xiàn)經(jīng)典霍奇金淋巴瘤(Classical hodgkin lymphoma，CHL)是普遍高表達PD-L1/2的癌癥，而臨床試驗發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1免疫抑制劑療法對CHL患者有很好的療效(CHL患者經(jīng)Nivolumab治療后，66%的患者的腫瘤出現(xiàn)萎縮，甚至有7例患者的腫瘤完全消失[11])。綜上提示，PD-1/PD-L1抗體藥物療效與PD-L1表達量呈正相關，然而并非所有類型的腫瘤均高表達PD-L1，且臨床上腫瘤患者的PD-L1表達也呈現(xiàn)多樣性，因此在PD-1/PD-L1靶向藥物治療前對患者進行PD-L1表達強度分析顯得尤為重要。

綜上所述，對腫瘤患者的PD-L1表達量檢測分析能一定程度上判斷PD-1/PD-L1靶向藥物的治療效果，為臨床上PD-1/PD-L1靶向藥物的個體化及最佳化治療提供一定的參考價值。

目前，大部分PD-L1單抗的研究主要集中于研究其抑瘤效果，而從其檢測效果出發(fā)研究的很少，本研究主要側重于其對腫瘤PD-L1表達水平的檢測。本研究通過單克隆細胞株的制備及對單克隆抗體的鑒定和腫瘤細胞、組織驗證，篩選出高親和力、高特異性的抗人PD-L1單抗的雜交瘤細胞株，該株抗體為患者個體化使用PD-1/PD-L1靶向藥物以及患者最佳療法篩選的后續(xù)研究提供重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 人PD-L1重組蛋白(Novop-rotein，Catalog# C315)，HAT/HT、弗氏佐劑(完全、不完全)、PEG2000均購自Sigma，胎牛血清(Gemini，Catalog# 900-108)，單抗亞類檢測試劑盒SBA Clonotyping System-HRP ( Southern-Biotech，Catalog #5300-05)，酶標二抗(KPL，Catalog # 074-1086)，Protein G親和層析柱(GE，5 ml)，惡性腫瘤組織芯片(西安艾麗娜生物科技有限公司)。

1.1.2實驗材料 SPF級BALB/c純系雌性小鼠，周齡為6周，購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心；SP2/0小鼠骨髓瘤細胞株(丹麥株)、K562、OV2008、C13、H1299等腫瘤細胞株(本實驗室保存)。

1.2方法

1.2.1抗PD-L1單克隆抗體的制備 使用重組PD-L1胞外段蛋白以腹部皮下多點免疫的方法免疫7周齡BALB/c小鼠，免疫劑量為50 μg/只[12]。采用常規(guī)細胞融合和間接ELISA等方法篩選出4株陽性克隆株。小鼠腹腔注射雜交瘤細胞制備腹水，腹水經(jīng)飽和硫酸銨沉淀和Protein G親和層析純化后凍干備用。

1.2.2PD-L1單抗Ig類及亞類的鑒定 使用SBA Clonotyping System-HRP試劑盒對篩選的單抗的Ig類及亞類進行測定，所有操作嚴格依照試劑盒說明書操作。

1.2.3PD-L1單抗特異性的鑒定 PD-L2蛋白以0.5 μg/ml包板，采用5%脫脂奶粉封閉；檢測單抗以OD450值約為2的稀釋倍數(shù)進行稀釋加樣，其余步驟參照常規(guī)間接ELISA操作。

1.2.4PD-L1單抗親和常數(shù)的測定 非競爭酶免疫實驗測定其親和常數(shù)( Affinity constant，Ka)。參考Beatty等[13]的方法，按照公式Ka=(n-1)/2(n[Ab′]-[Ab]t)計算親和常數(shù)Ka值。

1.2.5Western blot檢測腫瘤細胞PD-L1的表達 使用強裂解液將腫瘤細胞裂解提取總蛋白[14]，總蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后再電轉到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉膜后加入濃度為1 μg/ml的Ab3單抗，4℃過夜孵育后取出膜并用PBS-T洗滌3次，加入HRP酶標二抗(1∶8 000) 室溫孵育1 h，PBS-T洗滌5次，加入ECL化學發(fā)光液反應，膠片曝光后進行顯影和定影，并掃描膠片，灰度軟件分析其灰度差異。

1.2.6免疫組化檢測腫瘤組織PD-L1的表達 選擇高中低PD-L1表達水平的膀胱癌和黑色素瘤病理組織芯片為檢測樣本，免疫組化采用常規(guī)的S-P法，用本研究制備的Ab3單抗為一抗(工作濃度10 μg/ml)，其余步驟嚴格按照試劑盒操作步驟進行；腫瘤組織切片厚度約為2 μm。用DAB顯色和蘇木紫復染；在倒置顯微鏡下觀察，拍照并進行圖像分析。判斷標準：細胞膜或細胞質被染上棕黃色的腫瘤細胞為PD-L1陽性細胞；陽性率<25%為低表達，陽性率在25%～50%為中度表達，陽性率>50%為高表達。

1.3統(tǒng)計學分析 采用Graph Pad Prism 5.0軟件進行作圖，并分析不同數(shù)據(jù)間統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1PD-L1單克隆制備 以重組人PD-L1胞外段蛋白為免疫原，BALB/c小鼠經(jīng)3次免疫后，取最高滴度免疫血清的小鼠進行細胞融合，通過有限稀釋法篩選陽性細胞株，共獲得4株可穩(wěn)定分泌抗人PD-L1單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為Ab1、Ab2、Ab3、Ab4。經(jīng)體內誘生制備腹水，腹水經(jīng)飽和硫酸銨沉淀和Protein G純化后，用SDS-PAGE凝膠電泳鑒定其純度，結果如見圖1所示，在分子量為50 kD和25 kD位置左右清晰可見抗體重鏈、輕鏈條帶，無雜帶，抗體純化效果良好。

2.2PD-L1單抗特異性鑒定 結果如表1所示，使用單抗亞類檢測試劑盒測定單抗亞類，除Ab2是IgG2a類外都是IgG1類抗體。純化后的單抗ELISA效價為4.1～20.0 ng/ml之間；制備的單抗與PD-L2蛋白均無交叉反應；采用非競爭酶聯(lián)免疫實驗測定4株單抗親和常數(shù)，其中Ab3單抗的親和常數(shù)最高，為7.85×109M-1。

2.3Western blot檢測腫瘤細胞PD-L1表達水平 用Western bolt檢測不同腫瘤細胞裂解液中的PD-L1，結果如圖2A所示，Ab3抗體能與多種腫瘤細胞(OV2008、C13、K562、H1299、MCF-7)中PD-L1蛋白結合，無明顯雜帶，說明抗體特異性良好。WB條帶應用Quantity One軟件，通過比較WB條帶的灰度分析腫瘤細胞間PD-L1的相對表達量，結果如圖2B所示， OV2008細胞株的PD-L1表達水平相對最高，

圖1 抗人PD-L1單克隆抗體的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of anti-hPD-L1 MabsNote: M.Protein Marker；1.Ab1；2.Ab2；3.Ab3；4.Ab4.

表1 單抗特異性鑒定

Note："-"Indicating that the OD450 value is less than twice the negative value,proved no cross-reaction with the PD-L2 protein.

C13細胞株的PD-L1表達水平相對最低。結果表明，Ab3抗體能與天然PD-L1蛋白結合，并能通過WB方法檢測腫瘤細胞PD-L1蛋白的相對表達量。

2.4免疫組化檢測膀胱癌和黑色素瘤組織PD-L1的表達水平 用免疫組化和Ab3單抗檢測不同分期的膀胱癌和黑色素瘤組織切片；采用高倍鏡下人工閱片的方式統(tǒng)計病理切片PD-L1陽性細胞率(PD-L1陽性細胞/總細胞數(shù))。其中不同PD-L1表達水平的膀胱癌組織切片的PD-L1陽性率分別為8.3%、47.7%、97.5%(見圖3)，其PD-L1陽性率符合高中低PD-L1表達水平的膀胱癌組織芯片的預期結果。而黑色素瘤組織切片PD-L1陽性率分別為11.4%、40.5%、100%(見圖4)，其PD-L1陽性率符合高中低PD-L1表達水平的黑色素瘤組織芯片的預期結果。膀胱癌和黑色素瘤組織芯片PD-L1陽性率的結果表明，Ab3單抗能檢測出不同分期的膀胱癌和黑色素瘤組織中 PD-L1的不同表達水平。

圖2 Western blot分析不同腫瘤細胞PD-L1表達水平Fig.2 Expression level of PD-L1 in different kinds of tumor cell lines were analyzed by Western blotNote: A.Western blot；B.Relative grayscale level.

圖3 Ab3單抗免疫組化檢測膀胱癌組織PD-L1表達水平Fig.3 PD-L1 expression level of bladder cancer by using ICH and Ab3 MabNote: →.The arrows indicated the PD-L1 positive cells;A.Low expression cases(8.3%);B.Moderate expression cases(47.7%);C.High expression cases(97.5%).

圖4 Ab3單抗免疫組化檢測黑色素瘤PD-L1表達水平Fig.4 PD-L1 expression level of Melanoma cancer by using ICH and Ab3 MabNote: →.The arrows indicated the PD-L1 positive cells;A.Low expression cases(11.4%);B.Moderate expression cases(40.5%);C.High expression cases(100%).

3 討論

在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細胞上調PD-L1表達，當腫瘤細胞的PD-L1與T細胞上的PD-1相互結合，從而抑制了T細胞的活化增殖，導致T細胞失能。這是由于腫瘤細胞不能像正常免疫調節(jié)那樣，通過單核吞噬細胞等免疫細胞上PD-L1與T細胞上PD-1識別結合激活PD-1/PD-L1信號通路，進而導致腫瘤免疫逃逸[15,16]。臨床試驗數(shù)據(jù)顯示患者的PD-L1表達水平與PD-1/PD-L1抑制劑免疫療法的收益存在明顯正相關性，PD-L1對患者使用PD-1/PD-L1抗體藥物的預后評價具有重要意義。

免疫組化檢測腫瘤患者免疫檢查點PD-L1的表達水平作為腫瘤患者精準治療的重要推薦判斷標準[8]。臨床上免疫組化檢測患者腫瘤組織切片上PD-L1表達水平，有助于優(yōu)化PD-1/PD-L1抑制劑免疫療法治療腫瘤患者的預后，提高患者用藥受益。本研究獲得Ab3單抗具有較高親和力，Ab3單抗的效價和親和力常數(shù)分別為4.1 ng/ml、7.85×109M-1。Western blot結果表明Ab3單抗能特異性識別腫瘤細胞上的天然PD-L1，并能檢測不同分期的膀胱癌、黑色素瘤組織切片的PD-L1表達水平的差異，表明Ab3單抗可開發(fā)成腫瘤病理診斷抗體。

致謝:感謝暨南大學第一臨床學院病理科陸元志教授給予免疫組化實驗技術的熱情指導和大力幫助。