馬鳳巧 張 珊 王衛(wèi)娜 薛士鵬

(南陽醫(yī)學高等專科學?；A(chǔ)醫(yī)學部,南陽473000)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病(Neurodegenerative diseases，NDD)包括帕金森氏病、阿爾茨海默病(AD)等，是一組慢性進行性中樞神經(jīng)組織退行性疾病，給人們的生活質(zhì)量造成嚴重影響。隨著我國老齡化人口增加，患病率呈現(xiàn)日益升高趨勢，目前NDD的發(fā)病機制尚未完全明確[1,2]。選擇有效的防治該組疾病的藥物尤為重要。荔枝核是荔枝的干燥成熟種子，具有抗腫瘤、抑菌、抗氧化、抗炎等多種作用。荔枝核總皂苷(Lychee seed saponins，LSS)是荔枝核的提取物，有研究顯示，LSS可降低Aβ在AD大鼠海馬中的沉積，減少Cyt-C釋放，從而減輕由STZ誘導的海馬神經(jīng)元凋亡[3]。這提示LSS可能在NDD治療中發(fā)揮重要作用。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是一種細菌內(nèi)毒素，被認為是刺激大腦產(chǎn)生炎癥的一種炎癥原，可促進NDD的發(fā)生及進展[4]。PC12細胞是大鼠的嗜鉻細胞瘤細胞，目前被廣泛用作神經(jīng)元模型，用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。有研究顯示，LPS可誘導PC12細胞凋亡[5]。LSS是否可降低由LPS誘導的PC12細胞損傷目前還未明確。因此，本研究通過LPS刺激PC12細胞，檢測LSS對細胞存活率、凋亡率及免疫的影響，并研究其可能的分子機制，為NDD的防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器 LSS由鄭州大學藥學院制備；LPS及MTT購自美國Sigma；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco；H2DCFHDA購自碧云天生物技術(shù)研究所；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡試劑盒及流式細胞儀均購自美國BD；PI3K、p-AKT、cyclinD1、Bax、HIF-1α、VEGF抗體購自美國Abcam；分光光度計購自上海光譜儀器有限公司；自動酶標儀購自美國Bio-Tek。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) PC12細胞(大鼠嗜鉻細胞瘤細胞)購自中國科學院上海細胞庫。細胞復蘇后在DMEM培養(yǎng)基(含有5%胎牛血清、10%馬血清及1%雙抗)中，于5%體積分數(shù)CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，每2 d換液一次，按照實驗需要傳代。實驗為生長至對數(shù)期的細胞。

1.2.2LSS對PC12細胞存活率的影響 以2×104ml-1接種生長至對數(shù)期的PC12細胞于96孔板，每孔中加入100 μl，于5%體積分數(shù)CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)過夜，隨機分為對照組(加入細胞懸液)和LSS組(3.75、7.5、15、30、60 mg/L的LSS處理細胞)，每組設(shè)置6個復孔，24 h后，每孔中加入50 μl的MTT溶液(5 mg/ml)，培養(yǎng)4 h后將培養(yǎng)液吸棄，在每孔中加入150 μl的DMSO，充分混勻后，490 nm處，酶標儀測定吸光度(A)。計算細胞存活率。根據(jù)LSS對PC12細胞的抑制率選擇LSS的最佳作用濃度，用于后續(xù)試驗。

1.2.3LSS對LPS誘導的PC12細胞存活率的影響 隨機將PC12細胞分為對照組(細胞不做任何處理)、LPS處理組(用終濃度為1 mg/ml的LPS處理PC12細胞24 h)、LSS處理組(終濃度為3.75 mg/L的LSS孵育細胞24 h后，再用1 mg/ml的LPS處理PC12細胞24 h)。每組設(shè)置5個復孔，參照1.2.2方法檢測各組細胞存活率。

1.2.4LSS對LPS誘導的PC12細胞凋亡的影響 取1.2.3分組處理至規(guī)定時間的3組細胞，胰酶消化細胞，離心后用預冷的PBS洗滌細胞，收集約105個細胞，在每500 μl中分別加入5 μl的Annexin V-FITC和5 μl的PI，輕輕混勻，避光環(huán)境室溫孵育10 min，1 h內(nèi)上機，流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

1.2.5LSS對LPS誘導的PC12細胞ROS含量的影響 將生長至對數(shù)期的PC12細胞制備成細胞懸液，以(1～2)×104個/ml細胞密度接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，觀察到細胞貼壁生長達80%～90%時，按照1.2.3分組處理細胞，收集處理至規(guī)定時間的細胞，懸浮細胞于含有10 μmol/L終濃度的H2DCFHDA的無血清培養(yǎng)液中，培養(yǎng)箱內(nèi)37℃孵育20 min，無血清的培養(yǎng)液及PBS洗滌細胞，PBS重懸細胞后，于488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長，通過熒光分光光度計檢測各組的相對熒光強度(OD值)，從而可反映出細胞內(nèi)的ROS水平。實驗重復3次。

1.2.6PI3K、p-AKT、cyclinD1、Bax、HIF-1α、VEGF蛋白表達檢測 適量的RIPA裂解液提取1.2.3分組處理至規(guī)定時間的3組細胞總蛋白，BCA試劑盒對蛋白濃度測定。取40 μg總蛋白，經(jīng)12%SDS-PAGE電泳后通過電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，將轉(zhuǎn)好的膜用5%的脫脂奶粉封閉，2 h后加入稀釋好的PI3K、p-AKT、cyclinD1、Bax、HIF-1α、VEGF抗體，4℃搖床孵育過夜，將一抗棄去，加入二抗稀釋液，室溫孵育2 h，棄去二抗，洗膜，ECL顯色，顯影后，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，通過凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目的蛋白相對于內(nèi)參GAPDH蛋白的光密度值。

2 結(jié)果

2.1LSS對P12細胞存活率的影響 0、3.75、7.5、15、30、60 mg/L的LSS處理P12細胞24 h，細胞存活率檢測結(jié)果如圖1所示，各濃度細胞存活率分別為100%、(97.18±1.67)%、(95.45±3.77)%、(78.45±6.56)%、(63.69±5.08)%、(51.34±6.12)%，0、3.75、7.5、15、30、60 mg/L的LSS處理P12細胞24 h，細胞存活率檢測結(jié)果整體比較差異具有統(tǒng)計學意義(F=58.905，P=0.000)；3.75 mg/L和7.5 mg/L的LSS對PC12細胞存活率的影響與0 mg/L LSS比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而15、30和60 mg/L的 LSS均能顯著降低PC12細胞存活率，與0 mg/L LSS比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。因此，選擇3.75 mg/L的 LSS為研究對象。

2.2LSS對LPS誘導的PC12細胞存活率的影響 對照組、LPS組和LSS組細胞存活率分別為100%、(54.68±5.62)%、(78.86±6.13)%，整體比較差異具有統(tǒng)計學意義(F=66.919,P=0.000)，LPS組細胞存活率顯著低于對照組(P<0.05)，而LSS組細胞存活率顯著高于LPS組(P<0.05)。見圖2。

2.3LSS對LPS誘導的PC12細胞凋亡率的影響 對照組、LPS組和LSS組細胞凋亡率分別為(1.53±0.21)%、(22.16±1.45)%、(10.47±0.74)%，三組整體比較差異具有統(tǒng)計學意義(F=357.533,P=0.000)，LPS組細胞凋亡率顯著高于對照組(P<0.05)，而LSS組細胞凋亡率顯著低于LPS組(P<0.05)。見圖3。

圖1 LSS對P12細胞存活率的影響Fig.1 Effect of LSS on survival rate of P12 cellsNote: *.P<0.05 vs 0 mg/L LSS.

圖2 LSS對LPS誘導的PC12細胞存活率的影響Fig.2 Effect of LSS on survival rate of PC12 cells induced by LPSNote: *.P<0.05 vs Control group；#.P<0.05 vs LPS group.

2.4LSS對LPS誘導的PC12細胞ROS水平的影響 對照組、LPS組和LSS組細胞的ROS含量分別為323.45±12.39、447.83±20.67、368.26±16.74，3組 的ROS含量整體比較差異具有統(tǒng)計學意義(F=41.481,P=0.000)，LPS組細胞ROS含量明顯高于對照組(P<0.05)，而LSS組細胞ROS含量明顯低于LPS組(P<0.05)。見圖4。

2.5LSS對LPS誘導的PC12細胞HIF-1α和VEGF表達的影響 通過Western blot檢測各組細胞免疫抑制因子HIF-1α和VEGF的蛋白表達，結(jié)果如圖5所示，對照組、LPS組和LSS組HIF-1α的蛋白表達分別為(0.062±0.010)、(0.278±0.032)、(0.162±0.024)，VEGF的蛋白表達分別為(0.130±0.015)、(0.579±0.043)、(0.244±0.021)，3組HIF-1α的蛋白表達和VEGF的蛋白表達比較差異具有統(tǒng)計學意義(FHIF-1α=61.864,PHIF-1α=0.000;FVEGF=194.924,PVEGF=0.000), LPS組細胞HIF-1α和VEGF的蛋白表達均明顯高于對照組(P<0.05)，而LSS組細胞HIF-1α和VEGF的蛋白表達均明顯低于LPS組(P<0.05)。

圖3 LSS對LPS誘導的PC12細胞凋亡率的影響Fig.3 Effect of LSS on apoptosis rate of PC12 cells induced by LPSNote: A.The rate of apoptosis was detected by flow cytometry;B.The rate of apoptosis in each group of cells;*.P<0.05 vs Control group;#.P<0.05 vs LPS group.

圖4 LSS對LPS誘導的PC12細胞ROS水平的影響Fig.4 Effect of LSS on ROS level of PC12 cells induced by LPSNote: *.P<0.05 vs Control group；#.P<0.05 vs LPS group.

圖5 LSS對LPS誘導的PC12細胞HIF-1α和VEGF表達的影響Fig.5 Effect of LSS on expression of HIF-1α and VEGF induced by LPSNote: A.HIF-1α and VEGF protein expression electrophoresis;B.The relative expression of HIF-1 α and VEGF protein;*.P<0.05 vs Control group;#.P<0.05 vs LPS group.

圖6 LSS對LPS誘導的PC12細胞PI3K/AKT信號通路的影響Fig.6 Effect of LSS on PI3K/AKT signaling pathway induced by LPSNote: A.Protein expression electrophoresis;B.Relative expression of protein;*.P<0.05 vs Control group;#.P<0.05 vs LPS group.

2.6LSS對LPS誘導的PC12細胞PI3K/AKT信號通路的影響 通過Western blot檢測各組細胞PI3K/AKT信號通路PI3K、p-AKT和下游cycyinD1、Bax的蛋白表達，結(jié)果如圖6所示，對照組、LPS組和LSS組PI3K的蛋白表達分別為0.561±0.050、0.168±0.021、0.492±0.035，p-AKT的蛋白表達分別為0.147±0.018、0.068±0.009、0.117±0.013，cycyinD1的蛋白表達分別為0.268±0.024、0.105±0.015、0.216±0.021，Bax的蛋白表達分別為0.103±0.011、0.388±0.032、0.195±0.025，3組p-AKT、cycyinD1和Bax的蛋白表達比較差異具有統(tǒng)計學意義(Fp-AKT=95.122,Pp-AKT=0.000;FcycyinD1=50.234,PcycyinD1=0.000;FBax=107.575,PBax=0.000),LPS組細胞PI3K、p-AKT和cyclinD1的蛋白表達均明顯低于對照組(P<0.05)，Bax的蛋白表達高于對照組(P<0.05)；而LSS組細胞PI3K、p-AKT和cycyinD1的蛋白表達均明顯高于LPS組(P<0.05)，Bax的蛋白表達低于LPS組(P<0.05)。

3 討論

荔枝核是無患子科植物荔枝的干燥成熟種子，現(xiàn)代的藥理學發(fā)現(xiàn)，其有抗氧化、改善胰島素抵抗、降血糖等多種作用[6]。有研究顯示，荔枝核的提取物可降低T2DM認知障礙大鼠高胰島素血癥和高血糖，從而改善由此引起的大鼠的學習和記憶障礙[7]。這提示荔枝核提取物在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中發(fā)揮重要作用。LSS為荔枝核的一種提取物，有研究顯示，LSS可對Aβ25-35誘導的AD大鼠海馬神經(jīng)元損傷起保護作用[3]。LPS為一種細菌內(nèi)毒素，目前廣泛用于NDD中神經(jīng)元模型的建立[8]。PC12細胞為一種兒茶酚胺樣細胞，作為一種體外的細胞模型，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如AD)、神經(jīng)元發(fā)育分化、神經(jīng)再生等發(fā)病機制方面具有廣泛應(yīng)用[9-11]。有研究發(fā)現(xiàn)，LPS可增加PC12細胞的毒性，誘導細胞凋亡[12]。本研究中試圖證實LSS對LPS誘導的PC12細胞增殖、凋亡、免疫的影響。3.75～60 mg/L的LSS處理PC12細胞，細胞存活率檢測發(fā)現(xiàn)，3.75 mg/L和7.5 mg/L的LSS對細胞存活率無影響，15～60 mg/L的 LSS均能顯著降低PC12細胞存活率，這提示≥15 mg/L的LSS可能對PC12細胞產(chǎn)生毒性作用，因此本研究中選擇3.75 mg/L的 LSS為研究對象。通過MTT及流式細胞儀分別檢測LSS對LPS誘導的細胞存活率及凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)LSS可明顯提高由LPS引起的PC12細胞存活率降低，也降低細胞凋亡率。這提示LSS可降低由LPS引起的PC12細胞損傷。

氧化應(yīng)激是體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)失調(diào)而引起NO、H2O2等活性氧物質(zhì)增多現(xiàn)象，其最終的歸宿為細胞的壞死和凋亡。有研究表明，氧化應(yīng)激可直接參與包括AD在內(nèi)的多種NDD疾病的病理過程[13,14]。LPS可通過升高PC12細胞內(nèi)ROS水平，誘導細胞發(fā)生凋亡，而降低ROS水平可抑制PC12凋亡[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，LSS可降低由LPS誘導的ROS水平升高，這提示LSS對PC12凋亡的一個影響機制可能是降低ROS含量。HIF-1α和VEGF為兩個免疫抑制因子，可發(fā)揮免疫抑制作用[16]。本研究結(jié)果顯示，LSS可降低由LPS引起的HIF-1α和VEGF表達水平的升高，這提示LSS對PC12免疫的影響可能與降低HIF-1α和VEGF表達有關(guān)。PI3K/AKT信號通路對細胞增殖、遷移、物質(zhì)代謝等多種生物學功能具有調(diào)控作用，也是神經(jīng)元存活的一個主要途徑[17]。其激活對于神經(jīng)元保護發(fā)揮重要作用。如在I/R損傷模型中，激活PI3K/AKT信號可明顯降低小腦損傷面積及神經(jīng)元凋亡指數(shù)[18]；激活PI3K/AKT可降低PC12損傷[19]。本研究檢測結(jié)果顯示，LSS可上調(diào)PI3K/AKT信號通路PI3K、p-AKT及下游細胞增殖相關(guān)蛋白cyclinD1表達，下調(diào)促凋亡蛋白Bax表達。這提示LSS對PC12細胞的損傷保護可能與PI3K/AKT信號通路的激活有關(guān)。綜上所述，LSS可提高PC12細胞存活率、降低細胞凋亡、提高免疫，其機制與激活PI3K/AKT信號通路、提高細胞ROS水平及抑制HIF-1α和VEGF的表達有關(guān)。該研究可能為LSS在NDD中的作用研究奠定了一定基礎(chǔ)，值得進一步深入探究。