李 飛 周 靜 孫紅梅 趙 莉 張 鵬 高 峰

(延安大學附屬醫(yī)院心內(nèi)科,延安716000)

缺氧缺血心臟疾病已經(jīng)成為威脅人類生命健康的主要因素之一，其主要是由動脈狹窄、動脈阻塞等引起的，其發(fā)病機制與心肌細胞氧化損傷有關(guān)。在缺氧缺血心臟疾病發(fā)生時，心肌細胞產(chǎn)生大量的氧自由基，同時細胞中抗氧化酶活性降低，導致細胞膜上的脂質(zhì)發(fā)生過氧化，引起細胞膜通透性的改變，引起細胞功能和結(jié)構(gòu)的破壞，誘導細胞凋亡的發(fā)生[1-3]。Toll樣受體4(Toll-like receptor-4，TLR4)作為一種模式識別受體，其與配體結(jié)合以后可以激活下游信號通路，調(diào)控細胞的多種生物學特性，其在淋巴細胞、上皮細胞等幾乎所有細胞中都有表達，參與過敏性疾病、心血管系統(tǒng)等疾病的發(fā)生[4]。有研究表明，TLR4參與缺氧缺血心臟疾病的發(fā)生，在缺氧缺血心肌組織中表達異常升高[5,6]。本實驗用心肌H9C2細胞作為體外研究對象，通過用H2O2處理構(gòu)建心肌H9C2細胞氧化損傷模型，通過慢病毒感染沉默心肌H9C2細胞中TLR4的表達，探討TLR4對氧化應激條件下的心肌H9C2細胞凋亡、氧化損傷及炎癥因子釋放水平的影響，以期為明確TLR4在缺氧缺血心臟疾病中的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 綠色熒光蛋白和嘌呤霉素標記的siRNA 陰性對照慢病毒、TLR4 siRNA慢病毒由上海吉凱合成，TLR4 siRNA 序列為：CCCTCCATAGACTTCAATTAT；丙二醛(Malonaldehyde，MDA)含量測定試劑盒、IL-6含量測定試劑盒、超氧化物歧化酶 (Superoxide orgotein dismutase，SOD)活性檢測試劑盒為碧云天產(chǎn)品；腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)含量測定試劑盒、乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)含量測定試劑盒，活性氧(Reactive oxygen species,ROS)含量測定試劑盒為南京建成生物研究所產(chǎn)品；剪切型Caspase-3(Cleaved Caspase-3)抗體、TLR4抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein，Bax)抗體購自美國Abcam。

1.2方法

1.2.1細胞分組處理 心肌H9C2細胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含有100 U/ml的青霉素及100 μg/ml的鏈霉素，細胞放在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。心肌H9C2細胞用含有200 μmol/L 的H2O2溶液培養(yǎng)12 h作為H2O2組，同時將TLR4 siRNA慢病毒感染后的心肌H9C2細胞以200 μmol/L的H2O2溶液培養(yǎng)12 h作為si-TLR4組，把siRNA 陰性對照慢病毒感染后的心肌H9C2細胞以200 μmol/L的H2O2溶液培養(yǎng)12 h作為si-NC組，把未經(jīng)處理的正常培養(yǎng)的心肌H9C2細胞作為Control組。慢病毒感染方法如下：心肌H9C2細胞接種到6孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，每個孔中加入105個細胞，細胞融合度為60%時，分別用siRNA 陰性對照慢病毒、TLR4 siRNA慢病毒以MOI=60感染細胞，24 h以后，換液，用嘌呤霉素篩選沉默TLR4的細胞株，繼續(xù)培養(yǎng)3 d。熒光顯微鏡下觀察細胞感染效率超過85%。

1.2.2qRT-PCR檢測TLR4在H2O2處理以后的心肌H9C2細胞中的表達 取H2O2組、Control組心肌H9C2細胞，按照上述方法處理以后，用PBS將各組細胞洗滌2次。加入Trizol提取細胞中的總RNA。用DEPC水將RNA溶解以后，進行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄條件為：37℃，15 min；85℃，5 s；4℃ 10 min。取各組cDNA，進行qRT-PCR，PCR程序為：95℃，15 s；60℃，60 s；共40個循環(huán)，以β-actin作為內(nèi)參。引物序列如下：TLR4上游5′-ACCTGTCCCTGAACCC-TATGAA-3′，下游5′-CTTCTAAACCAGCCAGACC-TTG-3′。β-actin上游5′-ACCACAGTCCATGCCAT-CAC-3′，下游5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.2.3Western blot檢測TLR4在H2O2處理以后的心肌H9C2細胞中的表達 取H2O2組、Control組心肌H9C2細胞，提取細胞中的總蛋白，保存在-80℃。蛋白樣品用BCA法測定濃度。蛋白電泳：10%分離膠、5%積層膠，蛋白樣品同等體積的2×Loading Buffer混勻，放置在100℃反應5 min，每個泳道中添加40 μg蛋白樣品，電壓為90 V，電泳約2.5～3 h，直到溴酚藍到達底部邊緣1 cm后，停止電泳。將蛋白凝膠取出以后，調(diào)整200 mA電流進行轉(zhuǎn)膜，時間約為80 min。取出NC膜，用5%牛血清白蛋白置于室溫條件下孵育1.5 h。再將膜置于含有1∶800 稀釋的TLR4一抗、1∶1 000稀釋的β-actin一抗中，置于4℃搖晃過夜。NC膜再與1∶3 000稀釋的二抗在室溫搖晃孵育2 h以后，ECL發(fā)光。以Quantity One軟件分析各個條帶灰度值，用目的條帶灰度值與β-actin灰度值的比值記為目的蛋白表達水平。

1.2.4qRT-PCR和Western blot檢測慢病毒感染后心肌H9C2細胞中TLR4表達 取H2O2組、si-NC組、si-TLR4組細胞，依照上述方法處理以后，用qRT-PCR和Western blot檢測細胞中TLR4表達水平，檢測慢病毒對H2O2處理以后心肌H9C2細胞中TLR4沉默效果。步驟同1.2.2和1.2.3。

1.2.5流式細胞術(shù)檢測心肌H9C2細胞凋亡 Control組、H2O2組、si-NC組、si-TLR4組細胞按照上述方法處理以后，收集細胞，用4℃預冷的PBS將細胞洗滌2次以后，在細胞沉淀中加入400 μl的結(jié)合緩沖液重懸細胞，再加入5 μl碘化丙啶(Propidium iodide，PI)、5 μl膜聯(lián)蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)，將細胞置于避光中反應20 min，再添加100 μl緩沖液，立即用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.6Western blot檢測細胞中Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平 Control組、H2O2組、si-NC組、si-TLR4組細胞按照上述方法處理以后，用Western blot檢測細胞中Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平，步驟同1.2.3。

1.2.7MDA、SOD、LDH、ROS水平檢測 Control組、H2O2組、si-NC組、si-TLR4組細胞按照上述方法處理以后，收集培養(yǎng)液上清及細胞，用硫代巴比妥酸法檢測細胞中MDA水平，黃嘌呤氧化法檢測細胞中SOD活性，二硝基苯肼顯色法檢測上清中LDH含量，二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)法檢測ROS水平，步驟同試劑盒說明書。

1.2.8細胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6水平檢測 Control組、H2O2組、si-NC組、si-TLR4組細胞按照上述方法處理以后，收集培養(yǎng)液上清，用ELISA法檢測培養(yǎng)液上清中TNF-α、IL-6水平，步驟同試劑盒說明書。

2 結(jié)果

2.1H2O2誘導心肌H9C2細胞中TLR4表達 Control組、H2O2組細胞中TLR4 mRNA水平依次為：1.00、2.64±0.28，TLR4蛋白水平依次為：0.25±0.03、0.63±0.05。H2O2處理以后的心肌H9C2細胞中TLR4 mRNA和蛋白水平均明顯升高，H2O2誘導心肌H9C2細胞中TLR4的表達和轉(zhuǎn)錄。見表1和圖1。

2.2TLR4 siRNA慢病毒感染降低H2O2處理后的心肌H9C2細胞中TLR4的表達 H2O2組、si-NC組、si-TLR4組細胞中TLR4 mRNA水平依次為：1.00、1.00±0.12、0.10±0.06，TLR4蛋白水平依次為：0.71±0.08、0.72±0.06、0.15±0.03。心肌H9C2細胞感染TLR4 siRNA慢病毒以后，經(jīng)H2O2誘導，細胞中TLR4 mRNA和蛋白水平均明顯降低，說明TLR4 siRNA慢病毒感染成功下調(diào)了心肌H9C2細胞中TLR4的表達水平。見表2和圖2。

2.3沉默TLR4減少H2O2誘導的心肌H9C2細胞凋亡 Control組、H2O2組、si-NC組、si-TLR4組細胞凋亡率依次為：(4.13±0.52)%、 (28.32±2.31)%、(27.96±3.45)%、(20.14±1.58)%，Cleaved Casp-ase-3蛋白水平依次為：0.15±0.02、0.36±0.03、0.35±0.06、0.23±0.04，Bax蛋白水平依次為：0.25±0.03、0.47±0.05、0.49±0.06、0.38±0.04。H2O2處理以后的心肌H9C2細胞中Bax蛋白、Cleaved Caspase-3蛋白和細胞凋亡率明顯升高，H2O2誘導心肌H9C2細胞凋亡。沉默TLR4可以減少H2O2條件下心肌H9C2細胞中Bax蛋白、Cleaved Caspase-3蛋白表達，降低細胞凋亡率，提示沉默TLR4可以減少H2O2誘導的心肌H9C2細胞凋亡。見表3和圖3。

表1 H2O2處理后的心肌H9C2細胞中TLR4表達變化

Note：Compared with Control，1)P<0.05.

圖1 Western blot測定H2O2處理后的心肌H9C2細胞中TLR4的表達Fig.1 Western blot determination of TLR4 expression in cardiac myocytes after H2O2 treatment

表2 各組心肌H9C2細胞中TLR4表達變化

Note：Compared with H2O2，1)P<0.05.

2.4沉默TLR4抑制H2O2誘導的心肌H9C2細胞氧化損傷 Control組、H2O2組、si-NC組、si-TLR4組細胞MDA水平依次為：(10.59±1.36)、(17.82±1.23)、(17.22±1.63)、(13.54±1.05)μmol/mg，SOD水平依次為：(41.36±3.28)、(26.58±2.69)、(26.74±3.26)、(34.16±2.17)U/ml，LDH水平依次為：(85.46±8.73)、(145.37±12.98)、(145.72±10.87)、(120.86±11.64)U/L。H2O2處理以后的心肌H9C2細胞中MDA水平升高，同時細胞中SOD活性下降，細胞培養(yǎng)液中的LDH水平明顯升高，提示H2O2可以誘導心肌H9C2細胞脂質(zhì)過氧化，造成細胞氧化損傷。沉默TLR4后的心肌H9C2細胞經(jīng)H2O2誘導處理以后，細胞中MDA水平降低，SOD活性升高，細胞培養(yǎng)液中LDH水平降低，提示沉默TLR4可以減輕H2O2誘導的心肌H9C2細胞氧化損傷。見表4。

圖2 Western blot檢測TLR4 siRNA對心肌H9C2細胞中TLR4蛋白表達影響Fig.2 Western blot to detect effect of TLR4 siRNA on expression of TLR4 protein in cardiac myocytes

表3 各組心肌H9C2細胞凋亡率和Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平變化

Note：Compared with Control,1)P<0.05;compared with H2O2，2)P<0.05.

2.5沉默TLR4減少H2O2誘導的心肌H9C2細胞中ROS積累 Control組、H2O2組、si-NC組、si-TLR4組ROS水平依次為：9.65±0.82、32.74±2.98、32.11±2.56、18.52±1.71。H2O2處理以后的心肌H9C2細胞ROS水平升高，提示H2O2可以誘導心肌H9C2細胞中ROS的積累。沉默TLR4后的心肌H9C2細胞經(jīng)H2O2誘導處理以后，細胞中ROS水平降低，提示沉默TLR4可以減少H2O2誘導的心肌H9C2細胞中ROS的積累。見表5。

2.6沉默TLR4減少H2O2誘導心肌H9C2細胞分泌TNF-α、IL-6 Control組、H2O2組、si-NC組、si-TLR4組TNF-α水平依次為：(1.45±0.12)、(2.96±0.31)、(2.94±0.25)、(2.15±0.15)μg/L，IL-6水平依次為：(54.26±4.17)、(142.01±12.36)、(140.58±13.86)、(99.75±10.25)pg/ml。H2O2處理以后的心肌H9C2細胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6水平升高，提示H2O2可以誘導心肌H9C2細胞分泌炎癥因子。沉默TLR4后的心肌H9C2細胞經(jīng)H2O2誘導處理以后，細胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6水平降低，提示沉默TLR4可以減少H2O2誘導的心肌H9C2細胞分泌炎癥因子。見表6。

圖3 沉默TLR4減少 H2O2誘導的心肌H9C2細胞凋亡Fig.3 Silencing TLR4 reduces H2O2 induced cardiomyo-cyte apoptosisNote: A.Flow cytometry was used to detect the apoptosis of cardiac myocytes；B.Detection of apoptosis related protein Bax and Cleaved Caspase-3 protein in cardiac myocytes by Western blot.

表4 各組心肌H9C2細胞中MDA、SOD及培養(yǎng)液中LDH水平變化

Note：Compared with Control，1)P<0.05;compared with H2O2，2)P<0.05.

表5 各組心肌H9C2細胞中ROS水平變化

Note：Compared with Control，1)P<0.05;compared with H2O2，2)P<0.05.

表6 各組心肌H9C2細胞分泌TNF-α、IL-6變化

Note：Compared with Control，1)P<0.05;compared with H2O2，2)P<0.05.

3 討論

TLR4是被第一個發(fā)現(xiàn)的TLR相關(guān)蛋白，參與機體的固有免疫應答，其在病原體識別、細胞程序性死亡分子結(jié)構(gòu)識別等過程中具有重要作用，TLR4的分布極為廣泛，在巨噬細胞、內(nèi)皮細胞等中均有表達，參與腫瘤、缺血再灌注、免疫相關(guān)疾病等的發(fā)生[7-10]。很多研究表明，TLR4在缺血再灌注心肌組織中高表達，參與缺血再灌注早期和晚期炎癥損傷和心肌細胞功能損傷，其可以促進心肌細胞炎癥反應，阻礙心肌組織正常功能的發(fā)揮[11,12]?；蚯贸齌LR4后的小鼠心肌梗死的面積明顯減小，TLR4基因敲除的小鼠較野生型的小鼠心功能改善程度較好，這些研究結(jié)果均提示，TLR4參與缺血缺氧心臟損傷[13,14]。

缺血缺氧心臟損傷的發(fā)病機制與氧化應激有關(guān)，缺血缺氧可以誘導心肌組織中產(chǎn)生大量的氧自由基，這些氧自由基過度積累導致細胞中脂質(zhì)發(fā)生過氧化，引起細胞膜的通透性發(fā)生改變，使得原本存在于細胞內(nèi)的LDH外漏至細胞外[15]。脂質(zhì)發(fā)生過氧化的產(chǎn)物之一是MDA，檢測MDA水平可以間接反映細胞中脂質(zhì)發(fā)生過氧化的程度[16]。SOD是細胞中的氧自由基清除劑，其可以清除細胞中過量的氧自由基，維持細胞氧化平衡[17]。本次研究表明，H2O2誘導心肌H9C2細胞中MDA水平和細胞培養(yǎng)液中LDH水平升高，降低細胞中SOD活性，促進細胞中ROS合成，而沉默TLR4可以逆轉(zhuǎn)H2O2對心肌H9C2細胞的上述作用，TLR4沉默可以減輕心肌H9C2細胞氧化損傷，提高抗氧化酶活性，TLR4可能參與心肌H9C2細胞氧化損傷過程。

心肌細胞過度凋亡與缺血缺氧心臟疾病發(fā)生有關(guān)，缺氧缺血誘導心肌細胞凋亡。研究表明，細胞內(nèi)過量的ROS可以激活細胞內(nèi)凋亡信號的傳導，誘導細胞中Caspase-3的活化，促進心肌細胞中Bax的表達，促進細胞凋亡的發(fā)生[18,19]。缺氧缺血心臟疾病還與炎癥反應有關(guān)，細胞受到氧化損傷又可以誘導細胞釋放炎癥因子，TNF-α、IL-6是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，參與細胞炎癥反應，在缺氧缺血心臟損傷中含量增加[20-22]。TLR4參與細胞凋亡、炎癥反應等過程，在腎小管上皮細胞、巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞中均已證實[23-25]。本實驗的結(jié)果顯示，沉默TLR4可以減少H2O2誘導的心肌H9C2細胞凋亡，降低細胞中Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平和細胞分泌炎癥因子，沉默TLR4可能通過抑制細胞凋亡和炎癥減輕心肌H9C2細胞氧化損傷。

TLR4參與氧化應激條件下的心肌H9C2細胞功能發(fā)揮，沉默TLR4可以減輕心肌H9C2細胞氧化損傷，減少細胞炎癥反應和細胞凋亡，本實驗明確了TLR4在氧化應激條件下心肌H9C2細胞凋亡、炎癥反應、氧化損傷中的作用，為以后研究缺氧缺血心肌損傷提供了堅實基礎(chǔ)，其調(diào)控細胞凋亡、炎癥等的具體作用機制還需要在以后的實驗中繼續(xù)探索。