丁艷娟，劉永康，羅雨嘉，鄧穎梅，徐紅星，唐斌，徐彩娣,3

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褐飛虱GSK-3調(diào)控糖原與海藻糖代謝的潛在功能

丁艷娟1，劉永康1，羅雨嘉1，鄧穎梅1，徐紅星2，唐斌1，徐彩娣1,3

（1杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，杭州 310036；2浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所，杭州 310021；3杭州師范大學(xué)教育學(xué)院，杭州 310036）

【目的】昆蟲(chóng)胰島素信號(hào)途徑能夠介導(dǎo)糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase 3，簡(jiǎn)稱(chēng)GSK-3或GSK3）調(diào)控體內(nèi)糖原及海藻糖等糖代謝過(guò)程，從而控制昆蟲(chóng)的各項(xiàng)生命活動(dòng)。論文旨在探究糖原合成酶激酶在褐飛虱（）體內(nèi)對(duì)糖原與海藻糖代謝的調(diào)控作用。【方法】首先，基于GSK-3的cDNA編碼序列，利用ExPASy工具翻譯GSK-3氨基酸序列，預(yù)測(cè)蛋白分子量大小及等電點(diǎn)（pI）；然后利用SignaIP4.1Server對(duì)其信號(hào)肽進(jìn)行分析。其次，以筆者實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的褐飛虱為研究對(duì)象，從4齡開(kāi)始，每12 h取材，取至成蟲(chóng)48 h。利用Trizol法提取褐飛虱總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈DNA，以18S作為內(nèi)參基因，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)褐飛虱在不同齡期mRNA水平上的相對(duì)表達(dá)量。然后利用RNAi技術(shù)，向褐飛虱體內(nèi)顯微注射雙鏈RNA(dsRNA)抑制，以注射ds的褐飛虱作為對(duì)照組。注射后48 h利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)的表達(dá)情況，確定抑制效果。另外，取注射后48 h蟲(chóng)體，分別測(cè)定褐飛虱體內(nèi)海藻糖、葡萄糖、糖原含量及海藻糖酶（trehalase，TRE）活性變化。最后采用qRT-PCR檢測(cè)胰島素信號(hào)通路胰島素受體基因(insulin receptor，)、類(lèi)胰島素多肽基因(insulin-like peptides，)及海藻糖代謝途徑、海藻糖合成酶基因(trehalose-6-phophate synthase，)、糖原磷酸化酶基因(glycogen phosphorylase，)、糖原合成酶基因(glycogen synthase，)中相關(guān)基因的表達(dá)，分析在胰島素信號(hào)通路及海藻糖代謝途徑中的調(diào)控作用。【結(jié)果】褐飛虱開(kāi)放閱讀框?yàn)? 914 bp，編碼637個(gè)氨基酸；預(yù)測(cè)蛋白分子量為69.25 kD，等電點(diǎn)為9.15，為偏堿性蛋白，無(wú)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，序列高度保守。發(fā)育表達(dá)模式結(jié)果顯示在不同發(fā)育階段表達(dá)不一致，5齡若蟲(chóng)蛻皮前后低表達(dá)。的dsRNA注射后48 h，與對(duì)照組ds相比，表達(dá)極顯著下降，表明RNA干擾效果明顯。糖原含量和兩類(lèi)海藻糖酶活性顯著下降，而海藻糖含量顯著上升，推測(cè)糖原和葡萄糖轉(zhuǎn)化為海藻糖，作為其生理活動(dòng)的能量來(lái)源。qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)表達(dá)抑制后48 h，的表達(dá)量顯著下降，而和的表達(dá)量極顯著下降。另外，2個(gè)基因、以及的表達(dá)量均極顯著下降；胰島素信號(hào)通路的2個(gè)基因和4個(gè)基因的表達(dá)同樣被抑制，間接表明能夠調(diào)控的表達(dá)?！窘Y(jié)論】褐飛虱低表達(dá)后能夠通過(guò)調(diào)控胰島素信號(hào)通路及海藻糖代謝途徑相關(guān)基因表達(dá)來(lái)調(diào)控糖原及海藻糖代謝。相關(guān)研究結(jié)果有助于更加全面地探索褐飛虱等昆蟲(chóng)糖原合成酶激酶調(diào)控海藻糖及糖類(lèi)物質(zhì)平衡的潛在分子機(jī)理。

褐飛虱；RNA干擾；糖原合成酶激酶3；糖原與海藻糖代謝；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）

0 引言

【研究意義】我國(guó)是水稻（）種植大國(guó)，自1991年起，稻谷播種面積穩(wěn)定在3 000萬(wàn)公頃左右，產(chǎn)量近年來(lái)基本維持在2.1億噸。作為重要的糧食作物，水稻產(chǎn)量的穩(wěn)定對(duì)我國(guó)民生具有非常重要的意義。但水稻在其生產(chǎn)以及儲(chǔ)存過(guò)程經(jīng)常遭到各種害蟲(chóng)的威脅。據(jù)報(bào)道，目前水稻害蟲(chóng)總數(shù)已經(jīng)超過(guò)800種[1]。其中，褐飛虱（）是危害最為嚴(yán)重的一種水稻害蟲(chóng)。褐飛虱是單食性害蟲(chóng)，具有繁殖速度快、內(nèi)稟增長(zhǎng)率較高、生命周期很短、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)[2-5]。另外，褐飛虱具有遷飛性，每年都會(huì)從東南亞遷飛到我國(guó)危害水稻生產(chǎn)，造成較廣的危害范圍，防治難度大[6]。因此，亟需尋找一種環(huán)保、高效的褐飛虱防治方法?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】海藻糖（trehalose）是一種普遍存在于低等植物、藻類(lèi)、細(xì)菌、真菌、酵母、昆蟲(chóng)及其他無(wú)脊椎動(dòng)物中的非還原性雙糖[7-8]，也是昆蟲(chóng)血淋巴中的重要能量物質(zhì)，為昆蟲(chóng)進(jìn)行一系列生命活動(dòng)提供能源，并調(diào)控昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)、發(fā)育、蛻皮變態(tài)等過(guò)程，因此被稱(chēng)為昆蟲(chóng)的“血糖”[9]。昆蟲(chóng)體內(nèi)的糖原以及海藻糖代謝直接影響到昆蟲(chóng)的一系列生命活動(dòng)，在這個(gè)過(guò)程中，糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase 3，簡(jiǎn)稱(chēng)GSK-3或GSK3）起到了至關(guān)重要的調(diào)控作用[10-11]。相關(guān)研究表明，在動(dòng)物體內(nèi)，糖原合成酶的主要功能便是在糖原合成的最后一步中催化尿苷二磷酸葡萄糖上的葡萄糖基C1在糖原的非還原性末端C4形成-1,4-糖苷鏈，使原來(lái)的糖原分子增加一個(gè)葡萄糖單位。GSK-3可以通過(guò)使糖原合成酶磷酸化從而使糖原合成酶失活，抑制糖原合成最后一步的進(jìn)行，并且還可以阻礙胰島素信號(hào)通路的傳導(dǎo)從而抑制糖原合成[12-15]。而糖原和海藻糖之間的轉(zhuǎn)化密不可分，因此的表達(dá)對(duì)糖原和海藻糖的合成代謝具有重要的影響。GSK-3通過(guò)使糖原合成酶磷酸化以及影響胰島素信號(hào)通路從而抑制糖原的合成，而糖原與其他的糖類(lèi)物質(zhì)之間存在緊密的聯(lián)系，它們可以通過(guò)酶的催化作用從而互轉(zhuǎn)化。當(dāng)昆蟲(chóng)體內(nèi)表達(dá)失常，其體內(nèi)糖代謝過(guò)程便會(huì)失衡，從而昆蟲(chóng)的發(fā)育、蛻皮等一系列生命活動(dòng)都會(huì)出現(xiàn)異常[10,16-20]。目前對(duì)GSK-3的調(diào)控作用也有一定的研究進(jìn)展，比如Akt1可以通過(guò)調(diào)節(jié)GSK-3活性來(lái)保證黑腹果蠅（）的雌性生殖系干細(xì)胞（germline stem cell）的維持[21]。【本研究切入點(diǎn)】前期研究表明GSK3在各種信號(hào)傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮著重要的作用，例如對(duì)果蠅的WNK神經(jīng)起正調(diào)節(jié)作用[22]。但關(guān)于GSK-3與褐飛虱糖類(lèi)物質(zhì)代謝關(guān)系的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，GSK-3在褐飛虱胰島素信號(hào)通路中的作用也有待研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以重要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)褐飛虱的為對(duì)象，研究其分子特性、時(shí)期表達(dá)特征，并探究褐飛虱體內(nèi)GSK-3調(diào)控昆蟲(chóng)主要糖類(lèi)物質(zhì)代謝的功能，為將來(lái)通過(guò)調(diào)控昆蟲(chóng)“血糖”平衡或能量供應(yīng)來(lái)控制害蟲(chóng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017—2018年在杭州師范大學(xué)完成。

1.1 供試?yán)ハx(chóng)及材料

褐飛虱采自中國(guó)水稻研究所，在本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。水稻品種全部采用感蟲(chóng)水稻TN1（Taichung Native 1）。水稻種植步驟：首先將水稻種子浸入約70℃的溫水中浸泡10 min左右，打破休眠；再將種子浸泡到自來(lái)水中放至于30℃人工氣候培養(yǎng)箱泡種24 h；隨后倒去泡種的水，自來(lái)水沖洗數(shù)次后用濕紗布包裹種子，置于30℃人工氣候培養(yǎng)箱催芽24—48 h，種子發(fā)芽后播種于塑料盆；適當(dāng)施肥促進(jìn)小苗生長(zhǎng)，待長(zhǎng)至10 cm左右后，轉(zhuǎn)移至大田插秧；待水稻生長(zhǎng)至分蘗中期后將其移至養(yǎng)蟲(chóng)籠，每隔2—3 d更換一次水稻。褐飛虱飼養(yǎng)條件：溫度（26±1）℃，光周期16 h/8 h，相對(duì)濕度為70%。從4齡若蟲(chóng)至發(fā)育為成蟲(chóng)后3 d的褐飛虱蟲(chóng)體，每12 h取材，用于發(fā)育表達(dá)模式研究。用于后期注射試驗(yàn)的材料均取5齡若蟲(chóng)后的褐飛虱。

1.2 主要試劑

Trizol試劑盒（購(gòu)自L(fǎng)ifetech Scientific Corporation）；pMD18-T、AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、6×Loading buffer、DNA Marker DL2000及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑（購(gòu)自大連TaKaRa公司）；PCR引物(上海英濰捷基有限公司合成)；T7 RiboMax Express RNAiSystem（Promega，Madison，USA）；氯仿、異丙醇、EDTA等常規(guī)試劑（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR96孔透明板和光學(xué)粘性封膜等耗材（Bio-RAD，USA）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1cDNA序列分析 根據(jù)褐飛虱轉(zhuǎn)錄組中獲得的cDNA編碼序列，克隆測(cè)序后，利用NCBI中的ORF Finder（Open Reading Frame Finder）（http://cms.ncbi.nlm.nih.gov/orf finder/）工具找到GSK-3的全長(zhǎng)ORF序列，并用ExPASy網(wǎng)站translate tool翻譯成氨基酸序列（https://web.expasy.org/ translate/），預(yù)測(cè)蛋白分子量大小及等電點(diǎn)（pI）；利用SignaIP4.1Server對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行信號(hào)肽分析（http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/）。

1.3.2 總RNA抽提及cDNA合成 利用Trizol試劑盒并按照說(shuō)明書(shū)提取褐飛虱蟲(chóng)體的總RNA。提取后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的質(zhì)量，然后利用NanoDrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度及純度。使用Prime Script?RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒配置體系并合成cDNA第一鏈。

1.3.3 dsRNA的合成 根據(jù)dsRNA特異性片段設(shè)計(jì)并合成特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物再進(jìn)行T克隆，隨后用帶T7啟動(dòng)子的引物進(jìn)行交叉PCR反應(yīng)，相關(guān)引物序列見(jiàn)表1。根據(jù)T7 RiboMAXTMExpress RNAi System試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行ds的合成，隨后采用NanoDropTM2000分光光度計(jì)測(cè)定ds的濃度，采用同樣的方法合成的dsRNA作為對(duì)照組[11]。

1.3.4 褐飛虱的顯微注射 用于顯微注射的材料分為ds以及作為對(duì)照的ds。在注射前向標(biāo)準(zhǔn)毛細(xì)管注射dsRNA確定顯微注射器每次泵出dsRNA的體積，然后通過(guò)調(diào)整氮?dú)鈮簛?lái)調(diào)整泵出dsRNA的體積，使其泵出體積符合注射所需量。將用CO2麻醉后的5齡褐飛虱蟲(chóng)體腹部朝上放置于有瓊脂膠板的一次性培養(yǎng)皿中，注射部位為第一對(duì)足中間偏下較軟部位。取5齡第1天的褐飛虱用于顯微注射，注射量均為200 ng/頭，每個(gè)處理組注射100頭褐飛虱。注射后48 h取材，用于海藻糖、葡萄糖、糖原含量和海藻糖酶活性測(cè)定，以及相關(guān)基因表達(dá)量測(cè)定。

1.3.5發(fā)育表達(dá)模式及RNAi后海藻糖通路、胰島素信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)量測(cè)定 從4齡若蟲(chóng)至發(fā)育為成蟲(chóng)后3 d的褐飛虱蟲(chóng)體，每12 h取材，用于發(fā)育表達(dá)模式研究；取注射后48 h褐飛虱用于檢測(cè)海藻糖通路及胰島素信號(hào)通路關(guān)鍵基因表達(dá)量。采取平行取樣，即每個(gè)處理組取3管，每管5頭褐飛虱，最后每個(gè)樣品得到3管平行cDNA，放置于-80℃冰箱保存。試驗(yàn)時(shí)，再進(jìn)行重復(fù)點(diǎn)樣，即每管cDNA做3個(gè)定量，3管平行cDNA 共得到9個(gè)數(shù)據(jù)，每個(gè)樣品為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，保證數(shù)據(jù)的可靠性。qRT-PCR反應(yīng)體系（20 μl）：10 μL SYBR Premix Ex Taq；1 μl上游/下游引物；1 μl cDNA；7 μl滅菌超純水。定量引物見(jiàn)表1。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10 s，95℃解鏈5 s，59℃退火并延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.3.6 海藻糖、葡萄糖、總糖原含量以及海藻糖酶活性測(cè)定 取每個(gè)處理及對(duì)照組材料，加入100 μl PBS，研磨，再加100 μl PBS，超聲破碎至無(wú)塊狀組織，破碎后加入800 μl PBS，4℃，1 000×離心20 min。取350 μl上清，4℃，20 800×超離心60 min。超離心后的上清用于葡萄糖、可溶性海藻糖酶（TRE1）和蛋白質(zhì)（Pr1）的測(cè)定，沉淀用PBS懸浮后用于葡萄糖、膜結(jié)合海藻糖酶（TRE2）和蛋白質(zhì)（Pr2）的測(cè)定，具體步驟按照試劑盒說(shuō)明操作。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析 取3個(gè)重復(fù)孔的平均CT值用于計(jì)算，即最后得到的數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。再帶入2-ΔΔCT公式計(jì)算，對(duì)照組為褐飛虱注射ds組的CT值。2-ΔΔCT計(jì)算公式：

2-ΔΔCT= 2-[(CT實(shí)驗(yàn)組-CT實(shí)驗(yàn)18S)- (CT對(duì)照組-CT對(duì)照18S)]

應(yīng)用Excel軟件繪制圖表，并使用STATISTICA 8.0和SigmaPlot 10.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用One-Way ANOVA法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（＜0.05為差異顯著，用*表示；＜0.01為差異極顯著，用**表示）。

2 結(jié)果

2.1 GSK-3的序列結(jié)構(gòu)特征

根據(jù)褐飛虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及克隆驗(yàn)證后，發(fā)現(xiàn)褐飛虱cDNA開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)1 914 bp，編碼637個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量為69.25 kD，等電點(diǎn)為9.15，為偏堿性蛋白，無(wú)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)（圖1）。GSK-3蛋白含有20種氨基酸，其中絲氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、亮氨酸（Leu）和天冬酰胺（Asn）等含量較豐富，所占比例分別為11.1%、8.0%、7.7%和7.5%。酸性氨基酸（帶負(fù)電荷）為46個(gè)，堿性氨基酸（帶正電荷）為78個(gè)。

圖1 褐飛虱GSK-3的核苷酸和氨基酸序列

2.2 褐飛虱GSK-3發(fā)育表達(dá)模式

褐飛虱在不同發(fā)育階段的表達(dá)量不同，在4齡初期和末期、5齡48 h和成蟲(chóng)36 h表達(dá)量相對(duì)較高；在4齡24 h、5齡的初期及末期表達(dá)量相對(duì)較低（圖2）。

2.3 RNAi后GSK-3的表達(dá)

體外合成的dsRNA注射到褐飛虱體內(nèi)后，與注射ds組相比較注射后48 h其mRNA表達(dá)水平極顯著下降（圖3），該結(jié)果表明RNAi有效抑制了的表達(dá)。

GSK-3在褐飛虱4齡（第1—4天）、 5齡（第1—7天）和成蟲(chóng)早期（第1—4天）不同發(fā)育天數(shù)的表達(dá)The relative expression of GSK-3 in different days of 4th instar nymphs (day 1 to day 4), 5th instar nymphs (day 1 to day 7), and early stages of adult (day 1 to day 4)

圖3 RNAi后GSK-3的表達(dá)情況

2.4 GSK-3 RNAi后對(duì)糖原及葡萄糖含量的影響

與注射ds組相比較，的dsRNA 注射后48 h時(shí)糖原含量極顯著下降（＜0.01，圖4-A），葡萄糖含量下降，但無(wú)顯著差異（＞0.05，圖4-B）。

2.5 GSK-3 RNAi后對(duì)褐飛虱海藻糖代謝的影響

RNAi抑制表達(dá)后48 h，海藻糖含量及海藻糖酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，與注射ds的對(duì)照組相比，抑制后48 h褐飛虱海藻糖含量顯著上升（＜0.05，圖5-A），可溶性和膜結(jié)合型兩類(lèi)海藻糖酶活性均顯著下降（＜0.05，圖5-B、5-C）。

圖4 GSK-3 RNAi后對(duì)糖原及葡萄糖含量的影響

圖5 GSK-3 RNAi后對(duì)褐飛虱海藻糖代謝的影響

2.6 GSK-3 RNAi后褐飛虱海藻糖代謝通路及胰島素信號(hào)通路中相關(guān)基因的表達(dá)變化

采用RNAi抑制褐飛虱的表達(dá)后，與注射ds相比較，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示褐飛虱胰島素信號(hào)通路及海藻糖代謝通路相關(guān)基因中的、、、、、表達(dá)量均顯著或極顯著下降（圖6）。

圖6 GSK-3 RNAi后褐飛虱海藻糖代謝通路及胰島素信號(hào)通路相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)水平

3 討論

昆蟲(chóng)中GSK-3主要作為糖原合成的一個(gè)重要限速酶，其序列相對(duì)比較保守[23]。本研究通過(guò)對(duì)GSK-3序列的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)GSK-3為偏堿性蛋白，無(wú)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，序列高度保守。前期研究發(fā)現(xiàn)褐飛虱海藻糖代謝途徑中的和表達(dá)被抑制后，糖原的合成也同時(shí)受到影響，多表現(xiàn)為糖原含量下降[24]，并且能夠直接影響昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)合成與蛻皮[25]。并且當(dāng)糖原合成酶（GS）和糖原磷酸化酶（GP）表達(dá)受到抑制后，能夠介導(dǎo)海藻糖代謝調(diào)控幾丁質(zhì)合成途徑（待發(fā)表）。相關(guān)研究結(jié)果顯示，家蠶幼蟲(chóng)在取食期GSK-3mRNA表達(dá)量相對(duì)較高，在蛻皮期表達(dá)量較低，在幼蟲(chóng)游走期表達(dá)量最低[23]。而且，褐飛虱蛻皮激素響應(yīng)相關(guān)基因與其齡期表達(dá)模式有密切關(guān)系，對(duì)其蛻皮過(guò)程至關(guān)重要[26]。本研究中，褐飛虱在5齡初期和末期表達(dá)量相對(duì)較低。

褐飛虱不僅是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，隨著其基因組測(cè)序的完成[27]，發(fā)現(xiàn)其非常適合作為基因功能研究的靶標(biāo)昆蟲(chóng)[4-5,15]。RNA干擾是基因功能研究的有效工具，主要是通過(guò)顯微注射dsRNA或siRNA抑制基因的表達(dá)[4]，該技術(shù)已經(jīng)廣泛用于探索和研究昆蟲(chóng)的相關(guān)基因功能，當(dāng)昆蟲(chóng)的關(guān)鍵發(fā)育基因被抑制后，其影響通常會(huì)表現(xiàn)在不同組織的表型上[5,28-31]。本試驗(yàn)中，褐飛虱dsRNA注射后48 h，該基因的表達(dá)與注射ds相比較，表達(dá)量極顯著下降，表明RNA干擾效果明顯。在前期研究中發(fā)現(xiàn)GSK-3參與胰島素、Wnt/-連環(huán)蛋白、Hedgehog以及Notch等信號(hào)傳導(dǎo)通路，在調(diào)控細(xì)胞的分化、代謝、凋亡以及基因表達(dá)等方面都起著重要作用[32]。GSK-3主要通過(guò)胰島素受體底物-1（IRS-1）的Ser332位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)對(duì)胰島素信號(hào)通路的阻礙，從而抑制糖原合成[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，被抑制后48 h糖原和葡萄糖含量極顯著降低或下降，表明GSK-3能夠調(diào)控糖原和葡萄糖的合成。GSK-3還能通過(guò)糖原合成酶磷酸化以及影響胰島素信號(hào)通路從而抑制糖原的合成，而糖原與其他的糖類(lèi)物質(zhì)之間存在緊密的聯(lián)系，它們可以通過(guò)酶的催化作用從而相互轉(zhuǎn)化[10]。這一點(diǎn)從本研究中也得到了驗(yàn)證，當(dāng)表達(dá)被抑制后，糖原和葡萄糖含量降低，轉(zhuǎn)化為海藻糖而導(dǎo)致含量顯著上升，作為其生理活動(dòng)的能量來(lái)源。上述研究結(jié)果表明，GSK-3在多種細(xì)胞信號(hào)通路中都起到關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用[28]。

GSK-3廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi)，主要在動(dòng)物腦組織中表達(dá)，負(fù)責(zé)信號(hào)的傳遞[11,34-36]。在家蠶幼蟲(chóng)中注射家蠶素II時(shí)，其體內(nèi)海藻糖濃度會(huì)降低，且海藻糖酶的活性得到提高；同時(shí)還能降低糖原含量和提高糖原酸化酶的活性[37]，但是當(dāng)家蠶成蟲(chóng)注射家蠶素時(shí)，其血淋巴中的海藻糖或脂質(zhì)水平卻沒(méi)有受到影響[38]。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)表達(dá)抑制后48 h，及的表達(dá)極顯著下降，同時(shí)，2種海藻糖酶活性也顯著下降，海藻糖含量上升，表現(xiàn)出一致性。另外，2個(gè)的表達(dá)也極顯著下降，同時(shí)被抑制后48 h能夠極顯著降低或降低糖原、葡萄糖含量，這與前期相關(guān)的研究結(jié)果一致[39]，說(shuō)明可以通過(guò)調(diào)控TRE活性變化和表達(dá)來(lái)影響3種糖類(lèi)物質(zhì)含量。相關(guān)研究報(bào)道胰島素進(jìn)入昆蟲(chóng)體內(nèi)后，先激活和，再激活磷脂酰肌醇激酶（PI3K），活化的PI3K催化磷脂酰肌醇的磷酸化，接著引起效應(yīng)器Akt的磷酸化，并喪失磷酸化糖原合成激酶（GSK-3）活性，抑制其對(duì)糖原合成酶（GS）的磷酸化作用，促使GS變?yōu)橛谢钚缘姆肿?，從而促進(jìn)糖原的合成[15]。從本試驗(yàn)來(lái)看，表達(dá)抑制后，降低了及的表達(dá)量，從而影響糖原及其他糖類(lèi)物質(zhì)的合成，即表達(dá)抑制后能夠下調(diào)胰島素通路中的相關(guān)基因，從而調(diào)控海藻糖等糖類(lèi)物質(zhì)代謝。而抑制后，葡萄糖含量變化不顯著，推測(cè)是因?yàn)楹诛w虱體內(nèi)還存在其他糖代謝途徑，例如胰島素信號(hào)通路的其他基因?qū)诛w虱糖代謝的調(diào)控等。對(duì)于胰島素途徑中的和，當(dāng)?shù)谋磉_(dá)被抑制后，2個(gè)和4個(gè)的表達(dá)同樣被抑制，間接表明能夠調(diào)控的表達(dá)，其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

RNA干擾后可以有效抑制褐飛虱體內(nèi)靶標(biāo)基因的表達(dá)；GSK-3能夠降低海藻糖和糖原代謝相關(guān)基因的表達(dá)及海藻糖酶活性，從而降低糖原和葡萄糖含量，提高海藻糖含量，并調(diào)控昆蟲(chóng)海藻糖平衡。

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Potential functions ofGSK-3 in Regulating glycogen and trehalose metabolism

DING YanJuan1, LIU YongKang1, LUO YuJia1, DENG YingMei1, XU HongXing2, TANG Bin1, XU CaiDi1,3

(1College of Life and Environmental Science, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036;2Institute of Plant Protection and Microbiology, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021;3College of Education, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036)

【Objective】The insect insulin signaling pathway can mediate glycogen synthase kinase 3 (GSK-3 or GSK3) to regulate glucose metabolism in the body, such as glycogen and trehalose, thereby controlling different life activities of insects. The objective of this study is to explore the regulation of glycogen synthase kinase on the metabolism of glycogen and trehalose in.【Method】 Firstly, based on the cDNA coding sequence of GSK-3, the GSK-3 amino acid sequence was translated using the ExPASy tool to predict the molecular weight and isoelectric point (pI) of the protein, and then the signal peptide was analyzed by SignalaIP4.1Server. Secondly, theraised in the author’s laboratory was collected every 12 hours from the 4th instar to 48-h-old adult. The total RNA ofwas extracted by Trizol method. The first strand DNA was synthesized according to the reverse transcription kit, and 18S was used as the internal reference gene. The relative expression ofdifferent ages at mRNA level was detected by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). Then, double-stranded RNA (dsRNA) was microinjected intowith RNAi technology to inhibit the, andof dswas injected as a control group. The expression ofwas detected by qRT-PCR 48 h after injection to determine the inhibitory effect. In addition, thewas taken 48 h after injection, and the change of trehalose, glucose, glycogen content and trehalase (TRE) activity inwas determined. Finally, the relative expression of related genes in insulin signaling pathway (including insulin receptor (), insulin-like peptides ()) and trehalose metabolism pathway (, trehalose-6-phophate synthase (), glycogen phosphorylase (), glycogen synthase ()) was detected by qRT-PCR to analyze the regulation of【Result】The open reading frame ofis 1 914 bp, encoding 637 amino acids; the predicted molecular weight of the protein is 69.25 kD, and the isoelectric point is 9.15. It is a basic protein with no signal peptide structure and the sequence is highly conserved. The results of developmental expression pattern showed that the expression ofwas inconsistent at different developmental stages, and the expression was low before and aftermolting of5th instar nymph.At 48 h after the dsRNA injection of, the expression ofdecreased significantly compared with the dsof the control group, indicating that the RNA interference effect was obvious. Glycogen content and two types of trehalase activity decreased significantly, while trehalose content increased significantly. It is speculated that glycogen and glucose are converted to trehalose as an energy source for their physiological activities.The results of qRT-PCR showed that the expression ofsignificantly decreased 48 h after the inhibition ofexpression, while the expression ofandextremely significant decreased. In addition, the expression of twogenes,andgenes all extremely significant decreased; the expression of twogenes and fourgenes in the insulin signaling pathway were also inhibited, indirectly indicating thatcan regulate the expression of. 【Conclusion】 The low expression ofcan regulate glycogen and trehalose metabolism by regulating insulin signaling pathway and trehalose metabolism pathway related gene expression. The relevant research results will help to explore more comprehensive molecular mechanisms for the regulation of the balance of trehalose and carbohydrates by insect glycogen synthase kinases such as.

; RNA interference (RNAi);glycogen synthase kinase 3; glycogen and trehalose metabolism; quantitative real-time PCR (qRT-PCR)

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.07.011

2018-11-15；

2018-12-29

國(guó)家自然科學(xué)基金（31672081，31371996）、國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201810346031）

丁艷娟，E-mail：dyj061004djy@163.com。通信作者徐彩娣，Tel：0571-28865680；E-mail：xucaidi001@163.com

（責(zé)任編輯 岳梅）