王 煒 ,陳 琛 ,葉春雷,楊隨莊,歐巧明,羅俊杰

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，甘肅蘭州 730070；2.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,四川綿陽 621010)

麥谷蛋白是小麥貯藏蛋白的主要成分之一，麥谷蛋白亞基的組成和含量對小麥品質(zhì)形成具有重要作用[1]。近年來，若干麥谷蛋白亞基基因功能分析、分子標(biāo)記的開發(fā)為進行小麥品質(zhì)改良提供了有力支撐[1-2]。隨著農(nóng)業(yè)供給側(cè)改革的展開，小麥的育種目標(biāo)逐步從高產(chǎn)、抗病轉(zhuǎn)向優(yōu)質(zhì)專用，以滿足人們多方面、多層次的需求。在小麥育種的早期世代，由于品質(zhì)性狀表型較難區(qū)分，對大量材料進行品質(zhì)檢測則成本高昂，利用與品質(zhì)相關(guān)的麥谷蛋白亞基分子標(biāo)記進行輔助選擇，在一定程度上可提高育種效率并節(jié)省成本。

花藥培養(yǎng)具有縮短育種時間并提高育種效率等優(yōu)點，是單倍體育種技術(shù)中應(yīng)用最成功和最廣泛的方法。然而由于基因型依賴性、誘導(dǎo)率和分化率低等諸多原因[3]，與傳統(tǒng)常規(guī)育種相比，應(yīng)用該技術(shù)育成的品種偏少。近年來的研究表明，包含花藥培養(yǎng)在內(nèi)的單倍體育種技術(shù)可與分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)等現(xiàn)代生物技術(shù)有機結(jié)合，使有益基因快速聚合[3-4]，進而進行種質(zhì)資源創(chuàng)制和新品種選育，該項技術(shù)重新得到相關(guān)研究者的重視[5]。本研究以矮敗小麥群體為平臺，通過對其與優(yōu)質(zhì)材料的雜交后代進行花藥培養(yǎng)，并結(jié)合麥谷蛋白分子標(biāo)記檢測，進行小麥新品種的選育，為提升小麥品質(zhì)育種技術(shù)水平提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

矮敗小麥材料由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供；用于矮敗小麥群體改良的種質(zhì)資源材料和尚頭、甘春20號、臨麥34號、隴春23號、隴春27號、隴春29號、銀春8號由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所提供，寧春4號、隴春31號、定豐16號和200706由本研究室提供。其中，和尚頭、甘春20號具有優(yōu)良的營養(yǎng)加工品質(zhì)；寧春4號、隴春27號、隴春31號和200706具有優(yōu)良的花培特性；寧春4號、定豐16號、隴春23號、隴春27號、隴春31號、定豐16號、臨麥34號和銀春8號的綜合性狀優(yōu)良，是近些年來甘肅中部地區(qū)重要的栽培品種。

1.2 方 法

1.2.1 矮敗小麥改良群體組建

依照王世紅等[6]的方法，將和尚頭、甘春20號、臨麥34號、隴春23號、隴春27號、隴春31號、定豐16號、寧春4號、銀春8號和200706的種子等量混合作為混合父本，與引進的矮敗小麥群體材料按行數(shù)比1∶2播種，行長3 m，行距0.2 m，共種植120行，面積為72 m2，成熟后收獲全部籽粒；次年按上述方法繼續(xù)播種，并淘汰不良可育株。連續(xù)進行3年(2013-2015)。

1.2.2 花藥培養(yǎng)

2013年按照文獻[7]的方法進行花藥培養(yǎng)并統(tǒng)計花培特性相關(guān)指標(biāo)。其中，接種矮敗小麥材料30瓶，用于改良群體的種質(zhì)資源材料10瓶，每瓶60枚花藥，3次重復(fù)。2016年接種矮敗小麥改良群體材料736瓶，約44 160枚花藥。

1.2.3 分子標(biāo)記檢測

選取3個HMW-GS(Bx7、Bx14、Dx5)和3個LMW-GS(Glu-A3ac、Glu-A3d、Glu-B3b)特異標(biāo)記引物，2016年對花藥培養(yǎng)所獲得的115份花培后代材料進行麥谷蛋白亞基分子標(biāo)記檢測，標(biāo)記引物相關(guān)信息見文獻[8]。PCR反應(yīng)體系(15 μL)：模板DNA 50 ng，2×Taq MasterMix(中科瑞泰北京生物科技有限公司)7.5 μL，標(biāo)記基因上下游引物(10 μmol·L-1)(上海生工)各0.6 μL，用雙蒸水補充反應(yīng)體系至15 μL。Bx7和Dx5的PCR擴增程序參照蘆 靜等[9]的方法；Bx14的擴增程序參照王 欣等[10]的方法，Glu-A3ac、Glu-A3d和Glu-B3b的擴增程序參照Wang等[11]的方法。1%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠(EB)染色。緩沖體系為1×TAE溶液，120 V電壓下電泳30 min，紫外成像系統(tǒng)掃描成像。

1.2.4 農(nóng)藝性狀鑒定

2017-2018年按照常規(guī)育種方法對44份含有4種及4種以上麥谷蛋白亞基的花培小麥株系進行了連續(xù)2年的田間觀察鑒定，對照品種為隴春23號，田間常規(guī)管理。記載主要農(nóng)藝性狀并考種。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2003和SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。方差齊性檢驗用Duncan法檢測，非齊性檢驗用Tamhane’s T2法檢測[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 花藥培養(yǎng)

花藥培養(yǎng)結(jié)果(表1)表明，11份供試材料的愈傷組織誘導(dǎo)率在1.45%～37.28%之間，其中以隴春31號最高，且顯著高于其他材料，和尚頭最低；誘導(dǎo)率超過10%的有7份，其余4份材料均在5%以下。綠苗分化率在6.27%～66.21%之間，最高為引進的矮敗小麥，最低為和尚頭，綠苗分化率超過50%的有5份；20%～50%之間的有2份，其總體趨勢與愈傷組織誘導(dǎo)率基本一致。綠苗生產(chǎn)率在0.22%～21.11%之間，隴春31號最高，隴春29號則最低，超過10%的材料有3份材料，5%～10%之間的有3份。

在對矮敗小麥改良群體的花藥培養(yǎng)中，共接種約44 160枚，獲得愈傷組織2 628塊，愈傷組織誘導(dǎo)率為5.95%；獲得綠苗1 237個，綠苗分化率為47.07%，綠苗生產(chǎn)率為2.80%。經(jīng)煉苗一周后于當(dāng)年10月份移栽入溫室，成活866株，移栽成活率為70.01%；次年4月統(tǒng)計結(jié)實的株數(shù)為571株，即自發(fā)加倍率為65.94%，每株粒數(shù)在3～46粒之間。經(jīng)田間種植篩選獲得115個株系。

表1 引進矮敗小麥群體及雜交父本的花藥培養(yǎng)Table 1 Anther culture of introduced dwarf-sterile population and the hybrid male parents %

同列數(shù)據(jù)后不同字母表示材料間存在顯著差異(P<0.05)。

Different letters following data in same column are significantly different among materials at 0.05 level.

2.2 麥谷蛋白亞基分子標(biāo)記檢測

由表2可知，矮敗小麥含有Bx7、Dx5、Glu-A3ac、Glu-A3d基因；4份雜交父本材料含有5個優(yōu)質(zhì)麥谷蛋白亞基基因，分別為隴春29號、臨麥34號、定豐16號與和尚頭；供試的11份材料均含有Bx7，隴春27除外的其他10份材料均含有Dx5和Glu-A3d，而Bx14僅在臨麥34號中檢測到。

表2 引進矮敗小麥群體及雜交父本的麥谷蛋白亞基分子標(biāo)記檢測Table 2 Molecular marker detection of glutenin subunits in introduced dwarf-sterile wheat population and the hybrid male parents

對所獲得的115個花培后代株系進行分子標(biāo)記檢測的結(jié)果(表3)表明，Bx7的出現(xiàn)頻率最高，為94.78%，這與其在雜交親本中的頻率高相關(guān)；其余依次為Glu-A3ac、Dx5、Bx14、Glu-A3d、Glu-B3b；稀有亞基基因Bx14在41份材料中檢測到，頻率達到35.65%。

為明確所檢測的亞基基因在這些后代材料中的聚合情況，進一步對每份材料含有的優(yōu)質(zhì)亞基組合數(shù)進行了統(tǒng)計(表4)，發(fā)現(xiàn)含有3種亞基組合的材料數(shù)最多，為45(39.13%)份，其余依次為4(32，27.83%)種、2(25，21.74%)種、5(10，8.70%)種、6(2，1.74%)和1(1，0.87%)種亞基組合；聚合有4個及以上優(yōu)質(zhì)麥谷蛋白亞基基因的材料共計44份，占供試材料總數(shù)的38.26%。

表3 麥谷蛋白亞基基因在115個小麥花培后代株系的分布頻率Table 3 Frequency of glutenin subunit genes in 115 wheat anther-cultured plant lines

表4 麥谷蛋白亞基基因在115個花培后代株系的聚合Table 4 Composition of the determined glutenin subunit genes in 115 plant lines

2.3 小麥株系的田間農(nóng)藝性狀鑒定篩選

對聚合有4個以上優(yōu)質(zhì)亞基的44份花培株系在田間進行了連續(xù)2年的農(nóng)藝性狀鑒定，獲得農(nóng)藝性狀優(yōu)良的新品系3份(表5)，這3份新品系生育期與對照相當(dāng)，株高較對照有所增高，與產(chǎn)量相關(guān)的穗粒數(shù)、千粒重及單株粒重均較對照增加。

表5 花培小麥新品系的農(nóng)藝性狀及其含有的麥谷蛋白亞基基因Table 5 Agronomical traits and glutenin subunit genes of the anther-cultured new wheat lines

3 討 論

3.1 小麥花培親本選擇及其花培特性鑒定

篩選具有高花藥培養(yǎng)力的親本材料是花培育種者長期性和基礎(chǔ)性工作[13]。本研究對引進的矮敗小麥群體及10份雜交父本進行了花培特性鑒定，參照趙林姝等[14]方法評價了小麥基因型是否具有高花藥培養(yǎng)力(即愈傷組織誘導(dǎo)率≥12%、綠苗分化率≥21%、綠苗生產(chǎn)率≥8%)，發(fā)現(xiàn)隴春31號、寧春4號和200706均達到這一標(biāo)準(zhǔn)，隴春27號也接近這一標(biāo)準(zhǔn)，這與我們前期的研究結(jié)果基本一致[7,13]。對3份親本材料隴春29號、臨麥34號與和尚頭首次進行了花培特性的評價。引進的矮敗小麥群體由于存在眾多基因型，因此我們隨機采穗進行了花藥培養(yǎng)，總體其花培特性較好。按照花培親本搭配的基本原則[12, 15-16]，本研究所選取的親本中既含有花藥培養(yǎng)力較高的材料(寧春4號、隴春31號、隴春27號、200706)，又有品質(zhì)優(yōu)良的材料(甘春20號、和尚頭)，也有綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)異的材料(隴春23號、隴春29號、臨麥34號、定豐16號)，因而有利于育種工作的進一步開展。

3.2 小麥麥谷蛋白亞基的分子標(biāo)記

麥谷蛋白亞基與小麥品質(zhì)密切相關(guān)[17-20]。早期主要通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)進行麥谷蛋白亞基檢測，然而SDS-PAGE法在兩個方面有所不足，一是需要以收獲的籽粒為原料，在時間上滯后于大田表型的鑒定篩選[21]；二是難以解決LMW-GS拷貝數(shù)高、與醇溶蛋白重疊的問題[22]。因此，以往大量的研究主要集中于HMW-GS的研究，然而LMW-GS約占全部麥谷蛋白的60%，決定面團的強度和粘度，對小麥的加工品質(zhì)也起著相當(dāng)重要的影響[1]。近年來HMW-GS和LMW-GS功能分子標(biāo)記得到開發(fā)，為綜合利用HMW-GS與LMW-GS進行品質(zhì)育種奠定了基礎(chǔ)[11, 23]。本研究采用已開發(fā)的3個HMW-GS和3個LMW-GS功能標(biāo)記對雜交親本材料及花藥培養(yǎng)所獲得的115個株系進行了檢測，明確了隴春23號、臨麥34號及和尚頭等品種攜帶的部分亞基信息，同時獲得了聚合有4個亞基以上的花培后代株系44份，通過農(nóng)藝性狀鑒定，篩選出了3份聚合4種以上優(yōu)質(zhì)亞基的新品系。進一步還需要對這3份材料進行多年多點的產(chǎn)量鑒定及品質(zhì)檢測，為HMW-GS與LMW-GS分子標(biāo)記在小麥育種實踐的應(yīng)用提供支持。

3.3 高效育種技術(shù)體系的建立

自1970年代初開始，人們從事小麥花培育種研究已近半個世紀(jì)之久，國內(nèi)外相關(guān)研究者通過不斷優(yōu)化花藥培養(yǎng)技術(shù)體系，相繼育成品種50多個，目前已成為小麥常規(guī)育種的重要補充[3, 24]。而與傳統(tǒng)常規(guī)育種相比，花培品種偏少，花培育種技術(shù)所具有的縮短育種時間和提高育種效率的優(yōu)勢未能得到充分體現(xiàn)，這與人們最初對其期待有一定距離。分析個中緣由，主要與小麥花藥培養(yǎng)的基因依賴性強、培養(yǎng)效率低，以及與其他育種技術(shù)結(jié)合不夠密切相關(guān)[3]。因此，除了繼續(xù)從影響花藥培養(yǎng)的關(guān)鍵因子入手以提高花藥培養(yǎng)效率之外，還需探索該技術(shù)與其他技術(shù)結(jié)合的可行性，擴大該技術(shù)應(yīng)用的廣度和深度，才能更好地發(fā)揮花藥培養(yǎng)的優(yōu)勢[25]。近年來，矮敗小麥育種技術(shù)在小麥新品種選育中獲得巨大成功，而目前快速發(fā)展的分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)可有效克服傳統(tǒng)常規(guī)育種中選擇的盲目性。本研究將花培育種技術(shù)、矮敗小麥育種技術(shù)與分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)進行有機結(jié)合，獲得了3份農(nóng)藝性狀優(yōu)良且至少聚合4種以上優(yōu)質(zhì)亞基的新品系，經(jīng)進一步培育有望育成新品種在生產(chǎn)上應(yīng)用，這為建立以“矮敗小麥+花藥培養(yǎng)+分子標(biāo)記”三者有機結(jié)合的小麥高效育種技術(shù)體系提供了參考依據(jù)。