王楠，姜允嘉，王洋，趙曉宏，郭鵬，蔡大勇，謝勇

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以高熱穩(wěn)定性的腺苷酸基琥珀酸合成酶為催化劑大量合成腺苷酸基琥珀酸（鹽）

王楠，姜允嘉，王洋，趙曉宏，郭鵬，蔡大勇，謝勇

100193 北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室

實現(xiàn)腺苷酸基琥珀酸（鹽）（S-AMP）的大規(guī)模合成，為開展藥物學等研究提供原料。

以 pET-28-a 為表達載體，利用大腸桿菌表達古細菌OT3 來源的腺苷酸基琥珀酸合成酶（PhAdSS），利用 Ni-NTA 層析柱純化后作為催化劑在實驗室內開展這種微生物體內合成 S-AMP 的反應。用 Bradford 法測定純化后 PhAdSS 的濃度。利用硅膠薄層層析檢測反應進度。用硅膠柱層析法和重結晶法純化S-AMP，利用質譜法測定合成品中 S-AMP 的分子量，利用紫外分光光度法測定合成品內 S-AMP 的含量及回收率。

經純化后從 1 L 的自動誘導培養(yǎng)基中至少獲得 20 mg的His-tagged-PhAdSS。將含有 10 mmol/L 肌苷酸、11 mmol/L L-天冬氨酸、20 mmol/L 鳥苷三磷酸、4 mmol/L MgCl2、2.9 μmol/L 的 His-tagged-PhAdSS 溶液于常壓環(huán)境中，70 ℃恒溫6 h 以上可以實現(xiàn) IMP 完全轉化為 S-AMP。純化后可得到 S-AMP 的單晶體，利用紫外分光光度法測定的純度為 94%，收率為 17%。

實現(xiàn)了 PhAdSS 為催化劑的 S-AMP 的大量合成。

腺苷酸基琥珀酸（鹽）； 腺苷酸基琥珀酸合酶； 古細菌OT3

腺苷酸基琥珀酸（鹽）[adenylosuccinic acid（adenylosuccinate），S-AMP]存在于所有生物體內，由腺苷酸基琥珀酸合成酶（adenylosuccinate synthetase，AdSS）利用肌苷酸（IMP）、L-天冬氨酸和鳥苷三磷酸（GTP）為原料合成[1]。S-AMP 是合成 AMP 的前體化合物，具有刺激胰島素分泌，促進II型糖尿病患者胰島 β 細胞恢復正常的功能[2]。我們發(fā)現(xiàn)在 HepG2 細胞內 S-AMP 能激活腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK），提升細胞的糖脂質代謝效率[3-4]。因此，S-AMP 可作為改善糖脂代謝紊亂疾病新藥的先導化合物開展成藥性研究。僅有 Sigma公司曾經銷售過純度 96% 的 S-AMP，現(xiàn)已停產。為了保障 S-AMP 成藥性研究的原料所需，首先要實現(xiàn) S-AMP 的大量制備。

AdSS 反應底物都是價格低廉的生物化工產品，獲得一定量的 AdSS 即可開展基于酶促反應的 S-AMP 的大規(guī)模合成。OT3 是分布于海底熱泉噴口附近高溫高壓環(huán)境中的一種古細菌，最佳生長溫度為 98 ℃[5]。這種微生物體內的AdSS（PhAdSS）比常溫環(huán)境中生存的生物如細菌、高等動植物來源 AdSS 具有更高的熱穩(wěn)定性[5-6]，更有利于大量制備。用 PhAdSS 可以在實驗室或工廠內進行生物體內的S-AMP 合成反應，實現(xiàn)S-AMP 的大規(guī)模、低成本制備。本文報道大量制備 PhAdSS 并以其為催化劑實現(xiàn) S-AMP 的合成及純化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質粒 大腸桿菌的 DH5α 感受態(tài)細胞和 BL21(DE3) 感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術公司；pET-28-a 購自美國 Novagen公司；pET-19-b-PhAdSS 質粒由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 胰蛋白胨、酵母提取物購自英國 Oxoid 公司；α-乳糖、葡萄糖購自上海國藥集團；限制性 DNA 內切酶I 和H I、T4 DNA 連接酶購自美國 Transgen公司；質粒小提試劑盒、膠回收試劑盒購自美國 Genstar 公司；十水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化銨、硫酸鎂、硫酸鈉等試劑由北京化工廠生產；硫酸卡那霉素、IPTG、Tris、SDS 和 EDTA 等由美國 Amresco公司提供；腺苷酸基琥珀酸（含量 96%）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺由美國 Sigma公司提供；Ni-NTA 蛋白質層析填料購自中國科學院過程工程研究所。合成S-AMP 的原料 IMP、GTP 和 L-天冬氨酸為希杰（聊城）生物技術公司生產，純度大于 90%；HSGF254 型硅膠層析板由煙臺市化學工業(yè)研究所制造。

1.1.3 主要儀器 LQ-A30002 型電子天平、恒壓恒流電泳儀電泳槽購自美國 Bio-Rad 公司；HZQ 系列振蕩培養(yǎng)箱和TD5A 型離心機購自金壇市科析儀器有限公司；DHP-9082 型電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海一恒科技有限公司；TGL-16 型高速臺式冷凍離心機購自湖南湘儀離心機儀器有限公司；Envision 2104-0010 型酶標儀購自美國 Perkin Elmer 公司；Nano drop 2000C 紫外分光光度計購自美國 Thermo 公司。

1.2 方法

1.2.1 PhAdSS 的制備 利用 pET-19-b 原核表達載體成功實現(xiàn)了PhAdSS 的表達、純化、結晶化[6]和晶體結構測定（PDB ID：2D7U，5K7X）。本項研究以 His-tagged-PhAdSS 為催化劑合成 S-AMP，為了減少 His-tag 融合蛋白的N 末端的序列，改用 pET-28-a 載體表達N 末端帶有 MGSSHHHH HHSSGLVPRGSH 序列的 His-tagged-PhAdSS。在 20 μl 的pET-28-a（1 μg/ml）和 pET-19-b-PhAdSS（1 μg/ml）溶液中分別加入限制性內切酶I 和H I 各 1 μl，37 ℃下反應 2 h 后用 1% 的瓊脂糖凝膠電泳進行產物分離。100 V 電壓下電泳40 min，從瓊脂糖凝膠中回收 pET-28-a 和 PhAdSS，操作依據 DNA 膠回收試劑盒的條件開展；取 1 μl 的 pET-28-a 與 3 μl 的 PhAdSS 的 cDNA 混合，加入 0.5 μl 的 T4 DNA 連接酶和 0.5 μl 的 T4 DNA 連接酶反應溶液，16 ℃下反應 16 h。將反應生成的 pET-28-a-PhAdSS 質粒轉化到大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細胞內，37 ℃恒溫箱中在含有 50 μg/ml 硫酸卡那霉素的 LB 固體平板培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)，得到的轉化子用含有 50 μg/ml 硫酸卡那霉素的 LB 液體培養(yǎng)基 37 ℃下培養(yǎng) 12 h，用質粒小提試劑盒提取 pET-28-a-PhAdSS 質粒。而后將質粒 pET-28-a-PhAdSS 轉化到大腸桿菌 BL21(DE3) 感受態(tài)細胞內，利用自動誘導大腸桿菌表達法[7]表達 PhAdSS，轉化子接種于自動誘導培養(yǎng)基（1 L自動誘導培養(yǎng)基內含有胰蛋白胨10 g、酵母提取物 5 g、磷酸氫二鈉 8.95 g、磷酸二氫鉀 3.4 g、氯化銨 2.67 g、硫酸鈉 0.71 g、硫酸鎂 0.5 g、甘油 15 ml、葡萄糖 0.5 g、α-乳糖 2 g、氯化鐵0.03 g）內，37 ℃培養(yǎng) 24 h 后室溫下離心沉降大腸桿菌細胞。每升培養(yǎng)基內回收的大腸桿菌細胞用 15 ml 的上樣緩沖液[20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑]懸浮，70 ℃恒溫 20 min 后讓樣品的溫度緩慢降至室溫。4℃，12 000 ×離心 20 min 去除產生的變性蛋白質等沉淀；上清液流經柱體積 10 ml 的 Ni-NTA 蛋白質層析柱后，用 60 ml 的上樣緩沖液流過 Ni-NTA 蛋白質層析柱洗去雜質，然后用 30 ml 的洗脫液[20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、500 mmol/L NaCl、200 mmol/L 咪唑]將His-tagged-PhAdSS 從層析柱上洗脫出來，回收樣品用 SDS-PAGE 檢測純度，用 Bradford 法測定純化后的蛋白質濃度。蛋白質層析分離在室溫下進行。柱層析法純化 His-tagged-PhAdSS 的流速約為 5 ml/min。

1.2.2 PhAdSS 的活性研究 測定反應開始后特定時間下反應體系的290可以計算 S-AMP 的濃度，據此可以判斷酶活性的大小[8-9]。酶標儀測定反應開始后體系的290，確定 PhAdSS 的最佳活性條件。

1.2.2.1 酸度對 PhAdSS 活性的影響 反應體系中含有500 μmol/L IMP、250 μmol/L GTP、10 mmol/L 天冬氨酸和 0.12 μmol/L（0.9 μg）PhAdSS。用醋酸鹽緩沖溶液、MES 緩沖鹽溶液以及 Tris-HCl 緩沖溶液控制 pH 值分別在4.0 ~ 5.0、5.5 ~ 6.5 和7.0 ~ 8.0 范圍。緩沖溶液的濃度為 30 mmol/L。50℃環(huán)境中測定反應體系 pH 值分別為 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5 和 8.0 的反應初始速率，以此作為判斷酶活性大小的依據。

1.2.2.2 溫度對 PhAdSS 活性的影響 依據 PhAdSS 的活性對酸度的依存性實驗結果，選定在 pH 7.5 條件下，檢測溫度對 PhAdSS 催化活性的影響。在酶反應體系含有 30 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）、15 mmol/L 醋酸鎂、500 μmol/L IMP、250 μmol/L GTP、10 mmol/L 天冬氨酸和0.12 μmol/L（0.9 μg）的 PhAdSS。測定 30、37、40、50℃溫度環(huán)境中的反應初始速率作為衡量酶活性的標準。

1.2.3 S-AMP 的實驗室小試合成

1.2.3.1 S-AMP 合成反應裝置和條件 為了保證 IMP 能完全轉化為 S-AMP，兼顧 S-AMP 合成效率，設定反應體積 0.5 L；反應體系配方為10 mmol/L IMP、20 mmol/L GTP、11 mmol/L L-天冬氨酸、4 mmol/L MgCl2，His-tagged-PhAdSS 濃度分別為 80、100、200 mg/L，根據 PhAdSS 活性分析結果，用 10 mol/L 的 NaOH 調節(jié)反應體系 pH 為7.5，由于 S-AMP 具有良好的熱穩(wěn)定性，溫度增加有利于提高反應速度。因此，反應體系設定在 70 ℃水浴鍋內緩慢攪拌 20 h。用硅膠薄層層析法檢測反應進行時間段的 IMP 轉化率。

1.2.3.2 合成反應體系成分鑒定 合成反應結束后，利用硅膠薄層層析法分析產物中的成分。展開劑中異丙醇和 6.25% 氨水的體積百分比分別為 65% 和 35%（展開劑配方為本項研究中確定，對 IMP 和 S-AMP 有良好的分離）。

1.2.4 S-AMP 純化

1.2.4.1 硅膠柱層析 根據分離樣品的極性差異，用硅膠薄層層析法檢測能讓S-AMP 和 GDP 在硅膠層上遷移速率相差最大的展開劑配方，流動相中無水乙醇和 6.25% 氨水的體積比為 6:4 可實現(xiàn) S-AMP 和 GDP 的最大分離。稱取分離樣品總質量 50 倍的 H 硅膠（200 ~ 300 目），用無水乙醇調成糊狀，填充至層析柱內，層析柱直徑為18 cm，硅膠填充高度 20 cm。打開層析柱下部活塞，讓無水乙醇盡量流出，硅膠層中不得殘留氣泡。

合成反應完成后調節(jié)反應溶液 pH 值為 2.9，室溫下放置 10 h，讓過量的 L-天冬氨酸析出。過濾去除固體后，上清液轉移至蒸發(fā)皿內，用蒸氣浴法濃縮至原來體積的 20%，溶液中的不溶物過濾去除。用分離硅膠質量十分之一的上樣硅膠（60 ~100 目）吸附待分離樣品，加入到分離硅膠層上，高度不超過 0.5 cm。膠層頂部放上一張圓形濾紙，防止加入流動相時液體擾亂硅膠層。加入體積相當于硅膠柱體積 1.5 倍的流動相溶液。室溫下按每瓶 50 ml 回收流出液。溶液內成分用硅膠薄層層析檢測。展開劑中乙醇和 6.25% 氨水體積百分比分別為 65% 和 35%。

1.2.4.2 S-AMP 重結晶 合并 S-AMP 為單一成分的流出液，用 10 mol/L NaOH 水溶液調節(jié)pH 值至 10，用旋轉蒸發(fā)法去除有機溶劑和氨后，將剩余水溶液 pH 值調節(jié)為 3，在空氣浴上蒸干。37℃恒溫箱內用 60% 乙醇水溶液溶解固體至飽和。過濾去除不溶物后將溶液溫度降低到室溫，然后于–20℃冰箱內放置 10 h 以上，讓 S-AMP 重結晶，而后在室溫下迅速抽濾去除液體。

1.3.4.3 產物內 S-AMP 的定性和定量分析 配制濃度為 0.2 mmol/L 的S-AMP 標準品和合成品溶液，測定紫外吸收光譜；而后配制 S-AMP 標準溶液，用工作曲線法測定重結晶樣品中 S-AMP 的含量。質譜法測定分子量：取 1 mg 合成品溶解于 5 ml 甲醇中，用 DFS 質譜分析儀測定樣品中各成分的分子量。

2 結果

2.1 PhAdSS 的制備

純化 His-tagged-PhAdSS 各階段的蛋白質樣品 SDS-PAGE經過 Ni-NTA 柱層析后，無雜質蛋白被檢出（圖 1）。用 Bradford 法測定蛋白質濃度計算蛋白總量，多次試驗結果證明，從1 L 自動誘導培養(yǎng)基可得到不少于 20 mg 的 His-tagged-PhAdSS。

M：標準分子量蛋白質；1：大腸桿菌破碎后的可溶性蛋白；2：70 ℃恒溫去除變性蛋白的樣品；3：70 ℃恒溫產生的變性蛋白；4：Ni-NTA 柱層析純化后的蛋白樣品

M: Marker; 1: Soluble proteins fromcells; 2: Sample after removed denatured protein incubated at 70 ℃; 3: Denatured proteins generated at 70 ℃; 4: Protein sample purified by Ni-NTA column chromatography

圖 1 純化 PhAdSS 各階段的蛋白質樣品的 SDS-PAGE

Figure 1 SDS-PAGE of purification stages of PhAdSS

2.2 PhAdSS 的活性

在50℃，溶液的 pH 6.0 以下時 PhAdSS 的活性低，pH 值從 6.0增加到 6.5 時，PhAdSS 的活性有顯著性增加，pH 6.5 ~ 8.0 環(huán)境中 PhAdSS 的活性是測試條件中最好的（圖 2A）。在 pH 7.5 的條件下檢測溫度對 PhAdSS 活性的影響，結果如圖 2B 所示，40℃以下環(huán)境中 PhAdSS 無明顯的活性，當溫度達 50 ℃時，PhAdSS 的活性顯示突躍式增加。酶標儀能控制最大溫度為 55 ℃。在55℃環(huán)境中測定的結果由于 96 孔微孔板中樣品很快蒸發(fā)，結果準確度欠佳。根據 PhAdSS 在溫度高于 70 ℃環(huán)境中不變性[6]的特點，可以認為在50℃以上溫度環(huán)境中，PhAdSS 的活性應該增大。為了提高反應速度，在小試合成研究中選用 pH 7.5 和 70 ℃條件下以 PhAdSS 為催化劑開展 S-AMP 的小試合成。

圖 2 反應體系的 pH（A）和溫度（B）對 PhAdSS 活性的影響

Figure 2 pH (A) and temperature (B) of the reaction system effect on the PhAdSS activity

圖 3 硅膠薄層層析鑒定的不同濃度 PhAdSS 作為催化劑反應開始后一定時間的反應體系成分的結果

Figure 3 Compositions of the reaction system were identified using the silica gel thin-layer chromatography with various concentrations PhAdSS as a catalyst and at a certain time after the reaction started

2.3 S-AMP 合成反應條件

合成后 S-AMP 用硅膠薄層層析檢測，結果見圖 3，酶濃度為 2.3 μmol/L（80 μg/ml）的反應體系中，盡管反應時間超過10 h，IMP 仍不能完全轉化為 S-AMP；酶濃度為2.9 μmol/L 的反應體系中，反應時間超過 6 h，反應體系中已無 IMP 檢出，可以認為 IMP 完全轉化為 S-AMP；酶濃度為 5.8 μmol/L 的反應體系中，反應時間超過2 h，IMP 可完全地轉化為 S-AMP。因此可認為 His-tagged-PhAdSS 能使 IMP 完全轉化為 S-AMP 的最低濃度是2.9 μmol/L，至少反應 6 h。反應體系放大為 2 L 也能達到同樣的轉化效果。

2.4 產物中 S-AMP 的定性分析結果

迄今為止無 S-AMP 的紫外吸收光譜被報道，0.2 mmol/L 的 Sigma 產S-AMP 的紫外吸收光譜（圖 4A）和本研究合成的 S-AMP 的紫外吸收光譜（圖 4B）都顯示 S-AMP 的最大吸收波長是266 nm，根據 Sigma 產S-AMP 的266 nm計算 S-AMP 的266 nm為 1.94 × 105L/(mol·cm)。依據該波長下測定的 S-AMP 的266 nm濃度工作曲線（圖 4C）計算的合成品中 S-AMP 的含量為 94%，獲得的 S-AMP 質量為 0.394 g，理論產量為 2.31 g，收率為 17%。

圖 4 0.2 mmol/L 的 Sigma 公司產 S-AMP 的紫外吸收光譜（A）和同樣濃度下 S-AMP 合成品的紫外吸收光譜（B）、濃度標準曲線（C）、質譜圖（D）

Figure 4 UV spectrum of 0.2 mmol/L S-AMP from Sigma (A) and synthesized in this study (B), concentration standard curve (C), mass spectrometry (D) of S-AMP synthesized in this study

利用 TQD 質譜儀的高分辨率陰離子法測定的合成品中 S-AMP 的分子量為 462.0655（圖 4D），化合物數據庫收錄的陰離子質譜法測定的 S-AMP 分子量為 462.066，兩者相同，與 Sigma 公司提供的S-AMP 的分子量也相同。質譜圖中無 IMP、GDP 等峰出現(xiàn)，證明樣品中的雜質可能來源于反應原料并且對紫外光沒有吸收的功能，需要利用 HPLC-MS 等方法進一步開展研究。

3 討論

先導化合物的成藥性研究需要大量樣品作為支撐，實現(xiàn)藥物先導化合物的低成本合成是保障藥物研究經濟性的前提。對 S-AMP 的合成研究而言，已有研究闡明了 S-AMP 在解偶聯(lián)嘌呤核苷酸代謝通路中的位置，即由 AdSS 利用 IMP、L-天冬氨酸和 GDP 合成。對 AdSS 的反應機制已開展了 50 多年的研究，已有大腸桿菌、瘧原蟲、兔等來源的酶促反應動力學研究論文發(fā)表[8-11]，但未見 S-AMP 的大規(guī)?；瘜W合成或生物合成的研究成果發(fā)表。

AdSS 存在于所有生物體內，美國 National Center for Biotechnology Information（NCBI）數據庫內已經登錄了約三萬種不同生物來源的 AdSS 的基因序列和氨基酸序列。已知幾乎所有生物體內的 AdSS 含有 430 ~ 470 個氨基酸，分子量為45 ~ 50 kD。另外，有極少數 AdSS 含有 330 ~350 個氨基酸，分子量為 36 ~ 39 kD。這些小分子量的AdSS 可以歸納為 AdSS 中的特殊一類，小分子量 AdSS 主要存在于古細菌體內。迄今為止，對大腸桿菌[12-15]、擬南芥和小麥[16]、瘧原蟲[17]、小鼠[18-19]等常溫生物體內的大分子量 AdSS 的晶體結構（一部分物種來源的 AdSS 晶體結構中結合了底物或底物的結構類似物）和 PhAdSS 的晶體結構（PDB ID：2D7U，5K7X）證明，AdSS 具有活性中心結構的高度相似性。大分子量 AdSS 的穩(wěn)定性較差，純化困難，未見利用生物催化劑實現(xiàn) S-AMP 大量制備的報道。古細菌來源的小分子量 AdSS 具有良好的熱穩(wěn)定性，本項研究基于 PhAdSS 的高熱穩(wěn)定性，利用蛋白質熱變性沉淀原理簡便地實現(xiàn)了 His-tagged-PhAdSS 的大量純化，以其為催化劑實現(xiàn)了 S-AMP 的實驗室小試制備。從合成產物中純化 S-AMP 的方法簡單，純化步驟短，實現(xiàn)了實驗室內大規(guī)模、低成本合成 S-AMP，有望發(fā)展為工業(yè)化生產 S-AMP 的新工藝，為開展 S-AMP 的成藥性研究等保障原料供應。

志謝 中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術研究所司書毅教授幫助實施 PhAdSS 活性研究，在此表達誠摯謝意。

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Large-scale synthesis of adenylosuccinate using a high thermal stability adenylosuccinate synthetase as a bio-catalyst

WANG Nan, JIANG Yun-jia, WANG Yang, ZHAO Xiao-hong, GUO Peng, CAI Da-yong, XIE Yong

Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education, Beijing 100193, China

To set up a large-scale synthesis system of adenylosuccinate (S-AMP) for providing mass chemical resources in pharmaceutical studies.

Adenylosuccinate synthetase (AdSS) from archaeaOT3 (PhAdSS) was expressed incells using the pET-28a vector as a His-tagged fusion protein. The His-tagged-PhAdSS was purified by a Ni-NTA column. Concentration of the His-tagged-PhAdSS was determined using the Bradford method. The His-tagged-PhAdSS was used as a catalyst to perform large-scale synthesis of S-AMP. Analysis of the reaction progress was carried out using the silica gel thin-layer chromatography. S-AMP was purified using the silica gel column chromatography and re-crystallization. The molecular weight of synthesized S-AMP was measured using mass spectrometry. The concentration of S-AMP in the synthesized sample and yield of the large-scale synthesis system were determined using the UV spectrophotometry.

More than 20 mg His-tagged-PhAdSS could be obtained from per liter of auto-induce medium. Under a normal pressure environment, IMP can completely be converted to S-AMP in a solution containing 10 mmol/L inosine mono-phosphate (IMP), 11 mmol/L L-aspartate, 20 mmol/L guanosine tri-phosphate (GTP), 4 mmol/L MgCl2and 2.9 μmol/L His-tagged-PhAdSS, with gently stirring at 70 ℃ for more than 6 hours. After purification, single crystal of S-AMP was obtained. Yield and recovery rate of the large-scale synthesis system of S-AMP set up in this study were 94% and 17%, respectively.

A large-scale synthesis system of S-AMP is set up using PhAdSS as a bio-catalyst.

Adenylosuccinic acid (Adenylosuccinate); Adenylosuccinate synthase;OT3

XIE Yong, Email: xyosaka@163.com, yxie@implad.ac.cn

國家自然科學基金（81473114）

謝勇，Email：xyosaka@163.com、yxie@implad.ac.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.02.002

2018-12-20