，，,3，*

(1.欽州學(xué)院，廣西 欽州 535099；2.廣西大學(xué)，南寧 530004；3.廣西北部灣特色海產(chǎn)品資源開發(fā)與高值化利用高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 欽州 535099)

南美白對(duì)蝦(Penaeusvannamei)學(xué)名凡納繽對(duì)蝦[1]，在我國(guó)廣東、廣西、海南等省產(chǎn)業(yè)帶迅猛發(fā)展，在“十一五”期間，在北海、欽州、防城港三市已形成南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)帶。我國(guó)對(duì)蝦市場(chǎng)近年容量可達(dá)200萬(wàn)噸[2]，對(duì)蝦加工一般是去頭或去殼[3]，將產(chǎn)生諸多蝦廢棄物[4]，科學(xué)地利用蝦頭資源、提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值是一種發(fā)展趨勢(shì)。張愛軍等[5]和Ifuku[6]利用蝦廢棄物制備甲殼素；Coward-Kelly等[7]利用蝦廢棄物制成飼料；Sánchez-Camargo等[8]利用蝦廢棄物提取蝦青素等；Robertoe等[9]和Amado等[10]利用蝦副產(chǎn)物提取蝦青素蛋白；但廣西蝦頭利用的研究報(bào)道較少且未見對(duì)酶種進(jìn)行篩選后優(yōu)化的報(bào)道。酶法是綠色環(huán)保技術(shù)，是具有一定催化活性位點(diǎn)的蛋白酶作用于蛋白質(zhì)的肽鍵發(fā)生水解，使蛋白質(zhì)斷裂成低分子量多肽[11,12]。故本試驗(yàn)研究了最適酶種，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)確定最優(yōu)酶解工藝條件并建立模型，為制備風(fēng)味良好的南美白對(duì)蝦蝦頭調(diào)味料基料，打開廣西對(duì)蝦加工產(chǎn)生的大量廢棄物深利用的局面，增加廣西對(duì)蝦的經(jīng)濟(jì)價(jià)值奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

南美白對(duì)蝦：廣西欽州市東風(fēng)市場(chǎng)；木瓜蛋白酶(6×104U/g)、堿性蛋白酶(2×105U/g)、中性蛋白酶(2×105U/g)：南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；甲醛：上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站經(jīng)銷。

101-3型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱 上海東星建材試驗(yàn)設(shè)備有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市科析儀器有限公司；EL204型電子天平 上海光譜儀器有限公司；EL20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 南美白對(duì)蝦蝦頭酶解工藝

蝦頭→清洗→晾干→打漿→加水混合→調(diào)pH、加酶→恒溫水解→滅酶→離心→酶解液。

1.2.2 測(cè)定方法

水分的測(cè)定：直接干燥法[13]；灰分的測(cè)定：高溫灼燒法[14]；粗脂肪的測(cè)定：索氏提取法[15]；蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：半微量凱氏定氮法[16]。

游離氨基氮的測(cè)定：甲醛電位滴定法[17]；將離心的酶解液加入到燒杯中，備用。加入10 mL中性甲醛，攪勻，靜置2 min，用0.5 mol/L的NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至pH 9.2；并記錄消耗的0.5 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)液的毫升數(shù)V1。用相同體積蒸餾水重復(fù)上述操作進(jìn)行空白測(cè)試。

游離氨基氮(mg/mL)=C×(V1-V2)×14/V。

公式(1)

式中：C為NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定液濃度；V1為消耗的標(biāo)準(zhǔn)滴定液的毫升數(shù)；V2為空白測(cè)試消耗標(biāo)準(zhǔn)滴定液的毫升數(shù)；V為上清液體積，mL。

蛋白質(zhì)水解度(DH)=(離心所得氨基氮的質(zhì)量)/樣品中總氮質(zhì)量×100%[18]。

公式(2)

1.2.3 酶的篩選

選取木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶3種蛋白酶為實(shí)驗(yàn)酶，根據(jù)選擇的蛋白酶的特性[19]和姜震、高翔等研究報(bào)道的蛋白酶的最適水解條件[20,21]，在酶活力相當(dāng)?shù)幕A(chǔ)上，分別用3種蛋白酶對(duì)南美白對(duì)蝦蝦頭進(jìn)行酶解，酶解條件見表1。

表1 酶種酶解條件Table 1 Enzyme hydrolysis conditions

1.2.4 單因素試驗(yàn)

采用1.2.1的工藝進(jìn)行酶解單因素試驗(yàn)，取蝦頭漿5.0 g，按加酶量0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，料液比1∶2，溫度50 ℃，反應(yīng)時(shí)間2 h，pH 7.0，考察加酶量對(duì)蝦頭水解度的影響；取蝦頭漿5.0 g，按料液比1∶2，加酶量0.8%，pH 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，溫度50 ℃，反應(yīng)時(shí)間2 h，考察pH對(duì)蝦頭水解度的影響；取蝦頭漿5.0 g，按料液比1∶2，加酶量0.8%，溫度50 ℃，pH 7.0，分別反應(yīng)1，2，3，4，5 h，考察酶解時(shí)間對(duì)蝦頭水解度的影響；取蝦頭漿5.0 g，按料液比1∶2，加酶量0.8%，pH 7.0，分別在30，40，50，60，70 ℃保溫2 h，考察酶解溫度對(duì)蝦頭水解度的影響。

1.2.5 Box-Behnken中心組合試驗(yàn)

在單因素基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[22]，以水解度為指標(biāo)，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)表Table 2 Response surface design table

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

用Design-Expert 8.0.5b軟件和Origin 8.0軟件處理試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 南美白對(duì)蝦蝦頭營(yíng)養(yǎng)成分

表3 蝦頭營(yíng)養(yǎng)成分Table 3 Nutritional components of shrimp head %

由表3可知，廣西北部灣地區(qū)南美白對(duì)蝦蝦頭營(yíng)養(yǎng)成分依次為水分>粗蛋白>灰分>粗脂肪，蝦頭營(yíng)養(yǎng)豐富，尤其是粗蛋白含量高達(dá)6.92%+0.01%，與張祥剛等[23]研究的陽(yáng)江市誼林海達(dá)速凍水產(chǎn)有限公司提供的蝦頭營(yíng)養(yǎng)成分相一致，其蛋白含量略高于廣西南美白對(duì)蝦，可能是地域、養(yǎng)殖方式和喂養(yǎng)方式不同等因素導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)成分出現(xiàn)差異[24]。故充分利用蝦頭中的蛋白質(zhì)，變廢為寶，提高蝦頭利用率[25]。

2.2 酶的篩選

圖1 酶種對(duì)水解度的影響Fig.1 Effect of enzyme species on the degree of hydrolysis

由圖1可知，在最佳酶解條件下，酶種對(duì)南美白對(duì)蝦蝦頭酶解有顯著影響。其酶解大小依次為堿性蛋白酶>中性蛋白酶>木瓜蛋白酶。相比中性蛋白酶，堿性蛋白酶的酶解能力提高了30%，而對(duì)于木瓜蛋白酶，堿性蛋白酶的酶解能力提高了5%?？赡苁菈A性蛋白酶為內(nèi)切酶，屬于一種絲氨酸脆外高堿性蛋白酶，它能水解蛋白質(zhì)分子肽鏈生產(chǎn)多肽或氨基酸，具有較強(qiáng)的分解蛋白質(zhì)的能力[26]，比其他蛋白酶對(duì)南美白對(duì)蝦的酶解作用強(qiáng)。因此，確定了本試驗(yàn)最佳蛋白酶是堿性蛋白酶。與姜震等采用酶解法提取龍蝦廢棄物中蛋白質(zhì)所選的酶解蛋白酶相一致。

2.3 加酶量對(duì)水解度的影響

由圖2可知，隨著堿性蛋白酶用量不斷增加，水解度有顯著升高，加酶量達(dá)0.8%時(shí)，水解度達(dá)到最高，為38.07%，隨著加酶量增多，水解度降低。從酶促動(dòng)力學(xué)的角度看，當(dāng)酶用量加到一定值后會(huì)發(fā)生酶抑制作用，故水解度不會(huì)繼續(xù)升高。因此，選取加酶量為0.8%。

圖2 加酶量對(duì)水解度的影響Fig.2 Effect of the additive amount of enzyme on the degree of hydrolysis

2.4 pH對(duì)水解度的影響

圖3 pH對(duì)水解度的影響Fig.3 Effect of pH on the degree of hydrolysis

由圖3可知pH對(duì)蝦頭水解度的影響，pH達(dá)到8.0前，水解度隨pH增大而增大，pH 8.0時(shí)水解度達(dá)到最高，為38.38%，相比于起始pH 5.0，水解度提升了17%。之后隨pH值增高，水解度下降，可能是堿性蛋白酶最佳pH為8.0左右，此時(shí)有利于堿性蛋白酶對(duì)蝦頭蛋白進(jìn)行水解，導(dǎo)致氨基氮含量有所變化。

2.5 時(shí)間對(duì)水解度的影響

由圖4可知，在1～3 h之間，隨著酶解時(shí)間增加，酶解效果越來越好，水解度逐漸增高。繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，水解度先下降然后趨于平穩(wěn)，可能是隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，即加熱時(shí)間增長(zhǎng)導(dǎo)致酶可能失活，酶活力下降。因此，選擇水解度最高的3 h。

圖4 時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.4 Effect of time on the degree of hydrolysis

2.6 溫度對(duì)水解度的影響

圖5 溫度對(duì)水解度的影響Fig.5 Effect of temperature on the degree of hydrolysis

由圖5可知，在選定的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，水解度也有顯著的增加，但在50 ℃以后，水解度開始降低，原因可能是加熱溫度過高使堿性蛋白酶失活，會(huì)抑制酶解反應(yīng)的速率，導(dǎo)致水解度降低[27]。因此，選取溫度為50 ℃。

2.7 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

為獲取風(fēng)味好、水解率高的南美白對(duì)蝦蛋白酶解產(chǎn)物，在堿性蛋白酶水解單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面優(yōu)化法進(jìn)行最適水解條件的優(yōu)化，響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)見表4。

表4響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果
Table 4 The results of response surface test

試驗(yàn)號(hào)A加酶量(%)B pHC時(shí)間(h)D溫度(℃)水解度(%)11.07.03.05039.9720.88.04.06039.2330.88.03.05042.9641.08.04.05041.2951.08.03.06040.0860.88.03.05042.6270.87.04.05039.99

續(xù) 表

2.8 回歸方程擬合及方差分析

采用Design-Expert 8.05b軟件對(duì)表4的27組試驗(yàn)數(shù)據(jù)根據(jù)方程進(jìn)行多元回歸分析，建立響應(yīng)面回歸模型，得到水解度(DH)對(duì)編碼自變量A，B，C，D的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為：

方程1：DH=42.67+0.68A+0.67B+2.51C+4.23D+0.11AB-0.097AC-0.42AD-1.25BC-1.19BD-0.81CD-1.34A2-2.63B2-3.02C2-5.60D2。

轉(zhuǎn)化為實(shí)際空間的方程為：

方程2：DH=-446.58375+64.67917A+51.97583B+35.03167C+7.38133D+0.53750AB-0.48750AC-0.21125AD-1.25000BC-0.11875BD-0.080750CD-33.47917A2-2.62792B2-3.01542C2-0.055967D2。

方程3：DH=-446.58375+64.67917A+51.97583B+35.03167C+7.38133D-1.25000BC-0.11875BD-33.47917A2-2.62792B2-3.01542C2-0.055967D2。

表5 回歸模型方差分析Table 5 Regression model and analysis of variance

注：p值<0.0001時(shí)表示極顯著，p值<0.0500時(shí)表示顯著；“**”表示極顯著，“*”表示顯著。

2.9 響應(yīng)面圖分析

(a)加酶量與pH

(b) 加酶量與時(shí)間

(c) 加酶量與溫度

(d) pH與時(shí)間

(e)pH與溫度

(f) 時(shí)間與溫度

響應(yīng)曲面的分析主要是從響應(yīng)面曲線圖及等高線進(jìn)行分析。由圖6中(a)可知，當(dāng)時(shí)間為3 h時(shí)，酶解溫度為50 ℃，加酶量相對(duì)較少時(shí)，隨著pH值的升高，水解度增加效果只有微少變化；而當(dāng)加酶量逐漸升高時(shí)，pH在零水平下的水解效果更好。由于單因素對(duì)響應(yīng)面的影響是顯著的，當(dāng)加酶量和pH值在接近零水平時(shí)，即加酶量在0.8%和pH值在7.8～8.2之間時(shí)，水解度出現(xiàn)最高點(diǎn)。由圖6中(b)可知，當(dāng)pH值為8.0時(shí)，酶解溫度為50 ℃，在設(shè)定的范圍內(nèi)，蝦頭水解度隨加酶量的增加而升高，同理，水解度也隨時(shí)間的延長(zhǎng)在一定程度上升高。前期的試驗(yàn)也證明，當(dāng)加酶量和時(shí)間在接近零水平時(shí)，即加酶量為0.8%和酶解時(shí)間為3 h左右，水解度出現(xiàn)最高點(diǎn)。當(dāng)pH值為8.0，時(shí)間為3 h，由于單因素對(duì)響應(yīng)面影響顯著，在設(shè)定范圍內(nèi)，水解度隨著加酶量的增加和溫度的提高而有一定的升高，當(dāng)加酶量和溫度在接近零水平時(shí)，即加酶量為0.8%和溫度為50 ℃時(shí)，水解度出現(xiàn)最高值。當(dāng)加酶量為0.8%，酶解溫度為50 ℃，pH值和時(shí)間以及它們的相互作用對(duì)水解度的影響都是顯著的，因?yàn)榈雀呔€的形狀反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，越趨向于橢圓形以及相應(yīng)曲面越陡峭表示兩因素交互作用顯著。pH值和時(shí)間在接近零水平，即當(dāng)pH為8.0和酶解時(shí)間為3 h左右時(shí)，水解度出現(xiàn)最高值。由圖6中(e)可知，當(dāng)加酶量為0.8%，酶解時(shí)間為3 h，pH和溫度以及它們之間的交互作用對(duì)響應(yīng)面的影響都是顯著的，因?yàn)榈雀呔€的形狀反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，越趨向于橢圓形以及相應(yīng)曲面越陡峭表示兩因素的交互作用顯著。因此，這2個(gè)因素接近零水平時(shí)，即pH接近8.0、酶解溫度接近50 ℃時(shí)，水解度出現(xiàn)最高值。由圖6中(f)可知，當(dāng)加酶量為0.8%，pH為8.0時(shí)，由于時(shí)間和溫度這2個(gè)因素的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)面都有顯著的影響，在一定范圍內(nèi)，水解度會(huì)隨著時(shí)間和溫度的升高而升高，時(shí)間和溫度在接近零水平時(shí)，即酶解時(shí)間為3 h和酶解溫度為50 ℃時(shí)，水解度出現(xiàn)最高值。響應(yīng)面分析也說明我們確定的最佳加酶量、pH值、酶解時(shí)間和酶解溫度都在設(shè)定的試驗(yàn)范圍內(nèi)。

3 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化和對(duì)擬合模型方程的分析，獲得了擬合方程的最大值點(diǎn)，即加酶量0.84%、pH 7.96、時(shí)間3.37 h、酶解溫度53 ℃。為考察該點(diǎn)和實(shí)際值的差異，特別是在pH<8.00這樣一種超出考察范圍的條件下的擬合度，需要在該條件下，進(jìn)行酶解南美白對(duì)蝦蝦頭驗(yàn)證試驗(yàn)。驗(yàn)證試驗(yàn)除所求的4個(gè)條件不一樣之外，其余條件，包括設(shè)備和設(shè)計(jì)響應(yīng)面的酶解試驗(yàn)均相同。試驗(yàn)3次平行所測(cè)得的水解度為43.85%，43.88%，43.91%，這與43.92%的預(yù)測(cè)值存在可接受的誤差，故取平均值為43.88%±0.03%，在本試驗(yàn)中，在試驗(yàn)考察范圍之外的該點(diǎn)處，方程失去了較少的擬合度，該方程比較理想，最優(yōu)組合較可靠。

4 結(jié)論

廣西北部灣地區(qū)南美白對(duì)蝦蝦頭營(yíng)養(yǎng)豐富，尤其是蛋白含量較高；通過響應(yīng)面法對(duì)蝦頭進(jìn)行酶解工藝優(yōu)化，建立了蝦頭蛋白水解度的回歸模型為DH=-446.58375+64.67917A+51.97583B+35.03167C+7.38133D-1.25000BC-0.11875BD-33.47917A2-2.62792B2-3.01542C2-0.055967D2。優(yōu)化所得最佳條件為加酶量0.84%、pH 7.96、時(shí)間3.37 h、酶解溫度53 ℃，在此條件下，水解度為43.88%±0.03%。為廣西北部灣南美白對(duì)蝦下腳料利用提供了數(shù)據(jù)， 可獲得風(fēng)味良好的蝦調(diào)味料基液。