，，，，

(鄭州大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，鄭州 450001)

高良姜(Galangal)又名良姜、小高良姜，為姜科(Zingiberaceae)山姜屬(Alpinia)多年生草本植物高良姜(AlpiniaofficinarumHance)的干燥根莖，廣泛分布于我國華南地區(qū)[1]。高良姜是藥食同源植物，其性熱味辛，具有溫中止嘔、散寒止痛的功效[2]，近年來，國內(nèi)外研究表明，高良姜具有抗腫瘤、抗增殖、抗炎、抗氧化等多種生理功能[3,4]。

許多研究表明，自由基的產(chǎn)生和清除失衡加速機(jī)體衰老過程并誘導(dǎo)各種疾病的發(fā)生[5]，細(xì)胞損傷與氧化應(yīng)激的關(guān)系最為密切[6]。食物中的天然抗氧化劑，特別是多酚類物質(zhì)，是抑制活性氧的生物活性成分[7,8]。α-葡萄糖苷酶是存在于小腸黏膜細(xì)胞刷狀緣上通過水解α-1,4-糖苷鍵切下葡萄糖來參與人體糖代謝的消化酶。胰脂肪酶是催化脂肪水解為甘油、脂肪酸、甘油單酯或二酯的關(guān)鍵酶。若抑制這二者的活性可以降低脂肪水解和多糖降解，延緩脂肪和碳水化合物的吸收，達(dá)到降脂、降糖的目的。

本文以高良姜為原料，對其水提物中的多酚和總黃酮含量、抗氧化活性以及對胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性進(jìn)行了測定，以探討高良姜的體外抗氧化活性及其在降脂、降糖方面的能力，以期為高良姜的開發(fā)利用提供科學(xué)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

新鮮高良姜樣品：購于鄭州市某市場，經(jīng)鄭州大學(xué)藥學(xué)院教授鑒定為姜科植物高良姜。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(2,2′-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonate), ABTS)、2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪(2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine，TPTZ)、α-葡萄糖苷酶、2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪(2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine, TPTZ)、胰脂肪酶：美國Sigma公司；槲皮素、沒食子酸 (gallic acid, GA)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside,PNPG)、Tris-HCl：上海阿拉丁試劑公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器

LGJ-18B型真空冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；DHG-9076A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；RE-2000型轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；TGL-20M臺式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司；Spectra Max M2e多功能微孔板讀數(shù)儀 美谷分子儀器(上海)有限公司；AL204型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 樣品水提物的制備

在真空冷凍干燥機(jī)中將新鮮樣品高良姜徹底凍干，粉碎后過篩(60目)，在通風(fēng)櫥中使用CCl4脫脂(1∶10，g/mL) 24 h，抽濾晾干。精確稱取15 g脫脂樣品干粉，以1∶10的體積比加入純水浸提24 h，抽濾后重復(fù)浸泡2次，合并濾液，濃縮冷凍干燥。稱取500 mg凍干粉溶于1 mL純水中，作為待測提取液母液，在4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 多酚和總黃酮含量的測定

參照Ainsworth等[9]的方法，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用福林酚法測定多酚含量。于1.5 mL的離心管中加入100 μL待測提取液母液并梯度稀釋，每管加200 μL配制好的10% Folin-Ciocalteu試劑，混勻后每管加800 μL 700 mmol/L的Na2CO3，25 ℃ 孵育2 h，移取300 μL到96孔板中，于765 nm波長處測定吸光度。水提物中多酚含量以每1 g干粉所含的沒食子酸當(dāng)量(mg GAE/g DW)表示。參照Arvouet Grand等[10]的方法，并稍作改進(jìn)。取100 μL待測提取液并梯度稀釋，每孔加入等量的2% AlCl3甲醇溶液，在25 ℃孵育10 min，于415 nm波長處測量吸光度。水提物總黃酮含量以槲皮素當(dāng)量 (quercetin equivalent，QE) 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行定量，最終表示為每1 g干粉所含的槲皮素當(dāng)量(mg QE/g DW)。

1.4.3 抗氧化能力的測定

1.4.3.1 ABTS自由基離子清除法

參照Ali等[11]的方法，并稍作修正。ABTS+·工作液的制備：等量混合2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液和7 mmol/L ABTS乙醇溶液，避光反應(yīng)12～16 h，用無水乙醇溶液將其稀釋至在734 nm波長處的吸光度為0.7±0.02。在96孔板中加20 μL樣品提取液并梯度稀釋，加80 μL ABTS+·工作液，在18～25 ℃避光2 min，于734 nm處測定吸光度Ai；使用等量乙醇替代ABTS+·工作液，測定Aj；使用等量純水替代樣品液，測定Ac。ABTS自由基離子清除率計算公式見公式(1)：

公式(1)

1.4.3.2 DPPH自由基離子清除法

參照Cheng等[12]的方法，采用DPPH自由基清除能力法測定水提物的抗氧化功能。于96孔板中分別加入100 μL提取液并梯度稀釋，加100 μL 0.208 mmol/L DPPH甲醇溶液，在25 ℃靜置40 min于517 nm處測定吸光度Ai；使用等量甲醇溶液替代DPPH溶液，測定Aj；使用等量純水溶液替代樣品液，測定Ac。DPPH自由基離子清除率計算公式見公式(2)：

公式(2)

1.4.3.3 鐵離子還原能力法

參照Sreerama Y N等[13]的方法。TPTZ工作液由300 mmol/L醋酸鈉溶液、10 mmol/L TPTZ溶液和20 mmol/L FeCl3溶液以10∶1∶1的體積比混合而成。于96孔板中分別加入40 μL提取液并梯度稀釋，加260 μL TPTZ工作液，在37 ℃ 孵育30 min，于595 nm處測定吸光度。以FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液作為參照，樣品提取液的鐵離子還原能力以達(dá)到相同吸光度所需的FeSO4濃度表示。

1.4.4 代謝關(guān)鍵酶抑制活性的測定

1.4.4.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

參照Kang等[14]的方法，使用0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液 (phosphate buffer saline，PBS，pH 6.8)配制0.2 U/mL α-葡萄糖苷酶工作液與2.5 mmol/L PNPG工作液。于96孔板中加入8 μL提取液并梯度稀釋，加112 μL 0.1 mol/L PBS和20 μL α-葡萄糖苷酶工作液，混勻，在37 ℃反應(yīng)15 min后，加入20 μL PNPG工作液，在37 ℃反應(yīng)15 min，加入80 μL 0.2 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，測定405 nm波長處的吸光度A樣；以20 μL PBS緩沖液替代酶工作液，測吸光度A樣空；以8 μL純水替代樣品液，測吸光度A陰；以8 μL純水替代樣品液，以20 μL PBS緩沖液替代酶工作液，測吸光度A空。樣品提取液α-葡萄糖苷酶活性的抑制率計算公式見公式(3)：

α-葡萄糖苷酶活性抑制率(%)=[1-(A樣-A樣空)/(A陰-A空)]×100。

公式(3)

1.4.4.2 胰脂肪酶抑制活性的測定

參照McDougall等[15]的方法，并稍作修改。底物工作液的配制：稱取0.08 gpNP laurate，溶于100 mL 5 mmol/L乙酸鈉溶液 (pH 5.0，含1% Triton X-100)，沸水浴1 min，冷卻至室溫。胰脂肪酶工作液的配制：用純水溶解配成10 mg/mL的胰脂肪酶工作液，4 ℃，13000 r/min，離心5 min后取上清液。于離心管中分別加入50 μL提取液并梯度稀釋，加150 μL酶工作液與350 μL 0.1 mol/L Tris-HCl 緩沖液(pH 8.2)，37 ℃預(yù)溫10 min，依次加入450 μL底物工作液，37 ℃反應(yīng)2 h。反應(yīng)終止后，16000 r/min離心3 min，取上清液加入96孔板，測定405 nm處的吸光度A樣；以150 μL Tris-HCl 緩沖液替代酶工作液，測定A樣空；以50 μL純水替代樣品液，測定A陰；以50 μL純水替代樣品液，150 μL Tris-HCl緩沖液替代酶工作液，測定A空。樣品提取液對胰脂肪酶活性的抑制率計算公式見公式(4)：

胰脂肪酶活性抑制率(%)=[1-(A樣-A樣空)/(A陰-A空)]×100。

公式(4)

1.5 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用Excel 2016對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，使用SPSS 21.0進(jìn)行單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 高良姜水提物中多酚與總黃酮含量的測定結(jié)果

使用福林-酚比色法來測定多酚含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線以沒食子酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，見圖1。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

由圖1可知，在測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，沒食子酸濃度與吸光度值的線性關(guān)系較好，結(jié)果顯示：高良姜水提物中多酚含量為45.73 mg GAE/g DW。

使用AlCl3比色法測定總黃酮含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線以沒食子酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，見圖2。

圖2 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of quercetin

由圖2可知，在測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，槲皮素與吸光度值的線性關(guān)系良好，測得高良姜水提物中總黃酮的含量為0.41 mg QE/g DW。

2.2 高良姜水提物的抗氧化能力

2.2.1 ABTS自由基清除能力

ABTS+·為一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，乙醇溶液為藍(lán)綠色，當(dāng)加入抗氧化物質(zhì)時，單個電子被配對，ABTS+·溶液褪色，通過測定在734 nm波長處的吸光度變化可反映出樣品抗氧化能力的大小[16]。高良姜水提物對ABTS+·的清除能力見圖3。

由圖3可知，高良姜水提物在測定的濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出的ABTS自由基清除能力與濃度呈正相關(guān)(P<0.05)。在高良姜水提物濃度達(dá)到25 mg/mL時，對ABTS+·的清除能力達(dá)到97.93%。IC50是指物質(zhì)的濃度達(dá)到半數(shù)抑制或者清除自由基活性，常用來表示其抗氧化活性，IC50越小，表示抗氧化活性越強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)水提物對ABTS自由基的半抑制濃度IC50值為2.55 mg/mL，說明水提物對ABTS自由基的清除能力較強(qiáng)。

圖3 高良姜水提物的ABTS自由基清除能力Fig.3 ABTS free radical scavenging capacity of aqueous extract of galangal

2.2.2 DPPH自由基清除能力

二苯代苦味?；杂苫?DPPH+·)是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，其乙醇溶液呈深紫色，若受試物能將其清除則乙醇溶液顏色變淺，提示受試物具有降低自由基濃度的作用，可在517 nm處動態(tài)檢測其清除效果[17]。高良姜水提物對DPPH自由基的清除能力見圖4。

圖4 高良姜水提物的DPPH自由基清除能力Fig.4 DPPH free radical scavenging capacity of aqueous extract of galangal

由圖4可知，高良姜水提物濃度在6.25～50 mg/mL時，其對DPPH自由基離子的清除率隨著濃度的增大而增大，且各濃度的清除率之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，當(dāng)其濃度達(dá)到50 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率達(dá)到最大值83.53%。高良姜水提物對DPPH自由基的半數(shù)抑制濃度IC50值為8.78 mg/mL。因此，可初步判斷高良姜水提物對DPPH自由基離子的清除能力較強(qiáng)。

2.2.3 鐵離子還原能力

Fe3+吡啶三吖嗪可被樣品中的還原物質(zhì)還原為Fe2+，F(xiàn)e2+與TPTZ結(jié)合生成藍(lán)色絡(luò)合物，在593 nm處有最大吸光度。吸光度越大，表示試樣的還原能力越強(qiáng)，該物質(zhì)具有更高的抗氧化活性[18]。FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5。

圖5 FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of FeSO4

由圖5可知，以FeSO4濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，F(xiàn)eSO4在測定的濃度范圍內(nèi)與其在595 nm處的吸光度線性關(guān)系良好。高良姜水提物的FRAP值為382.14 μmol Fe2+/g DW。

2.3 高良姜水提物對代謝關(guān)鍵酶的抑制活性

2.3.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性

α-葡萄糖苷酶可以催化小腸內(nèi)蔗糖、麥芽糖等雙糖以及三糖和寡糖的水解，抑制其活性，可以延長碳水化合物的消化時間并降低葡萄糖的吸收速度，進(jìn)而延緩餐后血糖的升高[19]。高良姜水提物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性見圖6。

圖6 高良姜水提物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性Fig.6 α-glucosidase inhibition activity of aqueous extract of galangal

由圖6可知，高良姜水提物濃度在62.50～500.00 mg/mL 時，對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率隨著質(zhì)量濃度的增大而增大(y=24.053ln(x)+68.865，R2=0.9576，P<0.05)，IC50值為14.45 mg/mL，說明在此濃度范圍內(nèi)高良姜水提物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用與提取物濃度有明顯的相關(guān)性，并且各濃度下的α-葡萄糖苷酶抑制率之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3.2 胰脂肪酶抑制活性

脂肪是產(chǎn)能系數(shù)最高且必須經(jīng)胰脂肪酶消化才能被人體吸收的宏量營養(yǎng)素。胰脂肪酶由胰腺分泌并在人體消化和吸收脂質(zhì)的過程中起關(guān)鍵作用[20]。使用胰脂肪酶抑制劑能夠抑制其活性，從而抑制脂肪的水解和吸收，達(dá)到防治肥胖的目的[21]。高良姜水提物對胰脂肪酶的抑制活性見圖7。

圖7 高良姜水提物對胰脂肪酶抑制活性Fig.7 Pancreatic lipase inhibition activity of aqueous extract of galangal

由圖7可知，高良姜水提物對胰脂肪酶具有較好的抑制活性，當(dāng)濃度為62.5 mg/mL時，對胰脂肪酶的抑制率較低，但隨著濃度的增大，其抑制活性逐漸增強(qiáng)，IC50值為543.51 mg/mL。曲線回歸分析表明在此濃度范圍內(nèi)，對胰脂肪酶抑制活性呈現(xiàn)質(zhì)量濃度依賴性(P<0.05)。

2.4 高良姜水提物生物活性與其多酚和總黃酮含量的相關(guān)性分析

為進(jìn)一步探討高良姜水提物的抗氧化能力和酶抑制功能來源，本文對水提物的抗氧化能力、胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性與其多酚、總黃酮含量的相關(guān)性分析結(jié)果見表1。

表1 高良姜水提物生物活性與其多酚、總黃酮含量的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis between bioactivity and content of polyphenols and flavonoids of aqueous extract of galangal

注：“*”表示有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。

由表1可知，高良姜水提物多酚和黃酮含量與其3種抗氧化能力指標(biāo)、α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶的抑制活性均呈正相關(guān) (P<0.05)。說明高良姜水提物的抗氧化和代謝酶抑制能力大部分來自于其中的多酚和黃酮類化合物。

3 結(jié)論

傳統(tǒng)中藥植物已被證明是開發(fā)新型藥物的寶貴來源。本研究發(fā)現(xiàn)，我國傳統(tǒng)藥食同源植物高良姜水提物中多酚含量豐富，具有較好的ABTS和DPPH自由基離子清除能力，同時又具有顯著的鐵離子還原能力，并且其對α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶的抑制能力較好。相關(guān)性分析說明高良姜水提物的抗氧化能力、胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性大部分來自于其中的酚類物質(zhì)。因此，高良姜作為天然植物來源的抗氧化劑和代謝酶抑制劑，具有抗氧化和調(diào)節(jié)機(jī)體糖脂代謝的潛力，在抗氧化劑和降糖、降脂藥物的開發(fā)方面具有良好的應(yīng)用前景。