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(成都大學 藥學與生物工程學院，成都 610106)

亞硝酸鹽是日常食物中常見的一種致癌物質前體，其進入人體后能與次級胺結合,形成亞硝胺,誘發(fā)消化系統(tǒng)癌變,對人體健康造成威脅[1]。亞硝胺是一類化學致癌物質,因此阻斷亞硝胺合成或消除亞硝酸胺的前體是防治癌病產生的有效途徑之一[2，3]。我國食品衛(wèi)生法規(guī)定了腌制品中亞硝酸鹽含量應小于30 mg/kg[4，5]。日常飲食中許多物質中均存在超標的亞硝酸鹽：如不新鮮或過度施用氮肥的蔬菜、不新鮮的水果、臘肉、泡菜、醬腌菜等[6，7]。實際上，如果人們在植物種植過程中采用正確的種植方法，同時消費者正確選擇食物，亞硝酸鹽對人體造成的影響會減小很多。比如菜農適量施加氮肥，消費者不去購買不新鮮的蔬菜水果，盡量少吃臘肉、醬腌菜等含亞硝酸鹽高的食物，但是在現實生活中卻很難做到。因此，尋找一個能快速消除亞硝酸鹽并且不會帶入新的有害物質的材料具有非常重要的現實意義。山葵植物體自身含有豐富的Vc、異硫氰酸酯類化合物和硒等物質[8]，其中已知的Vc、硒物質能有效抑制亞硝胺的合成[9]。同時山葵本身具有獨特風味，能對食物起到很好的調味作用。本文敘述了通過條件優(yōu)化尋找山葵浸提液消除亞硝酸鹽的最優(yōu)條件，同時將山葵浸提液用于部分食品中亞硝酸鹽的消除，效果明顯。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

山葵根莖：廣元市生物科技璽府公司；對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、NaNO2、硼砂、硫酸鋅、亞鐵氰化鉀：均為分析純；臘肉(腌制4天，保存1個月)、酸菜(腌制3天)、腌蘿卜(腌制4天)：均為自制；維生素C：成都市科龍化工試劑廠。

752型紫外-可見分光光度計 上海達平儀器有限公司；PHS-3C型酸度計 成都銳新儀器有限公司；HH-4S水浴鍋；FA1204B/0.0001 g電子分析天平；高速組織攪拌器。

1.2 標準曲線的繪制

分別吸取不同量的亞硝酸鈉標準溶液于比色管中構成不同亞硝酸鹽濃度，加入4 g/L對氨基苯磺酸2 mL，搖勻靜止3 min，加入1 mL 2 g/L鹽酸萘乙二胺，加水定容至刻度，靜止15 min。于波長538 nm處測定吸光度，得標準曲線為y=0.61289x+0.01271,r=0.99926，線性范圍為0～1.4 μg/mL。

1.3 臘肉、酸菜、腌制蘿卜3種樣品處理

臘肉、酸菜、腌制蘿卜3種樣品搗碎，各取200 g于燒杯中，加水200 mL制成勻漿備用。

1.4 山葵浸提液的制備

山葵根莖洗凈、晾干、搗碎后，取25 g，用300 mL 40%乙醇轉入500 mL錐形瓶中，在20 ℃下浸提40 min后用濾紙過濾，將濾液放置在15 ℃黑暗泡沫箱中備用。

1.5 亞硝酸鹽含量的測定

取40 mL制備的樣品于比色管中，以下步驟按標準曲線繪制操作。于波長538 nm處測吸光度，從標準曲線上查得亞硝酸鹽的含量。

1.6 亞硝酸鹽清除率的測定

準確吸取5 μg/mL NaNO2溶液2.5 mL,移入50 mL比色管中,加15 mL山葵浸提液,調pH,搖勻,反應15 min后,加2 mL 0.4%對氨基苯磺酸,搖勻,靜置4 min,再加入1 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺，搖勻，定容至刻度,靜止15 min，取上清液,于538 nm處測吸光度值。

NaNO2清除率=[A-(B-C)]/A。

式中：A為亞硝酸鈉OD值；B為實驗組OD值；C為山葵浸提液OD值。

1.7 山葵浸提液對亞硝酸鹽最佳清除條件的探究

通過單因素試驗確定山葵浸提液對亞硝酸鹽清除率的影響因素,之后選取主要因素,設置不同水平,通過正交試驗確定山葵浸提液對亞硝酸鹽的最佳清除條件。

1.8 樣品中亞硝酸鹽清除率的測定

分別取2份臘肉、酸菜、腌制蘿卜勻漿，其中1份加入山葵浸提液，調節(jié)反應液pH值為3.2，反應30 min，另1份做空白，然后將勻漿全部轉入250 mL容量瓶中，加入6 mL飽和硼砂溶液，搖勻，再加入30%硫酸鋅溶液2 mL和15%亞鐵氰化鉀溶液2 mL，振搖3 min，定容至刻度，搖勻，靜置，過濾，按1.6操作方法比色，計算山葵浸提液對食品中亞硝酸鹽的清除率。

1.9 不同pH反應介質中Vc對亞硝酸鹽的消除測定

取1.75 g Vc溶于1000 mL 40%乙醇溶液中，其濃度為1.75 mg/L，取15 mL，與2.5 mL亞硝酸鈉在不同pH介質下反應，顯色測定，計算其消除率。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

設置反應介質pH值、山葵浸提液用量、浸提溫度、浸提時間、反應時間和亞硝酸鹽量6個因素來研究山葵浸提液清除亞硝酸鹽的影響。

2.1.1 反應介質pH 值對亞硝酸鹽清除的影響

分別取5份NaNO2溶液，加入20 ℃下浸提40 min山葵浸提液15 mL，用白醋調節(jié)反應液為不同pH值，分別測定亞硝酸鹽的含量，計算清除率，見表1。

表1 反應介質pH值對亞硝酸鹽清除的影響

由表1可知，在不同pH反應介質中，隨著pH的增大，山葵浸提液對亞硝酸鹽的清除率先增大后減小，在pH為3.5的亞硝酸鹽清除率最大，為87.51%，原因是山葵浸提液中對亞硝酸鹽有清除作用的各物質在pH達到3.5時綜合清除率達到最大。

2.1.2 山葵浸提液用量對亞硝酸鹽清除的影響

分別取15支50 mL容量的比色管，每份加 NaNO2溶液2.5 mL, 加入山葵浸提液0，5，10，15，20 mL，用白醋調節(jié)pH為3.5，反應15 min,通過顯色測定其吸光度，計算亞硝酸鹽清除率見表2。

表2 山葵浸提液用量對亞硝酸鹽清除的影響

由表2可知，隨著山葵浸提液用量的增加，在相同時間下不同試樣中亞硝酸鹽的清除率逐漸增加，但在5～10 mL變化明顯，而之后變化較小。山葵浸提液作為反應物其底物濃度增大會加速化學反應中對另一種反應物亞硝酸鹽的消耗，其理論上亞硝酸鹽清除率會接近100%。

2.1.3 不同溫度下獲得的山葵浸提液對亞硝酸鹽清除的影響

山葵浸提液的制備：分別取9份搗碎的山葵根莖每份5 g于250 mL錐形瓶中，加入40%乙醇100 mL在0，5，10，15，20，25，30，35，40 ℃下浸提40 min，過濾后通過顯色測定其吸光度，計算亞硝酸鹽清除率，見表3。

表3 不同溫度條件下獲得的山葵浸提液對NaNO2清除的影響

由表3可知，山葵浸提液的浸提過程中，溫度對亞硝酸鹽的清除影響很大?？傮w趨勢是浸提溫度越高其清除率越低。溫度在0～5 ℃消除率下降明顯，在5～35 ℃消除率變化不大，當溫度大于35 ℃后，清除率又明顯降低。原因可能是山葵中對亞硝酸鹽有清除作用的物質不穩(wěn)定，溫度升高導致其被破壞。目前已知山葵浸提液中對亞硝酸鹽有清除作用的物質Vc是不穩(wěn)定物質，其對熱不穩(wěn)定，容易氧化和被熱破壞[10]，溫度越高其浸提率越低[11,12]。另外，山葵中含有異硫氰酸酯類化合物，其揮發(fā)與水解速度隨著溫度升高而加快[13]。

2.1.4 不同浸提時間的山葵浸提液對亞硝酸鹽清除的影響

山葵浸提液的制備：分別取7份搗碎的山葵根莖，每份5 g于250 mL錐形瓶中，加入40%乙醇100 mL在20 ℃下浸提10，20，30，40，50，60，70 min，過濾后通過顯色測定其吸光度，計算亞硝酸鹽清除率見表4。

表4 山葵浸提時間對亞硝酸鹽清除的影響

由表4可知，山葵浸提液在50 min時對亞硝酸鹽的清除率達到最大，其原因可能是植物浸提的過程分為擴散、滲透、溶解幾個階段[14]。山葵組織細胞被破碎后相應物質溶解需要一定的時間。在浸提時間達到50 min時清除率達到最大，山葵中有些清除亞硝酸鹽的物質不穩(wěn)定，如:Vc與山葵精油類物質均是在溶液中不穩(wěn)定的物質，長時間暴露在光照下和溶于水中被逐漸消耗，從而導致浸提時間加長，亞硝酸鹽消除率降低。

2.1.5 不同作用時間對亞硝酸鹽清除的影響

分別取15支50 mL容量的比色管，每份加5 μg/mL NaNO2溶液2.5 mL, 各加入山葵浸提液15 mL，用白醋調節(jié)pH為3.5,分別反應5,10,15,20,25,30 min，通過顯色測定其吸光度，計算亞硝酸鹽清除率，見表5。

表5 反應時間對亞硝酸鹽消除的影響

由表5可知，隨著反應時間的增加，亞硝酸鹽的清除率增大。其原因是化學反應需要時間，在反應未達平衡之前反應一直正向進行，一直消耗反應物亞硝酸鹽。在理論情況下會一直上升，之后逐漸變緩至水平，清除率不會出現兩邊低中間高的峰值。同時在15 min后消除率增長變慢，說明前15 min大部分反應物已經被消耗。

2.1.6 不同亞硝酸鹽量對亞硝酸鹽清除率與清除量的影響

顯色與測量：實驗組取6支50 mL容量的比色管，每份加 5 μg/mL 亞硝酸鹽溶液1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0 mL, 加入山葵浸提液15 mL,用白醋調節(jié)pH為3.5，反應15 min，通過顯色測定其吸光度，計算亞硝酸鹽清除率見表6。

表6 亞硝酸鹽量對亞硝酸鹽清除量和清除率的影響

由表6可知，在山葵液用量不變的情況下，亞硝酸鹽加入量為1 mL時清除率最大為100%，隨著反應物中亞硝酸鹽含量的增加，清除率逐漸降低。而亞硝酸鹽清除量剛好相反，其呈現先增加后逐漸保持不變的狀態(tài)。在加入亞硝酸鹽量達到3 mL之后，亞硝酸鹽的消除量基本上保持不變，說明15 mL山葵浸提液清除的亞硝酸鹽為13.43 μg。

2.2 山葵浸提液對亞硝酸鹽最佳清除條件的測定

選取山葵浸提溫度、浸提時間、反應液 pH 值3個主要因素采用 L9(34)正交表進行正交試驗以確定山葵對亞硝酸鹽的最佳清除條件。

表7 浸提溫度、提取時間、pH正交試驗

由表7可知，在幾種因素各自的梯度下，因素C(pH)為最重要的因素，因素A(溫度)次之，最后是因素B(提取時間)。隨機變量極差為1.14，與提取時間極差1.87相差不大，說明提取時間在50 min上下波動幅度為5 min時消除效果已很穩(wěn)定。通過正交試驗得出最佳控制條件為：提取溫度0 ℃、提取時間55 min、反應介質pH 3.2。

2.3 山葵浸提液清除食品中亞硝酸鹽

2.3.1 山葵浸提液對臘肉亞硝酸鹽的清除

測得臘肉中亞硝酸鹽含量為35.67 mg/kg,用山葵液處理后測得亞硝酸鹽含量為5.32 mg/kg，清除率為85.09%。

2.3.2 山葵浸提液對白菜腌制的酸菜中亞硝酸鹽的清除

測得酸菜中亞硝酸鹽含量為58.23 mg/kg,用山葵浸提液處理后測得亞硝酸鹽含量為9.62 mg/kg，清除率為83.48%。

2.3.3 山葵浸提液對腌制蘿卜中亞硝酸鹽的清除

測得腌制蘿卜中亞硝酸鹽含量為12.25 mg/kg，用山葵浸提液處理后測得亞硝酸鹽含量為0.32 mg/kg,清除率為97.39%。

2.4 Vc對亞硝酸鹽的清除研究

表8 Vc對亞硝酸鹽的清除影響

由表8可知， Vc對亞硝酸鹽有清除作用，其中Vc在不同pH下清除亞硝酸鹽的變化趨勢與山葵在不同pH下清除亞硝酸鹽的變化相似。同時根據山葵中成分含量參照已知山葵根莖含有大量Vc，Vc在酸性條件下穩(wěn)定但在堿性條件下不穩(wěn)定，易被分解，Vc的配制濃度也與山葵中Vc濃度相對應，因此山葵浸提液對亞硝酸鹽的清除作用可能與Vc關系較大。

3 討論

影響山葵浸提液對亞硝酸鹽清除的主要因素有pH、山葵浸提溫度、山葵浸提時間。本實驗進行條件優(yōu)化，得出最適反應pH為3.2，浸提溫度為0 ℃，浸提時間為55 min，在一定條件下亞硝酸鹽用量越少，山葵浸提液用量越多，且反應時間越長，消除效率越高，但最終會達到最大值，即清除率不再隨著山葵浸提液用量的增加與作用時間的延長而變化。同時，將山葵浸提液運用到食品中對亞硝酸鹽的清除，其效果顯著。

由于山葵作為一種植物，其物質成分太過復雜，本研究只能推導降解亞硝酸鹽的物質有Vc，并不能準確給出降解亞硝酸鹽的主導物質。同時，本實驗山葵的最佳浸提溫度為0 ℃，而朱鳳妹在《大蒜浸提液清除醬腌菜中亞硝酸鹽的研究》中提到大蒜浸提液的最佳浸提溫度為80 ℃，這2種材料浸提溫度相差很大，說明2種植物材料清除亞硝酸鹽的物質必定有較大差異。本實驗對山葵浸提液清除亞硝酸鹽的條件優(yōu)化中，其最適pH酸性較強，食品運用過程中可根據實際情況選擇較弱的酸性條件，同時選用本研究優(yōu)化的其他最適條件也能達到高效清除亞硝酸鹽的效果。本實驗拓展研究發(fā)現，強酸在強酸性環(huán)境下對亞硝酸鹽有清除作用，如用鹽酸使pH達到1.5，反應時間為15 min，其清除率達到8.3%，而pH為0.5時其清除率達到35.8%。