馬進(jìn)寶 楊翰 任斐 黨麗云

作者單位：710100 西安市胸科醫(yī)院

耐藥結(jié)核病的發(fā)生給控制結(jié)核病帶來了巨大挑戰(zhàn)，及時(shí)、準(zhǔn)確地獲得患者耐藥情況是治療及控制耐藥結(jié)核病的關(guān)鍵[1]。目前，表型藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“表型藥敏試驗(yàn)”)仍是診斷結(jié)核分枝桿菌(MTB)耐藥性的主要方法。然而，表型藥敏試驗(yàn)獲取結(jié)果時(shí)間較長(zhǎng)，如BACTEC MGIT 960系統(tǒng)培養(yǎng)，其取得結(jié)果時(shí)間平均為18 d[2]。這使得患者無法獲得及時(shí)和有效的治療，從而導(dǎo)致其痰菌載量增加，肺損傷加重及傳染性持續(xù)[3]。分子生物學(xué)檢測(cè)方法能夠快速檢測(cè)MTB耐藥性，如GeneXpert MTB/RIF(簡(jiǎn)稱“GeneXpert”)檢測(cè)在2 h內(nèi)便能獲得利福平(RFP)耐藥結(jié)果?！督Y(jié)核病病原學(xué)分子診斷專家共識(shí)》認(rèn)為GeneXpert、基因芯片、實(shí)時(shí)熒光定量PCR熔解曲線法(簡(jiǎn)稱“PCR熔解曲線法”)等技術(shù)檢測(cè)MTB耐藥性有較好的敏感度及特異度[4]?！禬S 288—2017 肺結(jié)核診斷》標(biāo)準(zhǔn)已將分子生物學(xué)檢查陽性作為肺結(jié)核病原學(xué)診斷依據(jù)[5]，然而對(duì)于分子生物學(xué)檢查能否作為MTB耐藥性診斷依據(jù)仍存在一定的爭(zhēng)議，且對(duì)于何種分子生物學(xué)檢測(cè)方法更優(yōu)亦無定論。筆者通過分析GeneXpert、基因芯片、PCR熔解曲線法檢測(cè)MTB耐藥性的效能，評(píng)價(jià)3種方法的臨床應(yīng)用價(jià)值。

資料和方法

1.研究對(duì)象：選取2017年1月至2018年1月西安市胸科醫(yī)院有表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果的痰MTB培養(yǎng)陽性的774例肺結(jié)核患者作為研究對(duì)象，其中，男521例(67.3%)，女253例(32.7%)；年齡6～96歲，平均年齡(38.5±18.9)歲；初治637例(82.3%)，復(fù)治137例(17.7%)；異煙肼(INH)耐藥210例(27.2%)，RFP耐藥142例(18.4%)，耐多藥133例(17.2%)。774例患者均有一、二線抗結(jié)核藥物表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果，其中357例患者GeneXpert檢測(cè)陽性，727例患者基因芯片檢測(cè)陽性，201例患者PCR熔解曲線法檢測(cè)陽性。

2.液體培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)：采用BACTEC MGIT 960培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行液體培養(yǎng)，參照《結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊(cè)》[6]操作。取處理好的痰標(biāo)本0.5 ml加入MGIT液體培養(yǎng)管中，放入BACTEC MGIT 960培養(yǎng)系統(tǒng)中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性標(biāo)本，進(jìn)一步用MPB64單克隆抗體(杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司)進(jìn)行測(cè)定，鑒定為MTB菌株進(jìn)行表型藥敏試驗(yàn)。一線抗結(jié)核藥物INH和RFP耐藥性應(yīng)用BACTEC MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)檢測(cè)，INH藥物濃度為0.1 μg/ml，RFP藥物濃度為1.0 μg/ml；二線抗結(jié)核藥物耐藥性應(yīng)用比例法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)，左氧氟沙星(Lfx)藥物濃度為2 μg/ml，莫西沙星(Mfx)藥物濃度為2 μg/ml，阿米卡星(Am)藥物濃度為30 μg/ml，卷曲霉素(Cm)藥物濃度為40 μg/ml。

3.GeneXpert檢測(cè)：取1 ml痰標(biāo)本放置在有螺旋蓋的前處理管中，然后加入相當(dāng)于痰標(biāo)本2倍體積的檢測(cè)樣品試劑(SR)，旋緊前處理管，在渦旋振蕩器上振蕩15～30 s，室溫靜置15 min，使痰標(biāo)本充分液化。打開反應(yīng)盒，使用試劑盒內(nèi)提供的專用無菌吸管，取2 ml處理后樣品由加樣孔緩慢加入反應(yīng)盒，然后將反應(yīng)盒放置到檢測(cè)模塊，儀器開始自動(dòng)化檢測(cè)。接種后的痰標(biāo)本消化液按照 GeneXpert(美國 Cepheid 公司)標(biāo)準(zhǔn)化操作手冊(cè)步驟進(jìn)行操作[7]。

4.基因芯片檢測(cè)：基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)及配套試劑均由北京博奧生物有限公司生產(chǎn)，將消化液(10 ml 2.94%檸檬酸三鈉、10 ml 4%氫氧化鈉、0.1 g 乙酰半胱氨酸)預(yù)處理好的痰標(biāo)本放入晶芯Extractor 核酸快速提取儀中提取核酸，將提取的核酸放入基因擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增，基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性后加入到MTB 耐藥檢測(cè)試劑盒的芯片點(diǎn)陣中，然后放入晶芯BioMixer Ⅱ雜交儀進(jìn)行芯片反應(yīng)，再將完成雜交的芯片放入晶芯 Slide Washer芯片洗干儀中進(jìn)行洗干，將洗干的芯片載入晶芯LuxScan10K-B微陣列芯片掃描儀中，自動(dòng)進(jìn)行結(jié)果判讀。

5.PCR熔解曲線法：由廈門致善生物科技股份有限公司研發(fā)。取處理好痰標(biāo)本1 ml加入有螺旋蓋的前處理管中，加入相當(dāng)于痰標(biāo)本2倍體積的處理液，旋緊管口振蕩15～30 s，室溫靜置15 min，打開反應(yīng)盒，取2 ml處理好的標(biāo)本由加樣孔緩慢加入反應(yīng)盒，然后將反應(yīng)盒放在檢測(cè)模塊，儀器自動(dòng)檢測(cè)，反應(yīng)結(jié)束后在窗口下直接觀察結(jié)果。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)算各檢測(cè)方法檢測(cè)效能：敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測(cè)值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%。兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致性用Kappa值判定，Kappa值≥0.75說明一致性好，Kappa值<0.4說明一致性差，0.75>Kappa值≥0.4說明一致性一般。使用MedCalc 18.2.1軟件分析受試者工作特征曲線(ROC曲線)下面積，曲線下面積差異性分析使用Z檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

結(jié) 果

1. GeneXpert檢測(cè)：357例GeneXpert檢測(cè)陽性患者中有初治患者264例(74.0%)，復(fù)治患者93例(26.0%)。其中，表型藥敏試驗(yàn)檢測(cè)RFP耐藥91例(25%)，GeneXpert檢測(cè)RFP耐藥104例(29%)例。以表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，GeneXpert檢測(cè)MTB對(duì)RFP耐藥性的敏感度為95.6%，特異度為93.6%，陽性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值分別為83.7%、98.4%，兩種方法有較好的一致性。分別對(duì)初、復(fù)治患者進(jìn)行檢測(cè)，GeneXpert檢測(cè)初治患者對(duì)RFP耐藥性的陽性預(yù)測(cè)值較低，而檢測(cè)復(fù)治患者對(duì)RFP耐藥性的陽性預(yù)測(cè)值為95.1%，見表1。

2.基因芯片檢測(cè)：727例基因芯片檢測(cè)陽性患者中有初治患者616例(84.7%)，復(fù)治患者111例(15.3%)；其中，表型藥敏試驗(yàn)檢出RFP耐藥97例(13.3%)，INH耐藥165例(22.7%)；基因芯片檢出RFP耐藥110例(15.1%)，INH耐藥135例(18.6%)。以表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，基因芯片法檢測(cè)MTB對(duì)RFP耐藥性的敏感度和特異度分別為92.8%和96.8%；分別檢測(cè)初、復(fù)治患者，基因芯片檢測(cè)初治患者對(duì)RFP耐藥性的陽性預(yù)測(cè)值較低(71.9%)；檢測(cè)初、復(fù)治患者對(duì)RFP耐藥性的陰性預(yù)測(cè)值均大于94%。兩種檢測(cè)方法檢測(cè)MTB對(duì)RFP耐藥性有較好的一致性，見表2。以表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，基因芯片法檢測(cè)MTB對(duì)INH耐藥性的敏感度和特異度分別為78.8%和99.1%，陽性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值分別為96.3%和96.1%，兩種方法檢測(cè)MTB對(duì)INH耐藥性的一致性較好，見表3。

3. PCR熔解曲線法：201例患者PCR熔解曲線法檢測(cè)陽性，以表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，PCR熔解曲線法檢測(cè)MTB對(duì)一線抗結(jié)核藥物、氟喹諾酮類藥物及二線注射類抗結(jié)核藥物耐藥性的效能見表4。PCR熔解曲線法檢測(cè)MTB對(duì)RFP及INH耐藥性的陽性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值均較高，與表型藥敏試驗(yàn)一致性較好；檢測(cè)MTB對(duì)二線藥物L(fēng)fx和Am耐藥性的效能與表型藥敏試驗(yàn)一致性較好；但檢測(cè)MTB對(duì)Mfx、Cm耐藥性的效能與表型藥敏試驗(yàn)一致性一般。

表1 GeneXpert檢測(cè)以表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)MTB對(duì)利福平耐藥性的效能

表2 基因芯片法以表型藥敏結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)MTB對(duì)利福平耐藥性的效能

表3 基因芯片法以表型藥敏結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)MTB對(duì)異煙肼耐藥性的效能

表4 PCR熔解曲線法以表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥性的效能

4. ROC曲線分析：以表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，繪制3種分子生物學(xué)檢測(cè)方法檢測(cè)MTB對(duì)RFP耐藥性ROC曲線，GeneXpert法ROC曲線下面積大于基因芯片及PCR熔解曲線法ROC曲線下面積，GeneXpert法ROC曲線下面積為0.95±0.02，基因芯片法和PCR熔解曲線法ROC曲線下面積均為0.93±0.03，三種方法曲線下面積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=0.87，P=0.387)(圖1)。

基因芯片與PCR熔解曲線法ROC曲線完全重合圖1 以表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，3種分子生物學(xué)方法檢測(cè)MTB對(duì)RFP耐藥性的ROC曲線

討 論

本研究結(jié)果顯示，3種分子生物學(xué)方法檢測(cè)MTB對(duì)RFP耐藥性均比較可靠(Kappa值均大于0.75)，考慮是因?yàn)镚eneXpert、基因芯片法及PCR熔解曲線法均通過測(cè)定MTB的rpoB基因突變檢測(cè)RFP耐藥。并且，RFP耐藥MTB的rpoB基因突變率為95%[8]。本次研究中，GeneXpert檢測(cè)MTB對(duì)RFP耐藥性的敏感度和特異度分別為95.6%和93.6%，與國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道一致[9-10]，比較ROC曲線下面積發(fā)現(xiàn)GeneXpert的曲線下面積大于其他兩種方法，這可能與GeneXpert是集痰標(biāo)本處理、DNA提取、核酸擴(kuò)增、MTB特異核酸檢測(cè)、RFP耐藥基因rpoB突變檢測(cè)于一體的方法有關(guān)[11]。

另外，本次研究發(fā)現(xiàn)GeneXpert及基因芯片檢測(cè)MTB對(duì)RFP耐藥性的陽性預(yù)測(cè)值在復(fù)治患者中高于初治患者，提示這兩種方法在復(fù)治患者中檢出RFP耐藥更可靠，考慮是因?yàn)樵趶?fù)治患者中RFP耐藥發(fā)生率較初治患者高有關(guān)[12]。根據(jù)WHO估計(jì)，中國RFP耐藥在初、復(fù)治患者中發(fā)生率分別為12%、69%[13],復(fù)治患者中RFP耐藥率是初治患者中的5倍。復(fù)治患者中GeneXpert及基因芯片檢測(cè)MTB對(duì)RFP耐藥性陽性預(yù)測(cè)值為95.1%和92.5%，與表型藥敏試驗(yàn)一致性較好，結(jié)果支持《結(jié)核病病原學(xué)分子診斷專家共識(shí)》[4]中提出當(dāng)分子生物學(xué)方法測(cè)出RFP耐藥時(shí)當(dāng)患者為耐藥高危人群時(shí)，應(yīng)同時(shí)進(jìn)行傳統(tǒng)的藥敏試驗(yàn)，并采用二線抗結(jié)核藥物治療的觀點(diǎn)。

氟喹諾酮類藥物在耐藥結(jié)核病治療中至關(guān)重要，世界衛(wèi)生組織(WHO)2016年及2018年耐藥結(jié)核病治療指南中氟喹諾酮類藥物均在A組藥物當(dāng)中[3，14]。由于近10余年來，氟喹諾酮類藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用，尤其是在我國呼吸和結(jié)核病領(lǐng)域的濫用，其耐藥率呈逐年上升趨勢(shì)[15]。因此，在制定耐藥患者藥物治療方案時(shí)獲得氟喹諾酮類藥物耐藥情況尤為重要，WHO也建議對(duì)于RFP耐藥結(jié)核病患者使用分子生物學(xué)方法進(jìn)行氟喹諾酮類藥物藥敏試驗(yàn)[16]。本次研究發(fā)現(xiàn)，PCR熔解曲線法檢測(cè)MTB對(duì)Lfx及Am耐藥性敏感度為87.1%和75.0%，特異度為98.8%和99.5%，且與表型藥敏試驗(yàn)有較好的一致性，與Pang等[17]報(bào)道一致。因此，筆者認(rèn)為在獲得表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果之前制定耐藥結(jié)核病患者藥物治療方案時(shí)，可根據(jù)PCR熔解曲線法檢測(cè)結(jié)果選擇Lfx和Am。

本次研究顯示，以表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，基因芯片檢測(cè)INH耐藥性敏感度和特異度分別為78.8%和99.1%，與林明冠等[18]報(bào)道一致，但陽性及陰性預(yù)測(cè)值與該文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果有異，可能與所選研究對(duì)象INH耐藥率不同及對(duì)照方法不同有關(guān)。另外，筆者發(fā)現(xiàn)基因芯片法檢測(cè)INH耐藥性的陰性預(yù)測(cè)值在復(fù)治患者中低于初治患者，與Zhu等[19]研究結(jié)果基本一致，其陰性預(yù)測(cè)值均小于90%，說明在復(fù)治患者中基因芯片法檢出INH敏感時(shí)，可信度較差。

PCR熔解曲線法檢測(cè)MTB對(duì)INH耐藥性突變基因包括KatG、inhA、ahPc[20]。本次研究顯示，PCR熔解曲線法檢測(cè)MTB對(duì)INH耐藥性的敏感度和特異度分別為82.4%和95.3%，與Pang等[17]和王曉艷等[21]報(bào)道一致，且敏感度均高于本次研究基因芯片法，亦高于林明冠等[18]和Zhang等[22]報(bào)道的基因芯片法檢測(cè)敏感度。這可能與PCR熔解曲線法增加了ahPc位點(diǎn)檢測(cè)有關(guān)，說明隨著耐藥基因檢測(cè)位點(diǎn)的完善，分子生物學(xué)方法檢測(cè)效能會(huì)增加。

綜上所述，本次研究分析了3種分子生物學(xué)方法檢測(cè)MTB耐藥性的效能，結(jié)果顯示3種方法均有較高的敏感度和特異度；分析了在初、復(fù)治患者中GeneXpert及基因芯片法檢測(cè)效能差異，結(jié)果顯示在不同類型患者中其陽性及陰性預(yù)測(cè)值不同，提示在臨床工作中除了考慮檢測(cè)方法敏感度與特異度外，需結(jié)合患者情況具體分析其臨床意義。本次研究不足為INH和RFP表型藥敏試驗(yàn)應(yīng)用BACTEC MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)，雖然該方法與比例法藥敏試驗(yàn)有較好的一致性[11]，但仍可能導(dǎo)致結(jié)果差異，可能影響對(duì)3種分子生物學(xué)方法檢測(cè)效能的判斷。另外，本次研究為回顧性分析，且研究對(duì)象例數(shù)較多，可能導(dǎo)致收集的患者信息(包括年齡、初復(fù)治、耐藥結(jié)果等)存在偏倚。臨床應(yīng)用中比較檢測(cè)方法優(yōu)劣時(shí)應(yīng)同時(shí)考慮經(jīng)濟(jì)因素，但本研究未對(duì)該方面問題進(jìn)行分析。