董偉杰 秦世炳 蘭汀隆 范俊 唐愷 李元 嚴(yán)廣璇 王恒

作者單位：101149 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院骨科 北京骨關(guān)節(jié)結(jié)核診療中心

耐藥結(jié)核病是目前結(jié)核病治療領(lǐng)域的難點(diǎn)，骨關(guān)節(jié)結(jié)核是一種常見的肺外繼發(fā)性結(jié)核病，約占結(jié)核病患者總數(shù)的1%～3%[1]。脊柱結(jié)核約占骨關(guān)節(jié)結(jié)核的50%。耐藥問題嚴(yán)重影響脊柱結(jié)核患者預(yù)后，出現(xiàn)手術(shù)失敗、結(jié)核復(fù)發(fā)及竇道經(jīng)久不愈合等并發(fā)癥。筆者回顧性分析2015—2018年514例臨床診斷為脊柱結(jié)核的患者，通過穿刺或外科手術(shù)獲得病灶中的膿液、肉芽組織及干酪樣壞死組織，并以無淀粉改良羅氏培養(yǎng)和濃度法進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和表型藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“表型藥敏試驗(yàn)”)，同時(shí)進(jìn)行GeneXpert MTB/RIF(簡(jiǎn)稱“GeneXpert”)檢測(cè)。通過分子生物學(xué)與表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)照，分析兩者在耐藥脊柱結(jié)核診斷中的作用。

資料和方法

一、一般資料

回顧2015年1月至2018年6月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院骨科514例臨床確診為脊柱結(jié)核的患者資料，通過穿刺或外科手術(shù)獲得脊柱結(jié)核病灶中膿液、肉芽組織及干酪樣壞死組織進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌羅氏培養(yǎng)及表型藥敏試驗(yàn)，同時(shí)進(jìn)行GeneXpert檢測(cè)。

二、脊柱結(jié)核臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)

參考英國(guó)國(guó)家慢性病協(xié)作中心和英國(guó)國(guó)家衛(wèi)生與臨床優(yōu)化署2016年制定的結(jié)核診斷指南中關(guān)于骨關(guān)節(jié)結(jié)核診斷的指導(dǎo)意見[2]，本研究臨床診斷為骨關(guān)節(jié)結(jié)核標(biāo)準(zhǔn)為：(1)癥狀體征與影像學(xué)(包括X線、CT及MR檢查)發(fā)現(xiàn)的局部結(jié)核病的膿腫、死骨表現(xiàn)相符；(2)病灶標(biāo)本的病理學(xué)檢查提示為干酪樣壞死并朗格漢斯肉芽腫；(3)病灶標(biāo)本的微生物學(xué)檢查證實(shí)為結(jié)核分枝桿菌感染；(4)規(guī)律抗結(jié)核藥物治療6個(gè)月以上，結(jié)核中毒癥狀及局部癥狀消失。符合以上任意2條即診斷為脊柱結(jié)核。

初治：既往未接受抗結(jié)核治療，或正規(guī)抗結(jié)核治療時(shí)間<1個(gè)月病情未加重或緩解的脊柱結(jié)核患者。復(fù)治：既往曾因肺結(jié)核或肺外結(jié)核接受過抗結(jié)核治療超過3個(gè)月，新發(fā)現(xiàn)脊柱結(jié)核者；或脊柱結(jié)核抗結(jié)核治療超過1個(gè)月病情加重需調(diào)整治療方案者。

三、結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法

1. 標(biāo)本處理：膿液標(biāo)本依照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[3]中的N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)-氫氧化鈉法進(jìn)行標(biāo)本處理。干酪、肉芽及死骨組織在加入適量磷酸鹽緩沖液后，應(yīng)用微型研磨器Fast-prep-24(美國(guó)MP Biomeidcals公司)進(jìn)行勻漿，之后直接接種。

2. 羅氏培養(yǎng)：接種后的改良羅氏培養(yǎng)基置于37 ℃ 培養(yǎng)，每周檢測(cè)1次細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)直至有菌落生長(zhǎng)為止。以結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv作為陽性對(duì)照，以空白管作為陰性對(duì)照。

3. 表型藥敏試驗(yàn)：本研究采用濃度法藥物敏感性試驗(yàn)，按照中國(guó)防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專業(yè)委員會(huì)制定的《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[3]進(jìn)行。

4. GeneXpert檢測(cè)：按照GeneXpert MTB/RIF操作說明書進(jìn)行。取1 ml標(biāo)本于有螺旋蓋的無菌管中，然后加入2 ml 標(biāo)本處理液，旋緊管蓋，在渦旋振蕩器上渦旋振蕩10 s，室溫靜置10 min，在渦旋振蕩器上再次渦旋振蕩10 s，室溫靜置5 min，使標(biāo)本充分液化。吸取2 ml 液化標(biāo)本至GeneXpert反應(yīng)試劑盒，然后將反應(yīng)試劑盒放置到檢測(cè)模塊，儀器開始進(jìn)行自動(dòng)化檢測(cè)。反應(yīng)結(jié)束后，在檢測(cè)系統(tǒng)窗口下可直接觀察測(cè)試結(jié)果。

5. 試劑： 改良羅氏培養(yǎng)基和含藥培養(yǎng)基均購(gòu)自珠海市銀科醫(yī)學(xué)工程有限公司，GeneXpert MTB/RIF試劑盒購(gòu)置美國(guó)Cepheid公司。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)描述

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用百分率表示。

結(jié) 果

514例患者中，男260例(50.6%)，女254例(49.4%)；年齡1～86歲，平均(46.2±18.7)歲。其中，腰椎結(jié)核200例(38.9%)，胸椎結(jié)核186例(36.2%)，腰骶椎結(jié)核60例(11.7%), 胸腰段結(jié)核46例(8.9%)，頸椎結(jié)核14例(2.7%)，頸胸段結(jié)核8例(1.6%)；并發(fā)肺結(jié)核136例(26.5%)，結(jié)核性胸膜炎34例(6.6%)，結(jié)核性腦膜炎18例(3.5%)，腎結(jié)核7例(1.4%)，淋巴結(jié)結(jié)核6例(1.2%)；并發(fā)高血壓69例(13.4%)，糖尿病 41例(8.0%)。

514例患者中，初治445例，復(fù)治69例。羅氏培養(yǎng)及表型藥敏試驗(yàn)陽性109例，陽性率為21.2%，其中表型藥敏試驗(yàn)證實(shí)為耐藥患者25例(4.9%，25/514)，耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)患者7例，占表型藥敏試驗(yàn)陽性患者的6.4%(7/109)，廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)患者2例，占表型藥敏試驗(yàn)陽性患者的1.8%(2/109)。GeneXpert陽性383 例(74.5%)，其中發(fā)現(xiàn)rpoB突變47 例(9.1%，47/514)。表型藥敏試驗(yàn)與GeneXpert在514例患者中的檢出耐藥情況見圖1。表型藥敏試驗(yàn)獲得結(jié)果的平均時(shí)間為(53.0±7.0) d(42.0～65.0 d)，GeneXpert獲取結(jié)果的平均時(shí)間為(1.0±0.4) d(0.1～2.0 d)。

圖1 514例脊柱結(jié)核患者表型藥敏試驗(yàn)和GeneXpert結(jié)果分析流程

109例表型藥敏試驗(yàn)陽性患者中，GeneXpert陽性105例，陰性4例，此4例中3例無耐藥，1例耐鏈霉素和乙硫異煙胺。383例GeneXpert陽性患者中， 105例表型藥敏試驗(yàn)陽性；其余4例表型藥敏

試驗(yàn)陽性，GeneXpert陰性者與109例表型藥敏試驗(yàn)陽性中GeneXpert陰性的4例為相同患者。

經(jīng)表型藥敏試驗(yàn)證實(shí)的25例耐藥患者中初治為13例，復(fù)治12例。其中單耐藥6例(24.0%，6/25)，耐鏈霉素5例，耐異煙肼1例；多耐藥10例(40.0%,10/25)；MDR-TB 7 例(28.0%,7/25)；XDR-TB 2例(8.0%,2/25)。本組患者中耐異煙肼及鏈霉素最多，均為16例(64.0%,16/25)；其次為耐利福平、利福噴丁，均為11例(44.0%,11/25)；第三位為耐利福布汀、對(duì)氨基水楊酸異煙肼，均為8例(32.0%,8/25)。具體耐藥情況見表1。

25例經(jīng)表型藥敏試驗(yàn)證實(shí)的耐藥患者中GeneXpert檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌DNA均為陽性，其中12例患者對(duì)利福平耐藥，GeneXpert均檢測(cè)到rpoB基因突變，1例患者表型藥敏試驗(yàn)未檢測(cè)到利福平耐藥，但GeneXpert仍檢測(cè)到rpoB基因突變。另外35例GeneXpert檢測(cè)到rpoB突變患者中羅氏培養(yǎng)均為陰性，未獲得表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果，其中復(fù)治患者為16例，初治為19例。表型藥敏試驗(yàn)與GeneXpert的報(bào)告時(shí)間(d)、檢出耐藥率(%)、初治耐藥(例)、復(fù)治耐藥(例)及指導(dǎo)替換藥物的比較見表2。

表1 表型藥敏試驗(yàn)檢出的25例耐藥患者對(duì)各類藥物的耐藥情況及在初復(fù)治患者中的分布

表2 表型藥敏試驗(yàn)與GeneXpert MTB/RIF的各項(xiàng)結(jié)果比較

注a：表示514例臨床診斷為脊柱結(jié)核患者中，109例結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性，表型藥敏試驗(yàn)陽性25例，檢出耐藥率為25/514(4.9%)；383例GeneXpert結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)陽性，發(fā)現(xiàn)rpoB突變47例, 檢出耐藥率為47/514(9.1%)

討 論

一、表型藥敏試驗(yàn)對(duì)于指導(dǎo)耐藥脊柱結(jié)核治療仍然不可或缺

表型藥敏試驗(yàn)仍是目前確定結(jié)核分枝桿菌耐藥的金標(biāo)準(zhǔn)，通過表型藥敏試驗(yàn)，可以獲得本地區(qū)的結(jié)核分枝桿菌耐藥譜。Li等[4]在35例耐藥脊柱結(jié)核中發(fā)現(xiàn)異煙肼、利福平、鏈霉素耐藥率分別為54.3%、48.6%、25.7%。Xu等[5]在19例耐藥脊柱結(jié)核中發(fā)現(xiàn)異煙肼、利福平、鏈霉素耐藥率分別為51.2%、47.3%、32.1%。李建華等[6]在49例耐藥脊柱結(jié)核中發(fā)現(xiàn)異煙肼、利福平、鏈霉素耐藥率分別為63.3%、61.2%、48.9%。姚曉偉等[7]在60例耐藥脊柱結(jié)核中發(fā)現(xiàn)異煙肼、利福平、鏈霉素耐藥率分別為35%、41.7%、56.7%。異煙肼、利福平、利福噴丁及鏈霉素在本組患者的耐藥率分別為64.0%、44.0%、44.0%及64.0%。異煙肼、利福平、利福噴丁和鏈霉素是我國(guó)脊柱結(jié)核耐藥的主要藥物，未來有必要在全國(guó)范圍內(nèi)進(jìn)行多中心研究以便獲取更詳實(shí)的數(shù)據(jù)以指導(dǎo)臨床。

雖然表型藥敏試驗(yàn)因?yàn)殛栃月势停@取結(jié)果時(shí)間需要6周左右不能及時(shí)和精準(zhǔn)的指導(dǎo)臨床工作，但由于不同藥物突變靶點(diǎn)的基因多態(tài)性，單純憑借分子生物學(xué)方法目前不能給出患者的完全耐藥譜，臨床醫(yī)生仍然應(yīng)重視傳統(tǒng)培養(yǎng)及表型藥敏試驗(yàn)在耐藥結(jié)核病患者化療方案設(shè)計(jì)中的指導(dǎo)作用。分子生物學(xué)方法由于價(jià)格昂貴而且多數(shù)藥物的突變位點(diǎn)不單一限制了其在臨床中的大規(guī)模應(yīng)用，表型藥敏試驗(yàn)仍是未來很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)掌握本地區(qū)耐藥菌譜的根本手段。

二、綜合運(yùn)用表型藥敏試驗(yàn)與GeneXpert檢測(cè)指導(dǎo)脊柱結(jié)核耐藥患者的診斷與治療

2000年第四次全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查所得441株菌株，其中392株(88.9%)為結(jié)核分枝桿菌，MDR-TB 占10.7%[8]。2010年第五次全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查所得280株結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌株中，耐多藥率為6.8%[9]。本組中109例脊柱結(jié)核培養(yǎng)陽性患者中發(fā)現(xiàn)MDR-TB占8.2%，基于表型藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的耐多藥率變化不大。

吳啟秋等[10]研究250例標(biāo)本中(1993—1999年)，采用BACTEC TB 460培養(yǎng)，陽性培養(yǎng)物48例(19.2%)，結(jié)核分枝桿菌46例(18.4%)，其中MDR-TB共15例(6%)。秦世炳等[11]在1057例脊柱結(jié)核(2005—2012年)中培養(yǎng)陽性 128例(12.1%)，其中MDR-TB占16.4%(21/128)，均為復(fù)治患者。本組患者為我院2015年后正式開展GeneXpert在脊柱結(jié)核中檢測(cè)后收集的數(shù)據(jù)，在514例脊柱結(jié)核中(2015—2018年)，培養(yǎng)陽性109例(21.2%)，培養(yǎng)陽性率較前2次研究均有提高，與本組中初治患者比例較高相關(guān)。本組中通過表型藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MDR-TB及XDR-TB共計(jì)9例(8.3%，9/109)，與吳啟秋等[10]20世紀(jì)90年代末研究的數(shù)據(jù)(6%)持平，但較秦世炳等[11]研究的2005—2012年數(shù)據(jù)(16.4%)差距較大。Li等[4]對(duì)35例耐藥脊柱結(jié)核的回顧性分析中發(fā)現(xiàn)12例(34.3%)為MDR-TB。Pawar等[12]在238例脊柱結(jié)核中經(jīng)細(xì)菌學(xué)證實(shí)為MDR-TB者28例(11.8%)?；谶@些數(shù)據(jù)，脊柱結(jié)核中的耐藥患者并不鮮見。本組中通過GeneXpert發(fā)現(xiàn)的利福平耐藥(RR-TB)患者為47例，大大超過表型藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的11例，證明更多的利福平耐藥患者通過傳統(tǒng)培養(yǎng)及表型藥敏試驗(yàn)無法獲得診斷。同時(shí)表型藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的其他13例耐藥患者GeneXpert也是無法發(fā)現(xiàn)的。

因此對(duì)于臨床工作中發(fā)現(xiàn)的疑似耐藥患者應(yīng)積極獲取病灶標(biāo)本采用分子生物學(xué)方法如GeneXpert進(jìn)行耐藥篩查，以縮短確診耐藥的時(shí)間，并同時(shí)需要做表型藥敏試驗(yàn)以便獲得更多的藥物耐藥數(shù)據(jù)協(xié)助抗結(jié)核治療方案的制定。

三、分子生物學(xué)技術(shù)有助于早期發(fā)現(xiàn)利福平耐藥脊柱結(jié)核患者

由于中國(guó)在全球耐藥結(jié)核病負(fù)擔(dān)中位列第二，脊柱結(jié)核耐藥患者在臨床中屢見不鮮，單純憑借結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及表型藥敏試驗(yàn)不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)所有患者。本組經(jīng)表型藥敏試驗(yàn)證實(shí)耐藥的脊柱結(jié)核患者中11例對(duì)利福平耐藥，GeneXpert在11例中亦檢測(cè)出rpoB突變。賈晨光等[13]在27例利福平耐藥脊柱結(jié)核標(biāo)本中，GeneXpert檢測(cè)出25例發(fā)生rpoB突變；唐亮等[14]在99例培養(yǎng)陽性的脊柱結(jié)核患者中檢測(cè)出39例對(duì)利福平耐藥，GeneXpert檢測(cè)出38例發(fā)生rpoB突變?；诜肿由飳W(xué)手段發(fā)現(xiàn)的耐藥證據(jù)確實(shí)可信，可以指導(dǎo)臨床后續(xù)治療。

本組患者中GeneXpert檢測(cè)到rpoB突變患者中初治為26例，在初治脊柱結(jié)核患者中，耐藥比例有增高趨勢(shì)。由于脊柱結(jié)核患者若出現(xiàn)脊柱畸形，脊柱不穩(wěn)定導(dǎo)致的疼痛及神經(jīng)刺激癥狀需接受手術(shù)治療，術(shù)后若能及時(shí)發(fā)現(xiàn)耐藥并調(diào)整治療方案，將有助于減少手術(shù)失敗的發(fā)生率，并會(huì)降低耐藥脊柱結(jié)核患者的多次手術(shù)概率。

本研究的不足之處在于未能對(duì)臨床中發(fā)現(xiàn)的疑似耐藥脊柱結(jié)核患者特征進(jìn)行深入分析，從而不能很好評(píng)判分子生物學(xué)技術(shù)與表型藥敏試驗(yàn)在疑似耐藥患者中確定診斷耐藥的效能。

綜上所述，脊柱結(jié)核病灶標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)敏感度低，耐藥結(jié)核分枝桿菌通過表型藥敏試驗(yàn)檢出率偏低，二者總耗費(fèi)時(shí)間超過1個(gè)月，不能及早發(fā)現(xiàn)耐藥患者。通過GeneXpert方法可盡早發(fā)現(xiàn)更多耐藥患者。