蔣煊，朱群燕，徐福遠(yuǎn)，蔣必穎，王敏秀，趙應(yīng)征，吳嵐嵐，傅紅興，李校堃

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.義烏市中醫(yī)院 藥劑科，浙江 金華 322000）

胰島移植已在臨床糖尿病治療中顯示了良好的治療效果，但其結(jié)果受多個(gè)因素影響。移植部位缺氧和誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致移植早期胰島的顯著損失，受體中移植胰島的血管再生決定了胰島的存活和功能[1-3]。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）有利于促進(jìn)胰島移植后的血管生成和傷口愈合。但由于bFGF半衰期短，易受環(huán)境變化（溫度、pH等）的影響，限制了其臨床應(yīng)用[4-7]。

細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)近年來(lái)在科研和臨床領(lǐng)域發(fā)展迅速，其中以腺病毒為載體可提高基因傳遞效率，易感染受體并高水平的表達(dá)目的基因[8]。本研究中我們采用腺病毒作為載體，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期胰島分離和移植的工作基礎(chǔ)[9-10]，將rhbFGF-flag-GFP基因轉(zhuǎn)染到胰島中，并通過(guò)腎被膜下移植觀察移植物微血管重建和糖尿病治療療情況。期望獲得移植物快速微血管重建的方法，為轉(zhuǎn)基因胰島的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性Balb/c小鼠100只（SPF級(jí)），8～10周齡，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 試劑和器材：rhbFGF-flag-GFP腺病毒（上海漢恒生物科技有限公司）；膠原酶V、鏈脲佐菌素（STZ）、二乙酸熒光素（FD）、碘化吡啶（PI）、胎牛血清（Sigma公司，美國(guó)）；異氟烷（Baxter公司，美國(guó)）；CMRL 1066、Ficoll-1077、Ficoll-1119、Hanks（溫州市怡康細(xì)胞移植技術(shù)開發(fā)有限公司）；DKZ-450B電熱恒溫振蕩水槽（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；離心機(jī)ST 8R、二氧化碳培養(yǎng)箱3111（賽默飛世爾科技有限公司）；NIKON YS100顯微鏡（南京江南永新光學(xué)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 糖尿病模型建立：造模前Balb/c小鼠禁食12～16 h，稱重并測(cè)定空腹血糖，腹腔注射2% STZ（200 mg/kg），72 h后測(cè)血糖≥11.0 mmol/L為糖尿病造模成功，模型穩(wěn)定一周后選取血糖20～30 mmol/L的小鼠進(jìn)行腎被膜下胰島移植。

1.2.2 胰島分離純化：參考前期工作基礎(chǔ)[9-10]，簡(jiǎn)述如下：取Balb/c小鼠，頸椎脫臼法處死，U型切口剪開腹部肌肉層；夾閉膽總管入十二指腸口；逆行膽總管灌注V型膠原酶溶液2.5 mL，膨脹的胰腺放入含2 mL同濃度V型膠原酶的50 mL離心管中，在（37.0±0.5）℃恒溫水浴中振搖消化呈乳糜狀，用Ficoll-1077、Ficoll-1119進(jìn)行密度梯度純化，得到高純度的小鼠胰島，用CMRL 1066（含10%胎牛血清和青鏈霉素）在37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 胰島活性測(cè)定[11]：取胰島細(xì)胞團(tuán)約60個(gè)，先后加入PI、FD各8 μL，避光混勻后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況，顯示綠色為活細(xì)胞，紅色為死亡細(xì)胞，估算整個(gè)胰島團(tuán)中綠色面積占組織總面積的比例，取全部細(xì)胞團(tuán)的平均值即為胰島活性。

1.2.4 胰島腺病毒感染[12]：將胰島置于12孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)6 h后，分別以感染復(fù)數(shù)（MOI）為50、100、300和1000的腺病毒滴度進(jìn)行胰島體外感染，感染后將胰島分散于含2 mL CMRL1066完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，37 ℃培養(yǎng)12 h；用完全培養(yǎng)基洗滌胰島3次，1000 rpm離心除去游離病毒，加入2 mL完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6 h；通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)胰島活性；并取活性最佳組胰島進(jìn)行腎被膜下移植。

1.2.5 腎被膜下胰島移植：將胰島隨機(jī)分成兩組，分別為感染rhbFGF-flag-GFP腺病毒組和感染GFP腺病毒組。移植前參考Lembert等[13]制定的方法計(jì)算移植所需胰島當(dāng)量。移植手術(shù)參考文獻(xiàn)[14]，簡(jiǎn)述如下：用異氟烷麻醉Balb/c糖尿病鼠，脫毛并用酒精消毒手術(shù)區(qū)域，用眼科剪在皮膚和肌肉上開1 cm小口暴露右腎。用針在腎被膜上刺個(gè)小口，并使用自制的移植工具將胰島移植到腎背膜下?？p合切口并用聚維酮碘消毒，皮下注射1 mL生理鹽水補(bǔ)液。

1.2.6 術(shù)后護(hù)理及血糖監(jiān)測(cè)：術(shù)后小鼠每24 h皮下注射100 μL頭孢唑啉鈉預(yù)防感染，持續(xù)一周，術(shù)后7 d內(nèi)每24 h測(cè)定血糖，之后每3天測(cè)定一次血糖，持續(xù)一個(gè)月，連續(xù)兩次測(cè)定血糖值超過(guò)16.7 mmol/L則宣告移植物失效。

1.2.7 口服糖耐量試驗(yàn)（OGTT）：胰島移植第14日，取5只小鼠各測(cè)一次OGTT。參考文獻(xiàn)[15]，小鼠禁食12 h后，將葡萄糖溶于雙蒸水（濃度為300 mg/mL）后給其灌胃，每克小鼠劑量為2.0 mg，于灌胃后20、40、60、90、120 min測(cè)定血糖值，以正常鼠和糖尿病鼠相同測(cè)定方法作對(duì)照，對(duì)比各時(shí)間點(diǎn)血糖峰值，評(píng)價(jià)移植后胰島功能和移植效果。

1.2.8 腎被膜下胰島組織學(xué)評(píng)價(jià)：取胰島移植后第14天的小鼠，持續(xù)異氟烷吸入麻醉下剪開腹部皮膚和肌肉層，破心處死，取含胰島的腎臟組織并用4%多聚甲醛液固定至少24 h，經(jīng)脫水、包埋、切片、染色，顯微鏡下觀察含胰島腎組織的HE和免疫組化染色結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 純化后胰島純度和活性

8只Balb/c小鼠一次純化可得到（1365±324）個(gè)胰島；胰島形態(tài)圓整，經(jīng)DTZ染色后，純度達(dá)（95.33±2.62）%。培養(yǎng)后的胰島經(jīng)FD-PI染色后，可見胰島大部分體積呈綠色，活性達(dá)（85.31±2.90）%。

2.2 腺病毒感染后胰島活性

胰島在不同MOI的rhbFGF- flag-GFP腺病毒感染后，經(jīng)體外培養(yǎng)12、36 h和60 h后的活性結(jié)果如圖1和表1所示。在培養(yǎng)12 h時(shí)，未感染腺病毒基因的胰島活性明顯高于感染的胰島（P＜0.01），說(shuō)明腺病毒感染在早期對(duì)于胰島活性有損害；經(jīng)繼續(xù)培養(yǎng)至60 h后，胰島經(jīng)100 MOI腺病毒感染組的活性有所恢復(fù)，與未感染組胰島無(wú)明顯差異（P=0.75），因此選擇該滴度作為胰島感染和移植所需的腺病毒滴度。

圖1 胰島經(jīng)腺病毒感染并培養(yǎng)不同時(shí)間后的活性結(jié)果（FD-PI染色，×40）。注：活細(xì)胞經(jīng)FD染色顯綠色熒光，死細(xì)胞經(jīng)PI染色顯紅色熒光

表1 腺病毒感染后胰島活性結(jié)果（%）

2.3 胰島移植后血糖變化

各組小鼠胰島移植后血糖持續(xù)30 d的變化結(jié)果如圖2所示。單獨(dú)移植400 IEQ以及感染rhbFGF- flag-GFP腺病毒的200 IEQ胰島移植后糖尿病小鼠血糖在24 h內(nèi)降至正常，移植后小鼠血糖控制穩(wěn)定，并可長(zhǎng)時(shí)間維持血糖在正常水平（＞30 d）。單獨(dú)200 IEQ以及感染單純GFP腺病毒的胰島移植后，部分小鼠的血糖在48 h內(nèi)有所下降，但并未降至正常，且血糖值波動(dòng)明顯，這說(shuō)明200 IEQ感染rhbFGF-flag-GFP腺病毒胰島的腎被膜下移植能夠有效控制血糖并減少移植所需胰島用量。

2.4 糖耐量試驗(yàn)結(jié)果

各移植組小鼠在移植后14 d分別測(cè)定糖耐量試驗(yàn)（OGTT），結(jié)果如圖3所示。200 IEQ感染rhbFGF-flag-GFP腺病毒的胰島移植后，小鼠在葡萄糖灌胃后血糖變化結(jié)果明顯好于糖尿病小鼠和單獨(dú)200 IEQ胰島移植后小鼠（P＜0.01），而與正常小鼠和單獨(dú)400 IEQ胰島移植后的血糖值變化無(wú)明顯差異（P=0.63），說(shuō)明200 IEQ感染rhbFGF-flag-GFP腺病毒胰島移植后胰島功能良好，能控制血糖至正常值范圍。

2.5 腎被膜下胰島組織染色結(jié)果

腎被膜下胰島HE和免疫組化染色結(jié)果，如圖4所示。移植后第14日胰島在腎被膜下保持了良好的細(xì)胞形態(tài)；200 IEQ感染rhbFGF- flag-GFP基因組和單獨(dú)400 IEQ胰島移植組的胰島素分泌較單獨(dú)200 IEQ更旺盛；200 IEQ感染rhbFGF-flag-GFP基因組的CD 31表達(dá)，較單獨(dú)400 IEQ移植組和200 IEQ移植組多，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因組微血管增生更多。

圖2 各組小鼠經(jīng)腎被膜下胰島移植后血糖連續(xù)30 d的變化結(jié)果

圖3 各移植組小鼠在移植后第14天的OGTT結(jié)果

圖4 腎被膜下移植胰島移植后第14天的HE和免疫組化結(jié)果（×100）

3 討論

胰島在分離和純化過(guò)程中破壞了原有的血管連接，胰島移植后的微血管重建緩慢[16-17]，導(dǎo)致胰島活力和功能降低。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，bFGF與胰島共培養(yǎng)后能夠增強(qiáng)其活性并有一定的抗凋亡作用，且可促血管再生[18]。為了促進(jìn)胰島移植后的微血管重建和增強(qiáng)胰島功能，在本研究中我們探討了感染rhbFGF基因的胰島的腎被膜下再移植。結(jié)果表明，感染100 MOI rhbFGF-flag-GFP腺病毒的胰島經(jīng)腎被膜下移植后，使用半量胰島也能取得很好的降血糖結(jié)果，且胰島功能良好；CD31染色也顯示移植物在移植部位的微血管重建明顯增加。此說(shuō)明感染rhbFGF-flag-GFP基因的胰島移植后，微血管重建和胰島功能均有改善。本研究提供了一種促進(jìn)胰島移植后微血管重建的思路，為臨床上提高胰島移植成功率提供參考。